一種評價含有溶出性抗菌劑皮革抗菌性能的改良暈圈法
【專利摘要】一種評價含有溶出性抗菌劑皮革抗菌性能的改良暈圈法，具體操作步驟如下：⑴制備下層無菌培養(yǎng)基；⑵向步驟（1）所得的下層無菌培養(yǎng)基中加入帶菌培養(yǎng)基，形成上層帶菌培養(yǎng)基；⑶在培養(yǎng)皿反面作2-5個標(biāo)記，使得每個標(biāo)記點與平板周緣相距20毫米以上，相鄰標(biāo)記點間距離大于40毫米，用無菌鑷子取直徑為5毫米的圓形皮革樣品貼放于上層帶菌培養(yǎng)基表面，使皮革樣品的圓心位于標(biāo)記點處；⑷將步驟（3）所得的接種有試驗菌的培養(yǎng)皿放于恒溫培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)24h或48h后，通過游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測量抑菌圈直徑即可。本方法的實驗步驟非常簡單，能同時測定多個皮革樣品的抗菌性能，能大大節(jié)約實驗時間、成本，減少實驗誤差，并能保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。
【專利說明】一種評價含有溶出性抗菌劑皮革抗菌性能的改良暈圈法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于抗菌消毒測試【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種評價含有溶出性抗菌劑皮革抗菌性能的改良暈圈法。
【背景技術(shù)】
[0002]皮革是經(jīng)脫毛和鞣制等物理、化學(xué)加工得到的已經(jīng)變性且不易腐爛的動物皮，其主要成分是交聯(lián)蛋白質(zhì)。在制革過程中所使用的原輔材料許多都包含有蛋白質(zhì)、糖類、脂肪等物質(zhì)，因此 皮革及其制品中含有豐富的能被微生物利用的營養(yǎng)物質(zhì)，是微生物良好的寄生地。抗菌皮革，即在皮革中引入一種或幾種抗菌基團的功能性皮革材料，使它具有接觸殺菌或者抑制皮革表面的微生物繁殖的功能。對皮革的抗菌性能進行科學(xué)、快速和準(zhǔn)確的檢測，是評價抗菌皮革質(zhì)量優(yōu)劣的重要指標(biāo)。
[0003]目前，國內(nèi)外雖然有很多關(guān)于抗菌皮革的研究報道，但評價其抗菌性能的方法都大同小異，且都是參考其他行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)實施的。其中，評價含有溶出性抗菌劑皮革樣品的方法基本上是暈圈法(H.R.Nawaz,.Preparation of Nano Zinc Oxide and itsApplication in Leather as a Retanning and Antibacterial Agent[J].CanadianJournal on Scientific and Industrial Research, 2011, 2 (4): 164-169)以及瓊脂培養(yǎng)皿擴散法(鄧云霞，杜鵑，朱小衛(wèi)，任信.皮革材料及其制品抗霉菌效果的方法研究[J].2010,39 (I):22-24).在暈圈法中，用無菌涂布器將菌懸液涂開使其分散于培養(yǎng)基表面，該步驟會花費大量的時間，增加實驗的工作量，同時，該步驟還容易引起涂布不均勻，而帶來實驗誤差；在瓊脂平皿擴散法中，將菌懸液直接加入無菌培養(yǎng)基里，可避免由于涂布不均勻而帶來的實驗誤差，但是無論是暈圈法還是瓊脂培養(yǎng)皿擴散法，在同一個培養(yǎng)皿中，一次只能測試一個樣品的抗菌性能，不同樣品的抑菌圈直徑要用游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確量過以后才能得知，且不同的培養(yǎng)環(huán)境會帶來一定的誤差。另外，濾紙條交叉放藥法也被用于評價含有溶出性抗菌劑皮革的抗菌性能(Gu Haibin, Zhao Changqing, Chen ffuyong, Li Yan.Evaluating combinations of leather fungicides by inhibition zone[J].Journal ofthe Society of Leather Technologists and Chemists, 2007, 91(2): 63-68),在該方法中，將浸有不同抗菌劑的樣品十字交叉放于帶菌培養(yǎng)基表面，再根據(jù)不同的抑菌區(qū)域形狀，判斷不同的抗菌劑是否有抗菌加合作用或協(xié)同作用。