分離培養(yǎng)動(dòng)物骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種分離培養(yǎng)動(dòng)物骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。該方法包括將接種物接種于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行原代培養(yǎng)，再將原代培養(yǎng)得到的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，得到動(dòng)物間充質(zhì)干細(xì)胞；其中所述接種物為對長骨破碎液進(jìn)行離心得到的沉淀，所述長骨破碎液是將離體的動(dòng)物長骨于緩沖溶液中破碎至0.5-2立方毫米顆粒得到的混合物；所述方法不包括用膠原酶消化的步驟，所述方法不除去所述動(dòng)物長骨的骨髓。本發(fā)明充分利用了骨髓及骨片，處理簡單、短時(shí)間內(nèi)可獲得足夠數(shù)量、生長狀態(tài)良好、增殖能力強(qiáng)的間充質(zhì)干細(xì)胞，是一種方便、快捷、高效的MSC分離培養(yǎng)方法。
【專利說明】分罔培養(yǎng)動(dòng)物骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種分離培養(yǎng)動(dòng)物骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSC)是骨髓中除造血干細(xì)胞外另一重要的干細(xì)胞。MSC具有自我更新、多向分化、免疫調(diào)控和支持造血的能力，而且來源廣泛，容易在體外培養(yǎng)和擴(kuò)增，目前已經(jīng)應(yīng)用于臨床并顯示了良好的治療效果。雖然MSC臨床應(yīng)用廣泛，但許多關(guān)鍵問題如免疫調(diào)控的具體機(jī)制等并未解決。小鼠是重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，廣泛用于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。在體外成功分離培養(yǎng)MSC，并得到大量純化的MSC是研究其分化及功能調(diào)控機(jī)制的前提。MSC主要來源于骨髓，但在骨髓中，MSC的含量很少，每IO4-1O5 個(gè)單核細(xì)胞大約含 I 個(gè)MSC(Morikawa S，Mabuchi Y, Kubota Y, et al.Prospectiveidentification, isolation,and systemic transplantation of multipotentmesenchymal stem cells in murine bone marrow.J Exp Med.2009.206.2483-2496)。目前分離小鼠骨髓MSC的方法包括全骨髓貼壁法、骨片消化法、流式或磁珠分選法等。全骨髓貼壁法即根據(jù)MSC的貼壁性，定期換液除去不貼壁細(xì)胞，從而達(dá)到純化MSC的目的(SoleimanijM.，&Nadri，S.A protocol for isolation and culture of mesenchymalstem cells from mouse bone marrow.Nat.Protoc.2009.4.102-106 ；Sun S，GuoZ，Xiao X，et al.1solation of mouse marrow mesenchymal progenitors by a noveland reliable method.Stem Cells.2003.21.527-535)。然而該方法獲得的 MSC 往往含有較多基質(zhì)細(xì)胞和造血細(xì)胞污染。骨片消化法，是先將骨髓沖干凈，將股骨和脛骨剪碎，然后進(jìn)行膠原酶消化(Zhu，H.，Guoj Z.K.，Jiang, X.X.，et al..A protocol forisolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone.Nat.Protoc.2010.5.550-560 ;Guo，Z.Li，H.，Li，X.，et al.1n vitro characteristicsand in vivo immunosuppressive activity of compact bone-derived murinemesenchymal progenitor cells.Stem Cells2006.24.992-1000)。雖然該方法獲得的MSC純度較高，但是程序復(fù)雜，且不同鼠齡骨片膠原酶消化時(shí)間不同，不容易掌握。隨著對MSC表面抗原認(rèn)識的深入，有研究者利用免疫方法如流式細(xì)胞儀法、免疫磁珠法對其進(jìn)行分離純化(Houlihan，D.D.，Mabuchij Y.，Morikawaj S.，et al.1solation of mousemesenchymal stem cells on the basis of expression of Sca-1and PDGFR- a.Nat.Protoc.2012.7.2103-2111 ；Baddoo Mj Hill Kj Wilkinson R，et al.Characterization ofmesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection.J Cell Biochem.2003.89.1235-1249)。