一種分解玉米赤霉烯酮和木聚糖的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種分解玉米赤霉烯酮和木聚糖的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用。本發(fā)明所述菌株的保藏號(hào)為CCTCC?NO:M2013406，該菌株16s?rDNA的Genbank登錄號(hào)為KF512668。應(yīng)用時(shí)，將菌株制備成能對(duì)降解玉米赤霉烯酮毒素和木聚糖的液體菌劑或固體菌劑，用于降解飼料產(chǎn)品或谷物中的玉米赤霉烯酮毒素和木聚糖。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：可將該菌作為腸道益生菌，同時(shí)利用該菌降解玉米赤霉烯酮毒素，安全、益生，并可專(zhuān)一、高效地降解飼料產(chǎn)品和農(nóng)產(chǎn)品污染的玉米赤霉烯酮毒素。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種分解玉米赤霉烯酮和木聚糖的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種分解玉米赤霉烯酮毒素和木聚糖的菌種，尤其是一種分解玉米赤霉烯酮和木聚糖的枯草芽孢桿菌，以及該菌在飼料產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN),又稱(chēng)F-2毒素,是一種酹的二羥基苯酸的內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，有較強(qiáng)的雌激素活性。該毒素?zé)岱€(wěn)定，并不因長(zhǎng)期儲(chǔ)存、烘烤或丙酸或霉菌生長(zhǎng)抑制劑的加入而受到破壞。
[0003]玉米赤霉烯酮在人和動(dòng)物體內(nèi)積累可誘發(fā)一系列雌激素效應(yīng)癥狀，包括影響雌性哺乳動(dòng)物乳房發(fā)育、外陰陰道炎、發(fā)情周期紊亂、假孕不孕、流產(chǎn)、死胎畸胎等，此外有研究證實(shí)，玉米赤霉烯酮還有遺傳毒性，細(xì)胞毒性，免疫毒性，致腫瘤毒性。
[0004]玉米赤霉烯酮存在于世界范圍的多種谷物作物中，如:玉米、大麥、燕麥、小麥、稻、和高粱。在收獲前玉米赤霉烯酮的產(chǎn)生通常沒(méi)有顯著的量的發(fā)生，但在合適的環(huán)境條件下，易在儲(chǔ)減中的玉米和小谷粒上廣生。
[0005]在乙醇生產(chǎn)中使用谷物顆粒并消耗淀粉時(shí)，玉米赤霉烯酮集中在發(fā)酵副產(chǎn)品(如:蒸餾干酒糟)中。發(fā)酵副產(chǎn)品中的玉米赤霉烯酮含量相對(duì)于谷物顆?？赡苓€會(huì)增加。
[0006]木聚糖是半纖維素中含量最豐富的組分之一，在植物細(xì)胞壁中的含量?jī)H次于纖維素，約占細(xì)胞干重的35%。木聚糖屬雜合多聚分子，由于組成木聚糖的單糖單元有差異、鍵的類(lèi)型也不同、以及木聚糖中還存在有許多不同取代基的支鏈，故木聚糖的徹底降解需要多種酶的參與。木聚糖降解時(shí)，起主要作用的酶是:(1)內(nèi)切β-1，4-木聚糖酶:降解木聚糖的最主要酶(以下簡(jiǎn)稱(chēng)木聚糖酶)。(2) β-木糖苷酶:該酶通過(guò)水解低聚木糖的末端來(lái)催化釋放木糖殘基。另外，還有β-1，4-外切木聚糖酶、α-呋喃型阿拉伯糖苷酶、α-葡萄糖醛酸苷酶、乙酸木聚糖酯酶及能降解木聚糖上由阿拉伯糖側(cè)鏈殘基與酚酸所形成的酯鍵的酚酸酯酶等。木聚糖雖廣泛存在于如玉米、麥麩、米糠等之中，絕大多數(shù)的單胃動(dòng)物消化道內(nèi)缺乏分解木聚糖的酶，需要在飼料添加木聚糖酶，或者通過(guò)腸道益生菌的產(chǎn)生獲得但一直難以得到有效的利用。
[0007]在CN102010838A (采用蠟樣芽孢桿菌E33L)、CN102559555A (采用不動(dòng)桿菌Acinetobacter sp.SM04)、CN102796694A (導(dǎo)入了脫氧雪腐鐮刀烯醇和玉米赤霉烯酮兩種降解酶編碼基因的工程菌)中分別公開(kāi)了采用不同的微生物來(lái)分解玉米赤霉烯酮，但是它們所使用的微生物均為目前未被列入可用于飼料添加使用的安全微生物。
[0008]在CN102406098A中公開(kāi)了使用黑曲霉發(fā)酵液干粉分解玉米赤霉烯酮的應(yīng)用。在CN102181376A中公開(kāi)了使用同時(shí)能分解玉米赤酶烯酮和纖維素的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) ANSB0IG分解玉米赤霉烯酮的應(yīng)用。