雖然該方法能同時測定不同樣品的抗菌性能，但是該方法的操作步驟十分繁瑣，要求實驗者有非常熟練的操作技術(shù)；且該方法所需的實驗樣品面積較大，而皮革樣品一般較厚，因此不利于其緊貼培養(yǎng)基表面，從而帶來誤差。除以上提及的方法以外，關(guān)于評價含有溶出性抗菌劑皮革樣品抗菌性能的方法報道較少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明針對現(xiàn)有測試方法存在的問題，提供了一種簡單、快速、能多樣品同時測定且測定結(jié)果準(zhǔn)確、可重復(fù)性高的改良暈圈法，用于評價含有溶出性抗菌劑皮革的抗菌性能。[0005]為達到本發(fā)明的目的，本發(fā)明人在已有的評價含有溶出性抗菌劑皮革抗菌性能方法的基礎(chǔ)上，深入的研究了實驗室常用的利用暈圈法以及瓊脂培養(yǎng)皿擴散法評價皮革抗菌性能的原理和方法。發(fā)現(xiàn)這兩種方法雖然都能簡單快捷的評價皮革的抗菌性能，但是在暈圈法中，用無菌涂布器將菌液涂開的步驟會花費大量的時間，同時該步驟還可能造成涂布不均勻而帶來實驗誤差。而在瓊脂平皿擴散法中，將菌懸液直接加入無菌培養(yǎng)基里，可以避免由于涂布不均勻而帶來的實驗誤差，但是無論是暈圈法還是瓊脂培養(yǎng)皿擴散法，在同一個培養(yǎng)皿中，一次只能測試一個樣品的抗菌性能。為了簡化實驗步驟，節(jié)約實驗時間、成本，提高實驗的準(zhǔn)確性，本發(fā)明人研究了瓊脂培養(yǎng)皿擴散法并對其進行了改進，最終發(fā)現(xiàn)將菌懸液直接加入培養(yǎng)基里，振蕩錐形瓶可使菌懸液均勻的分布在無菌培養(yǎng)基里，形成帶菌培養(yǎng)基，然后將帶菌培養(yǎng)基傾注于培養(yǎng)皿中可使得菌懸液在平板中均勻的分布，這樣即可以減少由于涂布不均勻帶來的誤差，同時又可以節(jié)約大量的實驗時間。為了進一步簡化實驗步驟，本發(fā)明人又探索了評價含有溶出性抗菌劑樣品抗菌性能的抑菌環(huán)實驗，發(fā)現(xiàn)同一個培養(yǎng)皿中可以同時評價多個實驗樣品的抗菌性能，大量的研究結(jié)果表明，在暈圈法及瓊脂培養(yǎng)皿擴散法中，抑菌環(huán)寬度通常在0-20毫米之間，按式I計算抑菌環(huán)寬度。
[0006]H= (D-d)/2..................(I)
式中H:抑菌環(huán)寬度，單位為(毫米)；
D:抑菌圈直徑，單位為(毫米)； d:樣品直徑，單位為毫米。
[0007]因此，當(dāng)樣品中心點距培養(yǎng)皿周緣20毫米以上時，可以避免抑菌圈與培養(yǎng)皿周緣相交，當(dāng)相鄰樣品中心點間相距40毫米以上時，可避免相鄰樣品間的抑菌圈相交。通過該實驗步驟可節(jié)約大量的實驗時間及成本。
[0008]在以上探索研究的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)若在加入帶菌培養(yǎng)基之前，先在無菌培養(yǎng)皿中加入一層無菌的培養(yǎng)基，可減少由于培養(yǎng)皿底部不平整，引起帶菌培養(yǎng)基厚度不一致而帶來的實驗誤差。最終發(fā)現(xiàn)，這種組合方法的操作步驟十分簡單，且能同時準(zhǔn)確、快速的測定多個樣品的抗菌性能，可節(jié)約大量的實驗時間及成本。在以上探索研究的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人提出了一種評價含有溶出性抗菌劑皮革抗菌性能的改良暈圈法。
[0009]本發(fā)明提供的一種評價含有溶出性抗菌劑皮革抗菌性能的改良暈圈法，該方法具體通過以下步驟實施:
⑴直徑為120毫米的無菌培養(yǎng)皿中傾注12mL無菌培養(yǎng)基，室溫下靜置10分鐘后，形成下層無菌培養(yǎng)基；
⑵無菌移液管移取6ml帶菌培養(yǎng)基，加入到步驟(1)所得的下層無菌培養(yǎng)基中，搖晃培養(yǎng)皿使帶菌培養(yǎng)基分布整個培養(yǎng)皿，室溫下靜置10分鐘后，形成上層帶菌培養(yǎng)基；
⑶在培養(yǎng)皿反面作2-5個標(biāo)記，使得每個標(biāo)記點與平板周緣相距20毫米以上，相鄰標(biāo)記點間距離大于40毫米，用無菌鑷子取直徑為5毫米的圓形皮革樣品貼放于上層帶菌培養(yǎng)基表面，使皮革樣品的圓心位于標(biāo)記點處。
[0010]⑷將步驟(3)所得的接種有試驗菌的培養(yǎng)皿放于恒溫培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)24h或48h后，通過游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測量抑菌圈直徑即可。