雖然這兩種方法可以得到純度較高的細(xì)胞，但分離過程對細(xì)胞的活性影響較大，甚至導(dǎo)致細(xì)胞完全失去活性。而且實(shí)驗(yàn)條件要求高，需要骨髓量大，加之耗費(fèi)較大和技術(shù)難度，在某種程度上限制了這兩種方法的廣泛應(yīng)用。因此需要建立一種從骨髓中分離培養(yǎng)MSC的高效方法。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種獲得高純度和高單位數(shù)量(每根長骨得到的MSC)分離培養(yǎng)動(dòng)物骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，該方法還具有MSC出現(xiàn)時(shí)間早、不需除去骨髓、不需消化、操作簡便和快捷的優(yōu)點(diǎn)。
[0004]本發(fā)明所提供的分離培養(yǎng)動(dòng)物骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括將接種物接種于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行原代培養(yǎng)，再將原代培養(yǎng)得到的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，得到動(dòng)物骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；其中，所述接種物為對長骨破碎液進(jìn)行離心得到的沉淀，所述長骨破碎液是將離體的動(dòng)物長骨于緩沖溶液中破碎至0.5-1.5立方毫米顆粒(如I立方毫米顆粒)得到的混合物；
[0005]所述方法不包括用膠原酶消化的步驟，所述方法不除去所述動(dòng)物長骨的骨髓。
[0006]上述方法中，所述長骨由骨干和骨骺兩部分組成，表面覆有骨膜和關(guān)節(jié)軟骨，內(nèi)部為骨髓腔，其中充滿骨髓。
[0007]上述方法中，所述動(dòng)物可為脊椎動(dòng)物。所述脊椎動(dòng)物可為哺乳動(dòng)物，如小鼠。
[0008]上述方法中，所述長骨為股骨或/和脛骨或/和來源于前肢骨的長骨。
[0009]上述方法中，所述離心可為300g_500g離心5-10，如400g離心5分鐘。
[0010]所述緩沖溶液可為使動(dòng)物細(xì)胞保持活性的液體，如0.01M、pH7.2-7.4的磷酸鹽緩沖液。
[0011]上述方法中，所述動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基可為用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基，如MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基為a-MEM完全培養(yǎng)液。
[0012]上述方法中，所述傳代培養(yǎng)可為進(jìn)行至少2次傳代培養(yǎng)，如進(jìn)行2次傳代培養(yǎng)。
[0013]本發(fā)明還提供了制備上述用于分離培養(yǎng)動(dòng)物骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的接種物的方法。
[0014]本發(fā)明所提供的制備用于分離培養(yǎng)動(dòng)物骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的接種物的方法，包括:
[0015]1)將離體的動(dòng)物長骨于緩沖溶液中破碎至0.5-1.5立方毫米顆粒(如I立方毫米顆粒)得到長骨破碎液；
[0016]2)將步驟I)得到的長骨破碎液進(jìn)行離心，取沉淀，該沉淀即為用于分離培養(yǎng)動(dòng)物骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的接種物。
[0017]該制備上述用于分離培養(yǎng)動(dòng)物骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的接種物的方法中，所述動(dòng)物可為脊椎動(dòng)物。所述脊椎動(dòng)物可為哺乳動(dòng)物，如小鼠。所述長骨可為股骨或/和脛骨或/和來源于前肢骨的長骨。
[0018]所述離心可為300g_500g離心5-10，如400g離心5分鐘。
[0019]所述緩沖溶液可為使動(dòng)物細(xì)胞保持活性的液體，如0.01M、pH7.2-7.4的磷酸鹽緩沖液。
