高基因敲除效率的謝瓦氏曲霉間型變種工程菌株的構建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高基因敲除效率的謝瓦氏曲霉間型變種工程菌株的構建方法，本發(fā)明由克隆ku70基因3’端和5’端DNA片段，構建ku70基因敲除載體，根癌農桿菌介導的轉化，ku70基因敲除突變菌株的鑒定，本發(fā)明獲得的謝瓦氏曲霉間型變種的工程菌株與親本謝瓦氏曲霉間型變種相比，生長速率略慢，其他表型未見明顯變化，并且遺傳穩(wěn)定，可以作為受體菌株進行基因功能的敲除驗證。本發(fā)明的謝瓦氏曲霉間型變種的工程菌株作為受體菌株，基因敲除效率較高，易于獲得基因敲除突變菌株，減少了繁重的篩選工作。
【專利說明】高基因敲除效率的謝瓦氏曲霉間型變種工程菌株的構建方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物技術，尤其是一種高基因敲除效率的謝瓦氏曲霉間型變種工程菌株的構建方法。
【背景技術】
[0002]謝瓦氏曲霉間型變種俗稱“金花”菌，是茯磚茶發(fā)花過程中的優(yōu)勢菌種，其閉囊殼即“金花”數量決定著茯磚茶的品質(彭小贊，趙運林，何小書，雷存喜，劉石泉，周曉梅，董萌，胡志遠2011)。目前，謝瓦氏曲霉間型變種的命名還存在爭議，這可能是由于取材和鑒定方法的差異造成的(丁婷，呂嘉櫪2012;胡治遠，趙運林，劉石泉，李燕子，許永立2012)，其中1990年劉作易等采用電鏡的方法將“金花”菌鑒定為謝瓦氏曲霉間型變種(劉作易，秦京，王迺亮1990)。茯磚茶是一種重要的“邊銷茶”，在西南和西北少數民族地區(qū)很受歡迎。謝瓦氏曲霉間型變種在茯磚茶上生長使茯磚茶具有一定的保健功能，主要體現在降脂減肥、促進消化、抗腫瘤功能和安全性可靠等方面(鄧放明，龔舒莉，楊偉麗2007;黃群，陳林杰，李顏坡， 車科2007; 丁婷，呂嘉櫪，侯蓓2011;袁勇2011)。謝瓦氏曲霉間型變種在低滲條件下培養(yǎng)只產生子囊孢子，在高滲條件下培養(yǎng)只產生分生孢子，是研究絲狀真菌有性繁殖和無性繁殖發(fā)生機制的良好材料(劉作易，秦京，李乃亮1991)。因此，對謝瓦氏曲霉間型變種展開分子生物學研究既具有生產價值有具有理論意義。目前，謝瓦氏曲霉間型變種的分子生物學研究工作主要包括構建了根癌農桿菌介導的遺傳轉化體系和基因表達的差減文庫以及產孢相關基因的克隆(馬權，劉永翔，劉作易2011;王海，譚玉梅，劉永翔，王階平，劉作易2012;譚玉梅，王海，劉永翔，劉作易2013)。謝瓦氏曲霉間型變種有性產孢相關基因功能的研究工作以及全基因組和轉錄組測序工作已經開展。然而，較低的基因敲除效率阻礙了謝瓦氏曲霉間型變種的基因功能的研究工作。
[0003]作為外源DNA片段，基因敲除盒是通過DSBs修復機制整合到宿主細胞基因組上的。真核細胞的DSBs修復主要有兩個途徑:同源重組(homologous recombination,HR)和非同源末端交聯(non-homologous end joining, NHEJ)。HR需要同源序列，當基因敲除盒通過HR途徑整合到宿主細胞基因組上時便發(fā)生基因敲除。NHEJ不依賴同源序列，基因敲除盒通過NHEJ隨機整合到宿主細胞基因組。一般認為，NHEJ與HR是競爭的，主要體現在Ku蛋白對HR的抑制(Krappmann 2007; Kass and Jasin 2010)。絲狀真菌偏愛NHEJ途徑，因此基因敲除效率較低。為提高HR的頻率，得到較高的基因敲除效率，通常采用阻斷NHEJ途徑的策略，主要是敲除NHEJ途徑的關鍵基因ku70或ku80。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是:提供一種高基因敲除效率的謝瓦氏曲霉間型變種工程菌株的構建方法，通過本發(fā)明獲得的工程菌株的基因敲除效率較高，能減少從大量轉化子中獲得基因敲除突變菌株的篩選工作。[0005]本發(fā)明是這樣實現的:高基因敲除效率的謝瓦氏曲霉間型變種工程菌株的構建方法，具體包括以下步驟:
步驟(1):以謝瓦氏曲霉間型變種基因組DNA為模板，采用引物P12和P13擴增Ku70基因3’端DNA片段D，用引物PlO和Pll擴增Ku70基因5’端DNA片段U ;引物對P12的序列為 5’ -CTAGTCTAGACCCGACAAGCCTGAGGACAA-3’；引物對 P13 的序列為 5’ -TCCTGAGCTCACGCTCTCTTCTATCAGACCCT-3’；引物 PlO 的序列為 5’ -CCCAAGCTTTCAACCACCACCATCCGTCTC-3’ ；引物Pll 的序列為 5’ -CGGAATTCAATGTGACCTGCTCGCCTCC-3’ ；
步驟(2):Xba I和Sac I雙酶切DNA片段D和質粒pDHt/sknt，純化后連接得到重組質粒pDHt/sknt-D ；Hind III和EcoR I雙酶切DNA片段U和質粒pDHt/sknt_D，純化后連接得到重組質粒pDHt/sknt-D-U，即為ku70基因敲除載體；
步驟(3):將Ku70基因敲除載體通過凍融法轉入根癌農桿菌LBA4404菌株；含正確Ku70基因敲除載體的根癌農桿菌LBA4404菌株在含50 μ g/ml卡那霉素的LB平板上劃線，在28°C下培養(yǎng)48h ;挑取根癌農桿菌單菌落接種于含50 μ g/ml卡那霉素的基礎培養(yǎng)基中，在28°C下，220r/min培養(yǎng)48h ;取l_2ml菌液用誘導培養(yǎng)基稀釋到吸光度為0.15，然后在28°C下，220 r/min誘導培養(yǎng)至0D600為0.45-0.50 ;取100 μ I誘導活化的根癌農桿菌菌液和100 μ I IX IO6個/ml的分生孢子液混勻，涂布在共培養(yǎng)培養(yǎng)基平板上，在28°C下共培養(yǎng)48h ;將融化的MYA固體培養(yǎng)基，MYA固體培養(yǎng)基含8 μ g/ml的G418以及300 μ g/ml的氨芐青霉素，均勻倒在共培養(yǎng)平板上，在28°C下培養(yǎng)至出現抗性菌落；挑取轉化子單菌落轉接到含200 μ g/ml G418的固體培養(yǎng)基平板上，MYA培養(yǎng)基中NaCl的質量百分比為5%，在28°C下培養(yǎng)5天，然后收集轉化子菌絲；
步驟(4):提取G418抗性轉化子基因組DNA，用引物P14和P15進行PCR驗證，引物P14的序列為5’ -GCGAAGAGCCTCAGATTGC-3’，引物P15的序列為5’ -GCCACTGCTTACCTTGTCTATC-3’ ；篩選出PCR產物為2611bp的轉化子菌株，初步鑒定為Ku70基因敲除突變菌株；篩選出PCR產物為261 Ibp的治/70基因敲除突變菌株；