[0011]在上述方法中，帶菌培養(yǎng)基的制備方法為:取45°C的無菌培養(yǎng)基150mL，加入IOmL濃度為106cfu/mL的試驗菌菌懸液，振蕩錐形瓶使菌體分布均勻即制得帶菌培養(yǎng)基；本方法中測試的試驗菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、青霉、粘性紅圓酵母、白色念珠菌中的任意一種；本方法中的培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基中的任意一種；本方法中每個標(biāo)記點與平板的周緣相聚20-30毫米，每個標(biāo)記點相距40-50毫米；本方法中，將接種有細菌的培養(yǎng)皿放于37°C的恒溫培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)24h ;接種有真菌的培養(yǎng)皿放于28°C的恒溫培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)48h。
[0012]本發(fā)明提供的上述一種評價含有溶出性抗菌劑皮革抗菌性能的改良暈圈法，具有以下優(yōu)點:
1、本發(fā)明提供的方法，構(gòu)思巧妙，實驗操作非常簡單，可利用傳統(tǒng)評價皮革抗菌性能所需的儀器設(shè)備，因此本方法不需要額外的操作設(shè)備，可操作性強。
[0013]2、本發(fā)明提供的方法，用兩層不同的培養(yǎng)基代替單層帶菌培養(yǎng)基，可以減小由于培養(yǎng)皿底部不平整，引起帶菌培養(yǎng)基厚度不一致而帶來的實驗誤差，從而增加實驗的準(zhǔn)確性和可信度。
[0014]3、本發(fā)明提供的方法，將菌懸液直接加入無菌培養(yǎng)基里，再倒入已有下層無菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，代替了暈圈法中將菌懸液用涂布器涂開的步驟，這樣即減小了由于涂布不均勻而帶來的誤差，又節(jié)約了大量的實驗時間，簡化了實驗步驟。
[0015]4、本發(fā)明提供的方法，可同時評價多個皮革樣品的抗菌性能，且實驗結(jié)果具有很高的可重復(fù)性及可信度。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]附圖為本發(fā)明方法所適用的一種評價含有溶出性抗菌劑皮革抗菌性能的改良暈圈法的不意圖，其中al、a2、a3一試驗樣品，b一抑菌圈，c一菌落區(qū)域。
【具體實施方式】
[0017]下面給出實施例以對本發(fā)明作更詳細的說明，有必要指出的是以下實施例不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員根據(jù)上述本
【發(fā)明內(nèi)容】
對本發(fā)明做出的一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整仍屬本發(fā)明的保護范圍。
[0018]實施例一
用打孔器取直徑為5毫米的不含溶出性抗菌劑的圓形皮革樣品。向直徑為120毫米的無菌培養(yǎng)皿中傾注12mL無菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，室溫下靜置10分鐘后，形成下層無菌培養(yǎng)基。再取45°C的無菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基150mL，加入IOmL濃度為106cfu/mL的大腸桿菌菌懸液，振蕩錐形瓶使菌體分布均勻，形成帶菌培養(yǎng)基。用無菌移液管移取6ml帶菌培養(yǎng)基，加入到已形成下層無菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，搖晃培養(yǎng)皿使帶菌培養(yǎng)基分布整個培養(yǎng)皿，室溫下靜置10分鐘后，形成上層帶菌培養(yǎng)基。在培養(yǎng)皿的反面作5個標(biāo)記，使每個標(biāo)記點與平板的周緣相距20毫米，相鄰標(biāo)記點間距離40毫米，用無菌鑷子取圓形皮革樣品貼放于上層帶菌培養(yǎng)基表面，使圓形皮革樣品的圓心位于標(biāo)記點處，培養(yǎng)24h后用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。