[0020]實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明獲得的所述動(dòng)物骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為梭形細(xì)胞，表達(dá)Seal，⑶44，⑶29，不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志⑶31及造血細(xì)胞標(biāo)志⑶45。本發(fā)明獲得的所述動(dòng)物骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在成骨和成脂誘導(dǎo)體系中培養(yǎng)能分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。本申請通過比較全骨髓貼壁法、骨片消化法及本發(fā)明的骨髓加骨片法，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的骨髓加骨片法是一種方便、快捷和有效的分離培養(yǎng)MSC的方法。本申請的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明的骨髓加骨片法出現(xiàn)的MSC克隆時(shí)間最早，克隆數(shù)量最多，第四天克隆數(shù)為20±4個(gè)/根股骨；骨片消化法為11.5 ±2.5個(gè)/根股骨；全骨髓貼壁法最少，為9.5± 1.5個(gè)/根股骨；到第三代時(shí)，本發(fā)明的骨髓加骨片法獲得細(xì)胞數(shù)量最多，是全骨髓貼壁法和骨片消化法的兩倍。
[0021]本發(fā)明的骨髓加骨片法將股骨和/或脛骨肌肉去干凈后，不需沖骨髓，不需消化，直接剪碎，緩沖液洗后重懸于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中直接接種。相比全骨髓貼壁法及骨片消化法，骨髓加骨片法出現(xiàn)小鼠MSC克隆的時(shí)間早，數(shù)量多。雖然第一代消化細(xì)胞仍有少量⑶45陽性細(xì)胞，但到第三代，MSC純度可達(dá)95%以上，而且獲得的MSC總數(shù)要高于全骨髓貼壁法及骨片消化法。與其他方法獲得的MSC相似，本發(fā)明的骨髓加骨片法獲得的MSC高表達(dá)Seal,⑶44，⑶29等，不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志⑶31及造血細(xì)胞標(biāo)志⑶45。該方法獲得的MSC在成骨和成脂誘導(dǎo)體系中培養(yǎng)能分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。綜上所述，本發(fā)明的骨髓加骨片法充分利用了骨髓及骨片，處理簡單、短時(shí)間內(nèi)可獲得足夠數(shù)量、生長狀態(tài)良好、增殖能力強(qiáng)的間充質(zhì)干細(xì)胞，是一種方便、快捷、高效的MSC分離培養(yǎng)方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為MSC的原代培養(yǎng)。
[0023]A為接種于6孔板72h的細(xì)胞形態(tài)。
[0024]B為接種第4天的細(xì)胞數(shù)量。
[0025]C為原代培養(yǎng)5天⑶45陽性細(xì)胞比例。
[0026]圖2為傳代后的細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞數(shù)。
[0027]A為第三代細(xì)胞的形態(tài)。
[0028]B為第二代細(xì)胞和第三代細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)。
[0029]圖3為分別全骨髓組(BM)、骨片消化組(Bone)及骨髓加骨片組(BM+Bone)的第三代細(xì)胞表型鑒定。
[0030]圖4為骨髓加骨片組(BM+Bone)的第三代細(xì)胞的分化能力。
[0031]A、骨髓加骨片組(BM+Bone)的第三代細(xì)胞經(jīng)HG-DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)培養(yǎng)I周后的ALP染色結(jié)果。
[0032]B、骨髓加骨片組(BM+Bone)的第三代細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)液培養(yǎng)I周后的ALP染色結(jié)果。
[0033]C、骨髓加骨片組(BM+Bone)的第三代細(xì)胞經(jīng)HG-DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)培養(yǎng)2周后Von Kossa染色結(jié)果。
[0034]D、骨髓加骨片組(BM+Bone)的第三代細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)液培養(yǎng)2周后Von Kossa染色結(jié)果。
[0035]E為骨髓加骨片組(BM+Bone)的第三代細(xì)胞經(jīng)HG-DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)培養(yǎng)I周后油紅O染色結(jié)果。
[0036]F為骨髓加 骨片組(BM+Bone)的第三代細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)液培養(yǎng)I周后油紅O染色結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0037]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0038]下述實(shí)施例中的主要試劑與儀器如下:
[0039]a -MEM 培養(yǎng)液(Gibco 公司，cat.n0.12000-022)，DMEM-HG 培養(yǎng)液(Gibco 公司，cat.n0.10566-024)，胎牛血清(上海依科賽生物制品有限公司產(chǎn)品cat.n0.FSP500)；
0.01M、pH7.2-7.4的PBS，地塞米松，磷酸化維生素C，β -磷酸甘油，II型膠原酶，胰酶，油紅O染液,堿性磷酸酶試劑盒為Sigma公司產(chǎn)品；檢測MSC表型相關(guān)抗體:FITC ant1-mouseCD45、APC ant1-mouse 1-A/I_E、PerCP ant1-mouse/human CD44、PE ant1-mouse CD31、APCant1-mouse/rat CD29>PerCP ant1-mouse Ly_6A/E(Sca_l)均為 BD 公司產(chǎn)品；25cm2、75cm2培養(yǎng)瓶(costar)，6孔/48孔培養(yǎng)板(Falcon，nunc);流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Forma),生物凈化工作臺(北京中化生物技術(shù)研究所/偉達(dá)凈化技術(shù)研究所合制，X90-3),倒置顯微鏡(日本Olympus公司),低速離心機(jī)(中佳SC-3610)。
[0040]實(shí)施例1、分離培養(yǎng)動(dòng)物骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法
[0041]本實(shí)施采用了三種分離培養(yǎng)動(dòng)物骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，分別為全骨髓貼壁法(簡稱BM)、骨片消化法(簡稱Bone)和骨髓加骨片法(簡稱BM+Bone)。這三種方法的接種物均來源于同一只C57BL/6小鼠的股骨。全骨髓貼壁法的接 種物是離體的小鼠股骨的骨髓，骨片消化法的接種物是小鼠股骨的骨片，骨片按照如下方法制備:將全骨髓貼壁法中除去骨髓后剩余的股骨(將完整的股骨的骨髓去除后剩余的那部分)于0.01M、pH7.2-7.4的PBS剪碎至I立方毫米顆粒，加入0.1% II型膠原酶后，放置于37°C、5%C02、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育lh，得到的骨片即為接種物。骨髓加骨片法的接種物為對股骨破碎液進(jìn)行離心得到的沉淀，所述股骨破碎液是將同一只C57BL/6小鼠離體的另一根股骨(是完整的股骨，不除去骨髓)于緩沖液中破碎至I立方毫米顆粒得到的混合物。
[0042]本實(shí)施例比較了三種分離培養(yǎng)動(dòng)物骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法MSC克隆出現(xiàn)時(shí)間、大小及數(shù)量；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞免疫表型；并進(jìn)行成骨、成脂分化鑒定。結(jié)果表明骨髓加骨片法出現(xiàn)的MSC克隆時(shí)間最早，克隆數(shù)量最多，第四天克隆數(shù)為20±4個(gè)/根股骨；骨片消化法為11.5 ±2.5個(gè)/根股骨；全骨髓貼壁法最少，為9.5± 1.5個(gè)/根股骨。到第三代時(shí)，骨髓加骨片法獲得細(xì)胞數(shù)量最多，是全骨髓貼壁法和骨片消化法的兩倍。骨髓加骨片法獲得的第三代細(xì)胞為梭形細(xì)胞。流式結(jié)果顯示，骨髓加骨片法獲得的第三代細(xì)胞高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志之一 Sca-1，高表達(dá)⑶44、⑶29，不表達(dá)白細(xì)胞表面抗原⑶45和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志⑶31等；髓加骨片法獲得的第三代細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)體系和成脂誘導(dǎo)體系中能分別向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化，具典型的MSC特性。
[0043]具體實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
[0044]I材料和方法
[0045]1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0046]健康C57BL/6小鼠，3~4周齡，雌雄不限，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供。
[0047]1.2MSC的分離培養(yǎng)