步驟(5)制備初步鑒定為治/70基因敲除突變菌株；的分生孢子，進行單孢分離；提取單孢分離后菌株的基因組DNA，用引物P14和P15進行PCR驗證；PCR產物為2611bp的菌株初步鑒定為治/沿基因敲除突變菌株，提取基因組DNA，分別用EcoR I和Sac I酶切，然后電泳并進行 southern blot 驗證；采用弓 I物 nptF( 5，-ATCGACTCGAGATGATTGAACAAGATGGATTG-3’)和 nptRV (5，- GACGATATCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3> )，以質粒 pUR5750 為模板，制備southern blot探針；采用CTAB法提取基因組DNA，分別用EcoR I和Sac I酶切酶切基因組DNA，并進行瓊脂糖凝膠電泳；EcoR I和Sac I分別酶切基因組DNA的southern blot條帶均為一條帶，表明再次鑒定的治/沿基因敲除突變菌株為治/沿基因敲除突變菌株。
[0006]為了驗證本發(fā)明的效果進行了如下實驗:
1、材料與方法
材料:謝瓦氏曲霉間型變種菌株(GZAAS20.1004)由本實驗室分離保存。根癌農桿菌菌株LBA4404和大腸桿菌DH5 α菌株由本實驗室保存。質粒fIbA基因敲除載體pDHt/sk_FA和veA基因敲除載體pDHt/sk-VF由本實驗室保存。
[0007]方法:1根癌農桿菌介導的基因敲除
取-70°C保存的含基因敲除載體的根癌農桿菌LBA4404菌株，在含50 μ g/mL kan的LB平板上劃線，28°C培養(yǎng)48 h ;挑取根癌農桿菌單菌落接種于含50 μ g/mL kan的麗培養(yǎng)基中，28°C 220 r/min培養(yǎng)48h ;取l_2ml菌液用IM培養(yǎng)基稀釋到0D600=0.15，28°C 220r/min誘導培養(yǎng)至0D600=0.4-0.5 ;取100 μ L誘導活化的根癌農桿菌菌液和100 μ L濃度為每毫升I X IO6個的分生孢子液混勻，涂布在共培養(yǎng)培養(yǎng)基平板上，28°C共培養(yǎng)48h ;采用MYA培養(yǎng)基(60 yg/mL HygB, 300 μ g/mL Amp)做選擇培養(yǎng)基；將融化的選擇培養(yǎng)基均勻倒在共培養(yǎng)平板上，28°C培養(yǎng)至出現HygB抗性菌落；挑取轉化子單菌落轉接到含含60μ g/mL HygB的MYA (5% NaCl)平板上，28°C培養(yǎng)5天，收集菌絲。
[0008]2 veA和f IbA基因敲除菌株的鑒定
采用CTAB法提取轉化子基因組DNA，veA基因敲除菌株PCR驗證引物為P16和P17，野生型菌株的PCR產物為715bp，veA基因敲除菌株PCR產物為2153bp。flbA基因敲除菌株PCR驗證引物為P27和P28，野生型菌株的PCR產物為897bp，flbA基因敲除菌株的PCR產物為2236bp。引物P16的序列為:5，-GTCTCAGGCTGGCTACTTCA-3’ ；引物P17的序列為:5’ -TGACAGATGAGGCGAGTATGG-3’ ；引物 P27 的序列為:5’ -GCGTGCGATTCACCCGTTATG-3’ ；弓丨物 P28 的序列為:5’ -TGCTGGAGACGGGCGTTGTTC-3’。
[0009]3基因敲除效率的驗證
采用方法2中的根癌農桿菌介導的基因敲除法，分別以野生型謝瓦氏曲霉間型變種菌株和Ku70基因敲除突變菌株為受體菌株敲除veA基因和flbA菌株，并采用方法3中的方法鑒定veA基因敲除菌株和flbA基因敲除菌株。
[0010]4基因敲除效率的比較
【權利要求】