[0019]實施例二
用打孔器取直徑為5毫米的含有溶出性抗菌劑的圓形皮革樣品。向直徑為120毫米的無菌培養(yǎng)皿中傾注12mL無菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，室溫下靜置10分鐘后，形成下層無菌培養(yǎng)基。再取45°C的無菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基150mL，加入IOmL濃度為106cfu/mL的大腸桿菌菌懸液，振蕩錐形瓶使菌體分布均勻，形成帶菌培養(yǎng)基。用無菌移液管移取6ml帶菌培養(yǎng)基，加入到已形成下層無菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，搖晃培養(yǎng)皿使帶菌培養(yǎng)基分布整個培養(yǎng)皿，室溫下靜置10分鐘后，形成上層帶菌培養(yǎng)基。在培養(yǎng)皿的反面作5個標(biāo)記，使每個標(biāo)記點與平板的周緣相距20毫米，相鄰標(biāo)記點間距離40毫米，用無菌鑷子取圓形皮革樣品貼放于上層帶菌培養(yǎng)基表面，使圓形皮革樣品的圓心位于標(biāo)記點處。培養(yǎng)24h后用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。
[0020]實施例三
用打孔器取直徑為5毫米的含有溶出性抗菌劑的圓形皮革樣品。向直徑為120毫米的無菌培養(yǎng)皿中傾注12mL無菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，室溫下靜置10分鐘后，形成下層無菌培養(yǎng)基。再取45°C的無菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基150mL，加入IOmL濃度為106cfu/mL的金黃色葡萄球菌菌懸液，振蕩錐形瓶使菌體分布均勻，形成帶菌培養(yǎng)基。用無菌移液管移取6ml帶菌培養(yǎng)基，加入到已形成下層無菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，搖晃培養(yǎng)皿使帶菌培養(yǎng)基分布整個培養(yǎng)皿，室溫下靜置10分鐘后，形成上層帶菌培養(yǎng)基。在培養(yǎng)皿的反面作4個標(biāo)記，使每個標(biāo)記點與平板的周緣相距25毫米，相鄰標(biāo)記點間距離45毫米，用無菌鑷子取圓形皮革樣品貼放于上層帶菌培養(yǎng)基表面，使圓形皮革樣品的圓心位于標(biāo)記點處。培養(yǎng)24h后用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。
[0021]實施例四
用打孔器取直徑為5毫米的含有溶出性抗菌劑的圓形皮革樣品。向直徑為120毫米的無菌培養(yǎng)皿中傾注12mL無菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，室溫下靜置10分鐘后，形成下層無菌培養(yǎng)基。再取45°C的無菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基150mL，加入IOmL濃度為106cfu/mL的大腸桿菌菌懸液，振蕩錐形瓶使菌體分布均勻，形成帶菌培養(yǎng)基。用無菌移液管移取6ml帶菌培養(yǎng)基，加入到已形成下層無菌`培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，搖晃培養(yǎng)皿使帶菌培養(yǎng)基分布整個培養(yǎng)皿，室溫下靜置10分鐘后，形成上層帶菌培養(yǎng)基。在培養(yǎng)皿的反面作4個標(biāo)記，使每個標(biāo)記點與平板的周緣相距25毫米，相鄰標(biāo)記點間距離45毫米，用無菌鑷子取圓形皮革樣品貼放于上層帶菌培養(yǎng)基表面，使圓形皮革樣品的圓心位于標(biāo)記點處。培養(yǎng)24h后用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。
[0022]實施例五