[0048]實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)取I只頸髓離斷處死C57BL/6小鼠，75%乙醇浸泡5min，無菌條件下取小鼠雙側(cè)股骨，無菌剪鈍性剝離肌肉，將肌肉分離干凈的股骨(完整股骨)放入0.01M、pH7.2-7.4的PBS (磷酸鹽緩沖液)中。取一側(cè)股骨剪開股骨干骺端，暴露骨髓腔，用Iml注射器吸取0.01M、pH7.2-7.4的PBS反復(fù)沖洗該一側(cè)股骨骨髓腔，沖出的骨髓全部放于一只1.5mlEP管中，用槍尖輕輕吹打制成單細(xì)胞懸液，將該EP管以400g離心5min，棄上清液，沉淀即為全骨髓貼壁法(簡稱BM)的接種物，取全部沉淀用Imla-MEM完全培養(yǎng)液(在a-MEM培養(yǎng)液中加入胎牛血清、青霉素和鏈霉素，至胎牛血清的體積百分濃度為10%胎牛血清、青霉素的濃度為10萬單位每升、鏈霉素的濃度為10萬單位每升得到的液體)重懸細(xì)胞種于6孔板中的一個(gè)孔中為全骨髓組(ΒΜ)。將該沖出骨髓后剩余的股骨(將完整的股骨的骨髓去除后剩余的那部分)全部在裝有0.01Μ、ρΗ7.2-7.4的PBS的1.5mlEP管中剪碎至I立方毫米顆粒，加入Iml0.1% II型膠原酶后，放置于37°C、5%C02、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育Ih得到骨片，該骨片即為骨片消化法(簡稱Bone)的接種物，然后用0.01M、PH7.2-7.4的PBS洗滌全部骨片三遍后，將全部骨片用上述Iml a -MEM完全培養(yǎng)液重懸后種于6孔板中的第二個(gè)孔中，為骨片消化組(Bone);將該同一只小鼠的另一側(cè)股骨(完整股骨，不除去骨髓)在裝有0.01Μ、ρΗ7.2-7.4的PBS的1.5mlEP管中全部剪碎至I立方毫米顆粒，將該EP管以400g離心5min，吸出上清，沉淀即為骨髓加骨片法(簡稱BM+Bone)的接種物，將全部沉淀用上述Iml a -MEM完全培養(yǎng)液重懸后種于該6孔板的第3個(gè)孔中，為骨髓加骨片組(BM+Bone)。同種方法各做三個(gè)復(fù)孔，于37°C、5%C02、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后半量換液(用上述a-MEM完全培養(yǎng)液進(jìn)行換液)，72h后全量換液(用上述a-MEM完全培養(yǎng)液進(jìn)行換液)，以后每2-3天換液一次(用上述a -MEM完全培養(yǎng)液進(jìn)行換液),在倒置顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞生長情況，當(dāng)細(xì)胞生長鋪滿板底80~90%時(shí)使用0.25%胰蛋白酶(含0.0296EDTA)對細(xì)胞(原代細(xì)胞，第一代細(xì)胞)進(jìn)行消化計(jì)數(shù)，按1:2比例接種于新的6孔板中進(jìn)行第一次傳代。第一次傳代的細(xì)胞于37°C、5%C02、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后半量換液(用上述a -MEM完全培養(yǎng)液進(jìn)行換液)，72h后全量換液(用上述a -MEM完全培養(yǎng)液進(jìn)行換液)，以后每2-3天換液一次(用上述a -MEM完全培養(yǎng)液進(jìn)行換液),在倒置顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞生長情況，當(dāng)細(xì)胞生長鋪滿板底80~90%時(shí)使用0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)對細(xì)胞(第二代細(xì)胞)進(jìn)行消化計(jì)數(shù)，按1:2比例接種于新的6孔板中進(jìn)行第二次傳代。第二次傳代的細(xì)胞于37°C、5%C02、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后半量換液(用上述a -MEM完全培養(yǎng)液進(jìn)行換液)，72h后全量換液(用上述a -MEM完全培養(yǎng)液進(jìn)行換液)，以后每2-3天換液一次(用上述a -`MEM完全培養(yǎng)液進(jìn)行換液),在倒置顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞生長情況，當(dāng)細(xì)胞生長鋪滿板底80~90%時(shí)，得到第三代細(xì)胞。
[0049]1.3MSC形態(tài)學(xué)觀察
[0050]在倒置顯微鏡上逐日觀察細(xì)胞的生長狀況和形態(tài)變化特點(diǎn)，在第一次傳代之前數(shù)集落數(shù)并拍照，以后傳代之前也拍照記錄。
[0051]1.4MSC的免疫表型鑒定
[0052]取生長狀態(tài)良好消化后的第3代細(xì)胞，PBS洗一遍后懸成IxlO6個(gè)/ml單細(xì)胞懸液，200μ1/ΕΡ 管，分別加入突光標(biāo)記抗體:FITC ant1-mouse CD45、APC ant1-mouse 1-A/1-E、PerCP ant1-mouse/human CD44APC ant1-mouse/rat CD29 和 PerCP ant1-mouse Ly-6A/E(Sca-1)0 4°C孵育30min后PBS洗去未標(biāo)記抗體，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析樣品中相應(yīng)標(biāo)記抗原的陽性表達(dá)率。
[0053]1.5MSC的體外成骨分化誘導(dǎo)