[0009]因此，仍有必要尋找可用于飼料產(chǎn)品添加的分解真菌毒素玉米赤霉烯酮的新的微生物，并將其應(yīng)用于受玉米赤霉烯酮毒素污染的動(dòng)物飼料產(chǎn)品中分解毒素。而且，目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)能同時(shí)具有降解玉米赤霉·烯酮和木聚糖功能的枯草桿菌的相關(guān)報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種分解真菌毒素玉米赤霉烯酮和木聚糖的枯草芽孢桿菌(Bacillus subti I is)，從而解決飼料中殘留玉米赤霉烯酮毒素的問(wèn)題，同時(shí)有利于動(dòng)物充分消化飼料中的木聚糖。
[0011]本發(fā)明所述的一種能分解玉米赤霉烯酮和木聚糖的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，其菌株的保藏號(hào)為 CCTCC N0:M2013406，分類(lèi)命名為 Bacillus subtilisBFB8633;保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址是中國(guó)湖北省武漢市武漢大學(xué)；保藏日期為2013年9月10日。所述菌株能在營(yíng)養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，菌落呈枯草狀，圓形或不規(guī)則，濁白色，扁平，有褶皺，邊緣不完整，菌體為短棒狀，大小為0.7~
0.9 u mX 2.0 ~ 3.0 u m,革蘭氏陽(yáng)性；芽孢大小為0.5 u mX 1.0 ~ 1.5 u m,橢圓形或柱狀，中生或次端生，孢囊不明顯膨大；所述菌株能利用的碳源有:D-葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、淀粉、檸檬酸鹽、木聚糖、纖維素、七葉苷、(6-葡萄糖苷、山梨醇、肌醇、乳糖、(6-甘露聚糖、糊精、蔗糖，不能利用的碳源有:甘油。
[0012]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供所述的枯草芽孢桿菌的用途，具體是用于制備分解玉米赤霉烯酮和木聚糖的菌劑的應(yīng)用。
[0013]根據(jù)本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用的進(jìn)一步特征，所述的菌劑為液體菌劑，通過(guò)以下方法制備:
[0014]a)將所述枯草芽孢桿菌的菌株于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得菌種；
[0015]b)將上述種子液接種入含有種子培養(yǎng)基的種子罐，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，獲得種子液；
[0016]c)將獲得的種子液接種入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的生產(chǎn)發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)，出罐形成能分解玉米赤霉烯酮的液體菌劑。
[0017]根據(jù)本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用的進(jìn)一步特征，所述的種子培養(yǎng)基為由下列組分組成:蛋白胨10.0g/L，牛肉浸取物3.0g/L, NaC15.0g/L, pH7.0~7.2。
[0018]根據(jù)本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用的進(jìn)一步特征，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為由以下組分組成:淀粉 1.5g/L、葡萄糖 5g/L、酵母膏 0.2g/L、尿素 lg/L、K2HP043g/L、KH2P04l.5g/UMgSO40.5g/L、FeCl30.lg/L、CaCO30.1 g/L、MnSO41 g/L，pH7.0 ~7.2。
[0019]根據(jù)本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用的進(jìn)一步特征，所述的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基需要121°C高溫濕熱滅菌后冷卻至30~35°C使用。
[0020]根據(jù)本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用的進(jìn)一步特征，所述的菌種按種子罐種種子培養(yǎng)基的3 — 10%接種量種入種子罐,優(yōu)選5%接種量,更優(yōu)選10%的接種量。