用打孔器取直徑為5毫米的含有溶出性抗菌劑的圓形皮革樣品。向直徑為120毫米的無菌培養(yǎng)皿中傾注12mL無菌察氏培養(yǎng)基，并使其凝結(jié)，形成下層無菌培養(yǎng)基。再取45°C的無菌察氏培養(yǎng)基150mL，加入IOmL濃度為106cfu/mL的黑曲霉菌懸液，振蕩錐形瓶使菌體分布均勻，室溫下靜置10分鐘后，形成帶菌培養(yǎng)基。用無菌移液管移取6ml帶菌培養(yǎng)基，加入到已形成下層無菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，搖晃培養(yǎng)皿使帶菌培養(yǎng)基分布整個培養(yǎng)皿，室溫下靜置10分鐘后，形成上層帶菌培養(yǎng)基。在培養(yǎng)皿的反面作4個標(biāo)記，使每個標(biāo)記點與平板的周緣相距25毫米，相鄰標(biāo)記點間距離45毫米，用無菌鑷子取圓形皮革樣品貼放于上層帶菌培養(yǎng)基表面，使圓形皮革樣品的圓心位于標(biāo)記點處。培養(yǎng)48h后用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。
[0023]實施例六用打孔器取直徑為5毫米的含有溶出性抗菌劑的圓形皮革樣品。向直徑為120毫米的無菌培養(yǎng)皿中傾注12mL無菌LB培養(yǎng)基，并使其凝結(jié)，形成下層無菌培養(yǎng)基。再取45°C的無菌LB培養(yǎng)基150mL，加入IOmL濃度為106cfu/mL的粘性紅圓酵母菌懸液，振蕩錐形瓶使菌體分布均勻，室溫下靜置10分鐘后，形成帶菌培養(yǎng)基。用無菌移液管移取6ml帶菌培養(yǎng)基，加入到已形成下層無菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，搖晃培養(yǎng)皿使帶菌培養(yǎng)基分布整個培養(yǎng)皿，室溫下靜置10分鐘后，形成上層帶菌培養(yǎng)基。在培養(yǎng)皿的反面作4個標(biāo)記，使每個標(biāo)記點與平板的周緣相距25毫米，相鄰標(biāo)記點間距離45毫米，用無菌鑷子取圓形皮革樣品貼放于上層帶菌培養(yǎng)基表面，使圓形皮革樣品的圓心位于標(biāo)記點處。培養(yǎng)48h后用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。
[0024]實施例七
用打孔器取直徑為5毫米的含有溶出性抗菌劑的圓形皮革樣品。向直徑為120毫米的無菌培養(yǎng)皿中傾注12mL無菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，室溫下靜置10分鐘后，形成下層無菌培養(yǎng)基。再取45°C的無菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基150mL，加入IOmL濃度為106cfu/mL的枯草芽孢桿菌菌懸液，振蕩錐形瓶使菌體分布均勻，形成帶菌培養(yǎng)基。用無菌移液管移取6ml帶菌培養(yǎng)基，加入到已形成下層無菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，搖晃培養(yǎng)皿使帶菌培養(yǎng)基分布整個培養(yǎng)皿，室溫下靜置10分鐘后，形成上層帶菌培養(yǎng)基。在培養(yǎng)皿的反面作3個標(biāo)記，使每個標(biāo)記點與平板的周緣相距25毫米，相鄰標(biāo)記點間距離50毫米，用無菌鑷子取圓形皮革樣品貼放于上層帶菌培養(yǎng)基表面，使圓形皮革樣品的圓心位于標(biāo)記點處。培養(yǎng)24h后用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。
[0025]實施例八
用打孔器取直徑為5毫米的含有溶出性抗菌劑的圓形皮革樣品。向直徑為120毫米的無菌培養(yǎng)皿中傾注12mL無菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，室溫下靜置10分鐘后，形成下層無菌培養(yǎng)基。再取45°C的無菌牛肉膏 蛋白胨培養(yǎng)基150mL，加入IOmL濃度為106cfu/mL的金黃色葡萄球菌菌懸液，振蕩錐形瓶使菌體分布均勻，形成帶菌培養(yǎng)基。用無菌移液管移取6ml帶菌培養(yǎng)基，加入到已形成下層無菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，搖晃培養(yǎng)皿使帶菌培養(yǎng)基分布整個培養(yǎng)皿，室溫下靜置10分鐘后，形成上層帶菌培養(yǎng)基。在培養(yǎng)皿的反面作3個標(biāo)記，使每個標(biāo)記點與平板的周緣相距25毫米，相鄰標(biāo)記點間距離50毫米，用無菌鑷子取圓形皮革樣品貼放于上層帶菌培養(yǎng)基表面，使圓形皮革樣品的圓心位于標(biāo)記點處。培養(yǎng)24h后用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。