[0054]取第三代細(xì)胞接種至48孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為2 X IO4個(gè)，每組都設(shè)3復(fù)孔，每孔加入400 μ I上述a -MEM完全培養(yǎng)液，放入37°C、5%C02、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞過夜貼壁后，吸去培養(yǎng)液，加入400 μ I/孔的成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)液(HG-DMEM培養(yǎng)液含10%胎牛血清及10_7M地塞米松，IOmMβ -磷酸甘油，50 μ M磷酸化維生素C)。對照組用HG-DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)。每3天換液，I周后，進(jìn)行ALP (堿性磷酸酶)染色，2周后，進(jìn)行Von Kossa染色。
[0055]1.6MSC的體外成脂分化誘導(dǎo)
[0056]取第三代細(xì)胞接種至48孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為2 X IO4個(gè)，每組都設(shè)3復(fù)孔，每孔加入400 μ I上述a -MEM完全培養(yǎng)液，放入37°C、5%C02、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞過夜貼壁后，吸去培養(yǎng)液，加入400 μ I/孔的成脂誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)液(HG-DMEM培養(yǎng)液含10%胎牛血清及IO-6M地塞米松，10ng/ml胰島素，0.5 μ M ΙΒΜΧ)。對照組用HG-DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)。每3天換液，I周后，進(jìn)行油紅O染色。
[0057]1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0058]使用SPSS16.0軟件，數(shù)據(jù)采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(T 土 S )表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P〈0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0059]2 結(jié)果
[0060]2.1MSC的分尚培養(yǎng)
[0061]全骨髓組(BM)骨髓細(xì)胞接種于6孔板48h在培養(yǎng)液中以懸浮圓形細(xì)胞為主，混有大量更為細(xì)小圓形的造血系細(xì)胞；骨片消化組(Bone)骨片接種于6孔板中48h未見細(xì)胞懸浮；骨髓加骨片組(BM+Bone)接種于6孔板48h在培養(yǎng)液中以懸浮圓形細(xì)胞為主，混有大量更為細(xì)小圓形的造血系細(xì)胞。48h半量`換液后可見三組均有少量細(xì)胞貼壁,呈集落狀,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，有長梭形，有多角形等，全骨髓組(BM)和骨髓加骨片組(BM+Bone)還可見一些圓形貼壁細(xì)胞，而全骨髓組(BM)中圓形貼壁細(xì)胞尤為多。接種于6孔板72h (第一次換液后24h)可見每組貼壁細(xì)胞集落數(shù)均有增加，但是骨髓加骨片組(BM+Bone)增加更為顯著(圖1中A);統(tǒng)計(jì)每組集落數(shù)，全骨髓組(BM)、骨片消化組(Bone)、骨髓加骨片組(BM+Bone)分別為9.5± 1.5個(gè)/根股骨、11.5±2.5個(gè)/根股骨、20±4個(gè)/根股骨(圖1中B)。原代培養(yǎng)5天(接種5天)，骨髓加骨片組(BM+Bone)細(xì)胞可達(dá)80%-90%融合，骨片消化組(Bone)次之，全骨髓組(BM)最少，這時(shí)細(xì)胞主要呈長條狀紡錘形，整體排列趨于規(guī)律呈漩渦狀。消化細(xì)胞并取相同細(xì)胞量檢測CD45表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)全骨髓組(BM)中CD45陽性細(xì)胞最多，達(dá)78.6%，骨髓加骨片組(BM+Bone)次之為10.6%，而骨片消化組(Bone)最少，僅2.66%(圖1中C)。隨著細(xì)胞傳代次數(shù)增多，細(xì)胞由培養(yǎng)早期的混合性細(xì)胞群，逐漸變?yōu)樾螒B(tài)相對均一的梭形細(xì)胞(圖2中A)，收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，骨髓加骨片組(BM+Bone)收獲細(xì)胞數(shù)最多(圖2中B)。第二代細(xì)胞(P2)和第三代細(xì)胞(P3)中，骨髓加骨片組(BM+Bone)的細(xì)胞數(shù)量是全骨髓組(BM)和骨片消化組(Bone)的兩倍，骨髓加骨片組(BM+Bone)的第二代細(xì)胞數(shù)是5.3±0.14個(gè)/根股骨，骨髓加骨片組(BM+Bone)的第三代細(xì)胞數(shù)是12.5±3.5個(gè)/根股骨。
[0062]2.2MSC的表型鑒定