[0021]根據(jù)本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用的進(jìn)一步特征，所述的種子液按生產(chǎn)罐種發(fā)酵培養(yǎng)基的3 - 10%接種量接種入生產(chǎn)罐，優(yōu)選5%接種量，更優(yōu)選10%的接種量。
[0022]根據(jù)本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用的進(jìn)一步特征，在種子罐的種子培養(yǎng)和生產(chǎn)罐的發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程種無(wú)菌空氣的同期量為1:0.5~1.5，攪拌速度為100~250轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)時(shí)間為24~60小時(shí)，培養(yǎng)溫度為25~35°C，優(yōu)選為28~32°C。
[0023]根據(jù)本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用的進(jìn)一步特征，發(fā)酵結(jié)束后獲得液體菌劑中，菌體數(shù)量≥1O 9個(gè)/ml，優(yōu)選≥1O 12個(gè)/ml，或者更優(yōu)選≥1O 15個(gè)/ml。[0024]根據(jù)本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用的進(jìn)一步特征，將所述的枯草芽孢桿菌液體菌劑稀釋之后噴施到飼料產(chǎn)品中以降解飼料產(chǎn)品中的玉米赤霉烯酮毒素；稀釋后的液體菌劑中菌體數(shù)量至少達(dá)到IO6個(gè)/ml。
[0025]根據(jù)本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用的進(jìn)一步特征，所述的枯草芽孢桿菌液與糠麩或黏土吸附劑按Iml:1 — 20g的比例吸附，優(yōu)選Iml:5 — IOg的比例吸附，形成固體菌劑，其中菌體數(shù)量> IO8個(gè)/g，優(yōu)選> 101°個(gè)/g，或者更優(yōu)選> IO15個(gè)/g。
[0026]根據(jù)本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用的進(jìn)一步特征，所述的枯草芽孢桿菌固體菌劑的劑量是0.5g菌劑/kg飼料,優(yōu)選Ig菌劑/kg飼料,或更優(yōu)選2g菌劑/kg飼料。
[0027]根據(jù)本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用的進(jìn)一步特征，所述飼料是選自以下谷物的飼料產(chǎn)品:玉米、小麥、大麥、稻谷、高粱、或蒸餾干酒糟。
[0028]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌具有抗逆性強(qiáng)、耐高溫、對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、易貯存等獨(dú)特的特性，該菌可作為腸道益生菌使用，充分降解飼料中所含有的木聚糖，提高了動(dòng)物對(duì)飼料的利用率，同時(shí)可降解玉米赤霉烯酮毒素，安全、益生，并可專(zhuān)一、高效地降解飼料產(chǎn)品污染的玉米赤霉烯酮毒素。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0029]圖1是本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌的液體菌劑對(duì)玉米赤霉烯酮毒素的降解效果。
[0030]圖2是本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌的液體菌劑對(duì)木聚糖的分解效果。 【具體實(shí)施方式】
[0031 ] 以下對(duì)本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)所涉及的名詞做出說(shuō)明。
[0032]玉米赤霉烯酮
[0033]術(shù)語(yǔ)“玉米赤霉烯酮”包括自某些鐮孢屬菌種(Fusarium sp.)產(chǎn)生的真菌毒素玉米赤霉烯酮。IUPAC名稱(chēng)為(4S，12E)- 15，17 一二羥基一 4 一甲基一 3 —氧雜二環(huán)[12.4.0]十八碳一12,15,17,19 —四烯一2,8 —二酮((4S, 12E) -15, 17-Dihydroxy-4-methyl-3-oxabicyclo[12.4.0]octadeca-12, 15, 17, 19-tetraene~2, 8_d ione)。術(shù)語(yǔ)“玉米赤霉烯酮”還包括任何玉米赤霉烯酮的衍生物。