[0026]實施例九
用打孔器取直徑為5毫米的含有溶出性抗菌劑的圓形皮革樣品。向直徑為120毫米的無菌培養(yǎng)皿中傾注12mL無菌馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，室溫下靜置10分鐘后，形成下層無菌培養(yǎng)基。再取45°C的無菌馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基150mL，加入IOmL濃度為106cfu/mL的白色念珠菌菌懸液，振蕩錐形瓶使菌體分布均勻，形成帶菌培養(yǎng)基。用無菌移液管移取6ml帶菌培養(yǎng)基，加入到已形成下層無菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，搖晃培養(yǎng)皿使帶菌培養(yǎng)基分布整個培養(yǎng)皿，室溫下靜置10分鐘后，形成上層帶菌培養(yǎng)基。在培養(yǎng)皿的反面作3個標(biāo)記，使每個標(biāo)記點與平板的周緣相距25毫米，相鄰標(biāo)記點間距離50毫米，用無菌鑷子取圓形皮革樣品貼放于上層帶菌培養(yǎng)基表面，使圓形皮革樣品的圓心位于標(biāo)記點處。培養(yǎng)48h后用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。[0027]實施例十
用打孔器取直徑為5毫米的含有溶出性抗菌劑的圓形皮革樣品。向直徑為120毫米的無菌培養(yǎng)皿中傾注12mL無菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，室溫下靜置10分鐘后，形成下層無菌培養(yǎng)基。再取45°C的無菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基150mL，加入IOmL濃度為106cfu/mL的大腸桿菌菌懸液，振蕩錐形瓶使菌體分布均勻，形成帶菌培養(yǎng)基。用無菌移液管移取6ml帶菌培養(yǎng)基，加入到已形成下層無菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，搖晃培養(yǎng)皿使帶菌培養(yǎng)基分布整個培養(yǎng)皿，室溫下靜置10分鐘后，形成上層帶菌培養(yǎng)基。在培養(yǎng)皿的反面作3個標(biāo)記，使每個標(biāo)記點與平板的周緣相距25毫米，相鄰標(biāo)記點間距離50毫米，用無菌鑷子取圓形皮革樣品貼放于上層帶菌培養(yǎng)基表面，使圓形皮革樣品的圓心位于標(biāo)記點處。培養(yǎng)24h后用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。
[0028]實施例^^一
用打孔器取直徑為5毫米的含有溶出性抗菌劑的圓形皮革樣品。向直徑為120毫米的無菌培養(yǎng)皿中傾注12mL無菌孟加拉紅培養(yǎng)基，室溫下靜置10分鐘后，形成下層無菌培養(yǎng)基。再取45°C的無菌孟加拉紅培養(yǎng)基150mL，加入IOmL濃度為106cfu/mL的粘性紅圓酵母菌懸液，振蕩錐形瓶使菌體分布均勻，形成帶菌培養(yǎng)基。用無菌移液管移取6ml帶菌培養(yǎng)基，加入到已形成下層無菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，搖晃培養(yǎng)皿使帶菌培養(yǎng)基分布整個培養(yǎng)皿，室溫下靜置10分鐘后，形成上層帶菌培養(yǎng)基。在培養(yǎng)皿的反面作2個標(biāo)記，使每個標(biāo)記點與平板的周緣相距30毫米，相鄰標(biāo)記點間距離50毫米，用無菌鑷子取圓形皮革樣品貼放于上層帶菌培養(yǎng)基表面，使圓形皮革樣品的圓心位于標(biāo)記點處。培養(yǎng)48h后用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。
[0029]實施例十二