[0063]分別收集全骨髓組(BM)、骨片消化組(Bone)及骨髓加骨片組(BM+Bone)的第三代細(xì)胞進(jìn)行表型鑒定。流式結(jié)果顯示(圖3)，各組細(xì)胞高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志之一 Sca-Ι，高表達(dá)粘附分子⑶44和⑶29 ;不表達(dá)MHC II類分子IA/IE，及內(nèi)皮標(biāo)志之一⑶31。骨片消化組(Bone)及骨髓加骨片組(BM+Bone)的第三代細(xì)胞不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志之一⑶45，而全骨髓組(BM)的第三代細(xì)胞仍有5%的⑶45陽性細(xì)胞。
[0064]2.3MSC的成骨及成脂功能鑒定
[0065]收集骨髓加骨片組(BM+Bone)的第三代細(xì)胞進(jìn)行成骨及成脂分化鑒定，如圖4顯示，在成骨誘導(dǎo)體系誘導(dǎo)一周后，堿性磷酸酶染色陽性(圖4中B)，誘導(dǎo)兩周后VonKossa染色陽性(圖4中D)，說明骨髓加骨片組(BM+Bone)的第三代細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞；在成脂誘導(dǎo)體系誘導(dǎo)一周后，細(xì)胞呈油紅O染色陽性(圖4中F)，說明骨髓加骨片組(BM+Bone)的第三代細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞；它們的對照組即未加誘導(dǎo)劑的染色為陰性(圖4中A，C，E)。
[0066]本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)證明髓加骨片組(BM+Bone)的第三代細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0067]實(shí)施例2、分離培養(yǎng)動(dòng)物骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法
[0068]本實(shí)施采用了三種分離培養(yǎng)動(dòng)物骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，分別為全骨髓貼壁法、骨片消化法和骨髓加骨片法。這三種方法的接種物均來源于同一只C57BL/6小鼠的脛骨。這三種方法的實(shí)驗(yàn)方法除將股骨替換為脛骨外，其它均與實(shí)施例1同。這三種方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均與實(shí)施例1無顯著 差異。
【權(quán)利要求】
1.分離培養(yǎng)動(dòng)物間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括將接種物接種于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行原代培養(yǎng)，再將原代培養(yǎng)得到的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，得到動(dòng)物間充質(zhì)干細(xì)胞；其特征在于:所述接種物為對長骨破碎液進(jìn)行離心得到的沉淀，所述長骨破碎液是將離體的動(dòng)物長骨于緩沖溶液中破碎至0.5-2立方毫米顆粒得到的混合物； 所述方法不包括用膠原酶消化的步驟，所述方法不除去所述動(dòng)物長骨的骨髓。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述動(dòng)物為脊椎動(dòng)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述脊椎動(dòng)物為哺乳動(dòng)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述接種物為按照權(quán)利要求5-8中任一所述的方法制備的用于分離培養(yǎng)動(dòng)物間充質(zhì)干細(xì)胞的接種物。
5.制備用于分離培養(yǎng)動(dòng)物間充質(zhì)干細(xì)胞的接種物的方法，包括: 1)將離體的 動(dòng)物長骨于緩沖溶液中破碎至0.5-2立方毫米顆粒得到長骨破碎液； 2)將步驟I)得到的長骨破碎液進(jìn)行離心，取沉淀，該沉淀即為用于分離培養(yǎng)動(dòng)物間充質(zhì)干細(xì)胞的接種物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述動(dòng)物為脊椎動(dòng)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述脊椎動(dòng)物為哺乳動(dòng)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于:所述長骨為股骨或/和脛骨。
9.由權(quán)利要求5-8中任一所述的方法制備的用于分離培養(yǎng)動(dòng)物間充質(zhì)干細(xì)胞的接種物。
【文檔編號】C12N5/0775GK103525761SQ201310464090
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月8日
【發(fā)明者】江小霞, 毛寧, 楊燕美, 李紅, 黨瑞杰, 張雷, 李萍, 劉元林 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所