[0034]動(dòng)物飼料產(chǎn)品
[0035]術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”包括所有動(dòng)物，包括人。動(dòng)物的實(shí)例是牛，包括但不限于乳牛/母牛和牛犢；單胃動(dòng)物，例如豬，包括但不限于小豬、飼育豬和母豬；家禽如火雞和雞，包括但不限于雛雞、蛋雞；和魚(yú)，包括但不限于鮭魚(yú)。
[0036]術(shù)語(yǔ)“飼料產(chǎn)品”可以是與不想要的水平的玉米赤霉烯酮分離的產(chǎn)品，其適合于由動(dòng)物食用。所述飼料產(chǎn)品也可以是疑似包含不想要的水平的玉米赤霉烯酮的產(chǎn)品，和/或玉米赤霉烯酮水平未知的產(chǎn)品，包括不包含科檢測(cè)水平的玉米赤霉烯酮的產(chǎn)品。
[0037]所述飼料產(chǎn)品優(yōu)選是基于谷粒的產(chǎn)品優(yōu)選包含谷物，例如，玉米、小麥、大麥、稻、高粱中的一種或多種。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述飼料產(chǎn)物可以例如僅源自一種或多種谷物，而在另一個(gè)實(shí)施方案中部分源自豆類(lèi)(例如源自大豆)且部分源自谷物。所述基于谷粒的產(chǎn)品可以包含完整的或研磨的谷粒，例如，濕磨或干磨的谷粒，包括包含濕磨或干磨谷粒的級(jí)分的基于谷粒的產(chǎn)品，所述級(jí)分例如，谷蛋白、蛋白質(zhì)、淀粉和/或油級(jí)分。還優(yōu)選包含來(lái)自釀造和/或發(fā)酵過(guò)程的副產(chǎn)品(例如，酒糟)的產(chǎn)品。酒糟是來(lái)自酒精飲料和乙醇燃料生產(chǎn)的副產(chǎn)品。啤酒酒糟是釀酒廠中啤酒釀造的殘余物，這種釀酒廠使用發(fā)芽大麥作為主要原料。蒸餾酒糟是在從發(fā)酵的谷粒如:玉米、小麥、大麥、稻和黑麥通過(guò)蒸餾去除醇之后在蒸餾室中剩余的產(chǎn)品。蒸餾酒糟也稱(chēng)作酒糟。將濕酒糟干燥生產(chǎn)酒糟，其主要用作動(dòng)物飼料。
[0038]枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)
[0039]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“枯草芽孢桿菌”屬于枯草芽孢桿菌屬的對(duì)玉米赤霉烯酮和木聚糖有分解作用的菌株。
[0040]實(shí)施例1:本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的菌株
[0041]材料:廣東廣州采集的發(fā)酵食品材料霉豆
[0042]稱(chēng)取IOg實(shí)驗(yàn)材料經(jīng)研碎、加水振蕩制成樣品懸液，梯度稀釋得到樣品液。取三個(gè)濃度梯度樣品液各ImL分別加入營(yíng)養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基中(含泛酰內(nèi)酯50mg/L)，凝固后置于30°C恒溫箱中倒置培養(yǎng)24h。第一次培養(yǎng)結(jié)束后，挑取生長(zhǎng)良好的典型單菌落，在相同條件下，劃線分離獲得純培養(yǎng)，進(jìn)行分類(lèi)編號(hào)，試管斜面保種-1o°c保存。另外，加大培養(yǎng)基中泛酰內(nèi)酯濃度到10g/L進(jìn)行第二輪的液體培養(yǎng)富集。對(duì)照組:將菌株接種至不含泛酰內(nèi)酯的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件:30°C，180r/min，24h ;能夠生長(zhǎng)的菌株繼續(xù)進(jìn)行下面的壓力培養(yǎng)。
[0043]按1:100接種量向營(yíng)養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基(含ZEN濃度為10 μ g/mL)接種，30°C，180r/min,培養(yǎng)24h ;培養(yǎng)結(jié)束后，取菌懸液ImL制備TLC檢測(cè)樣品，對(duì)培養(yǎng)液中ZEN殘留進(jìn)行TLC檢測(cè)。選擇檢測(cè)液10 μ L點(diǎn)樣量熒光點(diǎn)完全消失所對(duì)應(yīng)的菌株，在ZEN濃度為20 μ g/mL的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取生長(zhǎng)良好的菌懸液ImL制備TLC檢測(cè)樣品，觀察樣品的熒光亮度確定各個(gè)菌株對(duì)玉米赤霉烯酮分解能力的相對(duì)大小，確認(rèn)具有分解ZEN的菌株，確定名稱(chēng)為BFB8633。