用打孔器取直徑為5毫米的含有溶出性抗菌劑的圓形皮革樣品。向直徑為120毫米的無菌培養(yǎng)皿中傾注12mL無菌`察氏培養(yǎng)基，室溫下靜置10分鐘后，形成下層無菌培養(yǎng)基。再取45°C的無菌察氏培養(yǎng)基150mL，加入IOmL濃度為106cfu/mL的青霉菌懸液，振蕩錐形瓶使菌體分布均勻，形成帶菌培養(yǎng)基。用無菌移液管移取6ml帶菌培養(yǎng)基,加入到已形成下層無菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，搖晃培養(yǎng)皿使帶菌培養(yǎng)基分布整個培養(yǎng)皿，室溫下靜置10分鐘后，形成上層帶菌培養(yǎng)基。在培養(yǎng)皿的反面作2標(biāo)記，使每個標(biāo)記點與平板的周緣相距30毫米，相鄰標(biāo)記點間距離50毫米，用無菌鑷子取圓形皮革樣品貼放于上層帶菌培養(yǎng)基表面，使圓形皮革樣品的圓心位于標(biāo)記點處。培養(yǎng)48h后用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。
[0030]為了考察本發(fā)明方法的適用性，發(fā)明人根據(jù)2002年中華人民共和國衛(wèi)生部頒布的《消毒技術(shù)規(guī)范》抑菌環(huán)實驗要求，判定了各實施例的抗菌性能，其中，當(dāng)抑菌環(huán)寬度大于I毫米者，判為有抑菌作用。各實施例的實驗判定結(jié)果見表1。
[0031]表1
【權(quán)利要求】
1.一種評價含有溶出性抗菌劑皮革抗菌性能的改良暈圈法，其特征在于該方法通過以下步驟實施: ⑴向直徑為120毫米的無菌培養(yǎng)皿中傾注12mL無菌培養(yǎng)基，室溫下靜置10分鐘后，形成下層無菌培養(yǎng)基； ⑵用無菌移液管移取6ml帶菌培養(yǎng)基，加入到步驟(1)所得的下層無菌培養(yǎng)基中，搖晃培養(yǎng)皿使帶菌培養(yǎng)基分布整個培養(yǎng)皿，室溫下靜置10分鐘后，形成上層帶菌培養(yǎng)基； ⑶在培養(yǎng)皿反面作2-5個標(biāo)記，使得每個標(biāo)記點與平板周緣相距20毫米以上，相鄰標(biāo)記點間距離大于40毫米，用無菌鑷子取直徑為5毫米的圓形皮革樣品貼放于上層帶菌培養(yǎng)基表面，使皮革樣品的圓心位于標(biāo)記點處； ⑷將步驟(3)所得的接種有試驗菌的培養(yǎng)皿放于恒溫培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)24h或48h后，通過游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測量抑菌圈直徑即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于評價含有溶出性抗菌劑皮革抗菌性能的改良暈圈法，其特征在于，所述帶菌培養(yǎng)基的制備方法為:取45°C的無菌培養(yǎng)基150mL，加入IOmL濃度為106cfu/mL的試驗菌菌懸液，振蕩錐形瓶使菌體分布均勻。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于評價含有溶出性抗菌劑皮革抗菌性能的改良暈圈法，其特征在于，培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基中的任意一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于評價含有溶出性抗菌劑皮革抗菌性能的改良暈圈法，其特征在于，試驗菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、青霉、白色念珠菌、粘性紅圓酵母中的任意一種。`
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于評價含有溶出性抗菌劑皮革抗菌性能的改良暈圈法，其特征在于，每個標(biāo)記點與平板周緣相距20-30毫米，相鄰標(biāo)記點間相距40-50毫米。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于評價含有溶出性抗菌劑皮革抗菌性能的改良暈圈法，其特征在于，將接種有細菌的培養(yǎng)皿放于37°C的恒溫培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)24h ;接種有真菌的培養(yǎng)皿放于28 °C的恒溫培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)48h。
【文檔編號】C12R1/685GK103525897SQ201310467692
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月10日
【發(fā)明者】陳武勇, 唐秋月, 辜海彬, 孫婷, 張金偉, 滕博, 孔麗麗 申請人:四川大學(xué)