1.一種高基因敲除效率的謝瓦氏曲霉間型變種工程菌株的構建方法，其特征在于:具體包括以下步驟: 步驟(1):以謝瓦氏曲霉間型變種基因組DNA為模板，采用引物P12和P13擴增Ku70基因3’端DNA片段D，用引物PlO和Pll擴增Ku70基因5’端DNA片段U ;引物對P12的序列為 5’ -CTAGTCTAGACCCGACAAGCCTGAGGACAA-3’；引物對 P13 的序列為 5’ -TCCTGAGCTCACGCTCTCTTCTATCAGACCCT-3’；引物 PlO 的序列為 5’ -CCCAAGCTTTCAACCACCACCATCCGTCTC-3’ ；引物Pll 的序列為 5’ -CGGAATTCAATGTGACCTGCTCGCCTCC-3’ ； 步驟(2):Xba I和Sac I雙酶切DNA片段D和質粒pDHt/sknt，純化后連接得到重組質粒pDHt/sknt-D ；Hind III和EcoR I雙酶切DNA片段U和質粒pDHt/sknt_D，純化后連接得到重組質粒pDHt/sknt-D-U，即為ku70基因敲除載體； 步驟(3):將Ku70基因敲除載體通過凍融法轉入根癌農桿菌LBA4404菌株；含正確Ku70基因敲除載體的根癌農桿菌LBA4404菌株在含50 μ g/ml卡那霉素的LB平板上劃線，在28°C下培養(yǎng)48h ;挑取根癌農桿菌單菌落接種于含50 μ g/ml卡那霉素的基礎培養(yǎng)基中，在28°C下，220r/min培養(yǎng)48h ;取l_2ml菌液用誘導培養(yǎng)基稀釋到吸光度為0.15，然后在28°C下，220 r/min誘導培養(yǎng)至0D600為0.45-0.50 ;取100 μ I誘導活化的根癌農桿菌菌液和100 μ I IX IO6個/ml的分生孢子液混勻，涂布在共培養(yǎng)培養(yǎng)基平板上，在28°C下共培養(yǎng)48h ;將融化的MYA固體培養(yǎng)基，MYA固體培養(yǎng)基含8 μ g/ml的G418以及300 μ g/ml的氨芐青霉素，均勻倒在共培養(yǎng)平板上，在28°C下培養(yǎng)至出現抗性菌落；挑取轉化子單菌落轉接到含200 μ g/ml G418的固體培養(yǎng)基平板上，MYA培養(yǎng)基中NaCl的質量百分比為5%，在28°C下培養(yǎng)5天，然后收集轉化子菌絲； 步驟(4):提取G418抗性轉化子基因組DNA，用引物P14和P15進行PCR驗證，引物P14的序列為5’ -GCGAAGAGCCTCAGATTGC-3’，引物P15的序列為5’ -GCCACTGCTTACCTTGTCTATC-3’ ；篩選出PCR產物為2611bp的轉化子菌株，初步鑒定為Ku70基因敲除突變菌株；篩選出PCR產物為261 Ibp的治/70基因敲除突變菌株； 步驟(5)制備初步鑒定為治/70基因敲除突變菌株；的分生孢子，進行單孢分離；提取單孢分離后菌株的基因組DNA，用引物P14和P15進行PCR驗證；PCR產物為261 Ibp的菌株初步鑒定為治/沿基因敲除突變菌株，提取基因組DNA，分別用EcoR I和Sac I酶切，然后電泳并進行southern blot驗證；米用引物nptF和nptRV,以質粒pUR5750為模板，制備southern blot探針；采用CTAB法提取基因組DNA，分別用EcoR I和Sac I酶切酶切基因組DNA,并進行瓊脂糖凝膠電泳；EcoR I和Sac I分別酶切基因組DNA的southern blot條帶均為一條帶，表明再次鑒定的治/沿基因敲除突變菌株為治/沿基因敲除突變菌株。
【文檔編號】C12N1/15GK103525854SQ201310467876
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月10日 優(yōu)先權日:2013年10月10日
【發(fā)明者】劉作易, 曹旸, 劉永翔 申請人:貴州省生物技術研究所