[0044]TLC檢測(cè)參照AOAC Official Method976.22:菌懸液經(jīng)氯仿萃取三次，無(wú)水Na2SO4脫水，獲得含殘留ZEN的TL`C檢測(cè)樣品，在經(jīng)活化的硅膠板上點(diǎn)樣，經(jīng)展開(kāi)劑(VCHC13: VCH30H=95:5)展開(kāi)，干燥，在365nm紫外光下，觀察黃綠色熒光變化。檢測(cè)樣品的點(diǎn)樣分別為10 μ L，15 μ L，20 μ L3個(gè)梯度。
[0045]菌株的鑒定
[0046]克隆枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis) BFB8633的16s rDNA序列并對(duì)該16srDNA序列進(jìn)行測(cè)序，把測(cè)序結(jié)果在Genbank進(jìn)行BLAST比對(duì)分析序列同源性，確定了枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) BFB8633的系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)地位。通過(guò)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BFB8633的形態(tài)生物學(xué)鑒定結(jié)果、生理生化特征結(jié)果和系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)地位鑒定結(jié)果，最終把枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) BFB8633鑒定為枯草芽孢桿菌屬(Bacillus subtilis)細(xì)菌。菌種BFB8633的16s rDNA序已經(jīng)登錄到Genbank,登錄號(hào)為KF512668。
[0047]將該枯草芽孢桿菌的菌株BFB8633送交中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)進(jìn)行保藏，地址是中國(guó)湖北省武漢市武漢大學(xué)，保藏號(hào)為CCTCC N0:M2013406，分類(lèi)命名:Bacillussubtilis BFB8633，保藏日期為2013年9月10日。
[0048]為簡(jiǎn)化說(shuō)明，在下文中，將本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌的菌株用BFB8633表示。
[0049]實(shí)施例2:液體菌劑的制備[0050]種子培養(yǎng)基:蛋白胨10.0g/L，牛肉浸取物3.0g/L, NaC15.0g/L, pH7.0~7.2。
[0051]發(fā)酵培養(yǎng)基:淀粉1.5g/L、葡萄糖5g/L、酵母膏0.2g/L、尿素lg/L、K2HP043g/L、KH2PO4L 5g/L、MgSO40.5g/L、FeCl30.lg/L、CaCO30.lg/L、MnSO4lg/L，pH7.0 ~7.2。
[0052]將BFB8633種接種于含200ml種子培養(yǎng)基的1000ml搖瓶中，30°C振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，獲得菌種。
[0053]將上述培養(yǎng)好的菌種按10%接種量接種入200L種子罐中(含種子培養(yǎng)基160L，121°C高壓濕熱滅菌，冷卻至30°C)進(jìn)行培養(yǎng)，獲得種子液。培養(yǎng)條件:攪拌速度180~230轉(zhuǎn)/分，無(wú)菌空氣通入量1:0.8，培養(yǎng)6~8小時(shí)。
[0054]將上述種子液按10%接種量接種入2000L生產(chǎn)罐(含發(fā)酵培養(yǎng)基1600L，121°C高壓濕熱滅菌，冷卻至35°C以下)進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，獲得BFB8633菌液。發(fā)酵條件:攪拌速度150~200轉(zhuǎn)/分，無(wú)菌空氣通入量1:0.8~1.0，培養(yǎng)16~45小時(shí)。
[0055]實(shí)施例3:固體菌劑的制備例一
[0056]將實(shí)施例2生產(chǎn)出來(lái)的BFB8633菌液和糠麩(從商業(yè)途徑購(gòu)買(mǎi))按照1:5 (體積:重量)的比例混合制成BFB8633固體菌劑。[0057]實(shí)施例4:固體菌劑的制備例二
[0058]將實(shí)施例2生產(chǎn)出來(lái)的BFB8633菌液和粘土 (從商業(yè)途徑購(gòu)買(mǎi))按照1:5 (體積:重量)的比例混合制成BFB8633固體菌劑。
[0059]實(shí)施例5:液體菌劑對(duì)玉米赤霉烯酮毒素的降解實(shí)驗(yàn)
[0060]按1:100接種量向營(yíng)養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基(含ZEN濃度為2011§/1^)接種，301:，18017/min,培養(yǎng)24h ;培養(yǎng)結(jié)束后，取菌懸液5mL進(jìn)行層析分析。層析分析:參照AOAC OfficialMethod976.22:菌懸液經(jīng)氯仿萃取三次，無(wú)水Na2SO4脫水，獲得含殘留ZEN的檢測(cè)樣品，取ImL檢測(cè)樣品揮干，加入ImL甲醇(色譜純)振蕩，0.45 y m濾膜過(guò)濾，得到待測(cè)樣品，用HPLC定量檢測(cè)殘留ZEN。色譜條件:C0SM0SIL5C18-MS II型色譜柱，流動(dòng)相:甲醇-水=65:35(v/v),流速:lmL/min,柱溫:30°C, RF-10AXL 突光檢測(cè)器:\ ex=274nm, A em=440nm。結(jié)果見(jiàn)圖1，本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌制備的液體菌劑對(duì)于玉米赤霉烯酮毒素具有較強(qiáng)的降解效果。
[0061]實(shí)施例6:液體菌劑對(duì)木聚糖的分解實(shí)驗(yàn)
[0062]接種BFB8633菌懸液Iul于LB固體培養(yǎng)基(含1%的木聚糖)上，待吸收完全，37°C，倒置培養(yǎng)48h ;培養(yǎng)結(jié)束后，在長(zhǎng)出菌落的培養(yǎng)基上，用lg/L剛果紅溶液染色30min，倒掉剛果紅溶液，用lmol/LNaCl溶液脫色15min，即可見(jiàn)菌落周?chē)纸饽揪厶呛蟪霈F(xiàn)的透明圈。可見(jiàn)，本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌制備的液體菌劑對(duì)于木聚糖具有較強(qiáng)的降解效果。
[0063]實(shí)施例7:固體菌劑對(duì)飼料中玉米赤霉烯酮毒素的降解實(shí)驗(yàn)
[0064]BFB8633固體菌劑按Ig固體菌劑/kg干物質(zhì)的劑量與想處理的已經(jīng)被玉米赤霉烯酮污染的飼料混勻，再按1:1重量比噴灑入水，在30°C處理4小時(shí)后，稱(chēng)取5g進(jìn)行層析分析。對(duì)照組用等量的菌劑輔料替代。層析分析:參照AOAC Official方法976.22:處理物經(jīng)氯仿萃取三次，無(wú)水Na2SO4脫水，獲得含殘留ZEN的檢測(cè)樣品，取ImL檢測(cè)樣品揮干，加入ImL甲醇(色譜純)振蕩，0.45um濾膜過(guò)濾，得到待測(cè)樣品，用HPLC定量檢測(cè)殘留ZEN。色譜條件:C0SM0SIL5C18-MS II型色譜柱，流動(dòng)相:甲醇-水=65:35(v/v)，流速:lmL/min，柱溫:30°C, RF-10AXL突光檢測(cè)器:入ex=274nm, A em=440nm。相對(duì)于對(duì)照計(jì)算殘余的玉米赤霉烯酮。結(jié)果見(jiàn)表1，BFB8633固體菌劑能很好降解飼料中的玉米赤霉烯酮，降解效率可達(dá)到 62%。
[0065]表1
[0066]
【權(quán)利要求】
1.一種分解玉米赤霉烯酮和木聚糖的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),其特征在于:所述枯草芽孢桿菌的菌株的保藏號(hào)為CCTCC N0:M2013406 ； 所述菌株能在營(yíng)養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，菌落呈枯草狀，圓形或不規(guī)則，濁白色，扁平，有褶皺，邊緣不完整，菌體為短棒狀，大小為0.7~0.9 μ mX 2.0~3.0 μ m，革蘭氏陽(yáng)性；芽孢大小為0.5 μ mX 1.0~1.5 μ m，橢圓形或柱狀，中生或次端生，孢囊不明顯膨大； 所述菌株能利用的碳源有:D-葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、淀粉、檸檬酸鹽、木聚糖、纖維素、七葉苷、β_葡萄糖苷、山梨醇、肌醇、乳糖、β_甘露聚糖、糊精、鹿糖，不能利用的碳源有:甘油。 所述菌株的16S rDNA全基因序列的Genbank登錄號(hào)為KF512668。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌用于制備分解玉米赤霉烯酮和木聚糖的菌劑的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于:所述的菌劑為液體菌劑，通過(guò)以下方法制備: a)將所述枯草芽孢桿菌的菌株于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得菌種； b)將上述種子液接種入含有種子培養(yǎng)基的種子罐，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，獲得種子液； c)將獲得的種子液接種入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的生產(chǎn)發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng),出罐形成能分解玉米赤霉烯酮的液體菌劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于: 所述的種子培養(yǎng)基為由下列組分組成:蛋白胨10.0g/L，牛肉浸取物3.0g/L,NaC15.0g/L, ρΗ7.0 ~7.2 ; 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為由以下組分組成:淀粉1.5g/L、葡萄糖5g/L、酵母膏0.2g/L、尿素 I g/L, K2HP043g/L、KH2PO4L 5g/L、MgSO40.5g/L、FeCl30.1 g/L, CaCO30.1 g/L, MnSO41 g/L,pH7.0 ~7.2。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于:所述的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基需要121°C高溫濕熱滅菌后冷卻至30~35°C使用；所述的菌種按種子罐種種子培養(yǎng)基的3 - 10%接種量種入種子罐，優(yōu)選5%接種量，更優(yōu)選10%的接種量；所述的種子液按生產(chǎn)罐種發(fā)酵培養(yǎng)基的3 — 10%接種量接種入生產(chǎn)罐，優(yōu)選5%接種量，更優(yōu)選10%的接種量。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于:在種子罐的種子培養(yǎng)和生產(chǎn)罐的發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程種無(wú)菌空氣的同期量為1:0.5-1.5，攪拌速度為100~250轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)時(shí)間為24~60小時(shí)，培養(yǎng)溫度為25~35°C，優(yōu)選為28~32°C，發(fā)酵結(jié)束后獲得液體菌劑，其中菌體數(shù)量≥IO9個(gè)/ml，優(yōu)選≥IO12個(gè)/ml，或者更優(yōu)選≥IO15個(gè)/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于:將所述的枯草芽孢桿菌液體菌劑稀釋之后噴施到飼料產(chǎn)品中以降解飼料產(chǎn)品中的玉米赤霉烯酮毒素；稀釋后的液體菌劑中菌體數(shù)量至少達(dá)到IO6個(gè)/ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于:所述的枯草芽孢桿菌液與糠麩或黏土吸附劑按Iml:1 — 20g的比例吸附，優(yōu)選Iml:5 — IOg的比例吸附，形成固體菌劑，其中菌體數(shù)量> IO8個(gè)/g，優(yōu)選> IOltl個(gè)/g，或者更優(yōu)選> IO15個(gè)/g。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于:所述的枯草芽孢桿菌固體菌劑的劑量是0.5g菌劑/kg飼料,優(yōu)選Ig菌劑/kg飼料,或更優(yōu)選2g菌劑/kg飼料。
10.權(quán)利要求7或9所述的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于:所述飼料是選自以下谷物的飼料產(chǎn)品:玉米、小麥、大麥 、稻谷、高粱、或蒸餾干酒糟。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK103667103SQ201310463812
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年10月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月8日
【發(fā)明者】劉大嶺, 姚冬生, 冼鈺茵, 孫志軒, 謝春芳, 梁玉強(qiáng), 梁鐘, 邵偉琪 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)