一種簡(jiǎn)化的Sanger法基因測(cè)序方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種簡(jiǎn)化的Sanger法基因測(cè)序方法。本發(fā)明以熒光定量PCR和核酸純化技術(shù)為基礎(chǔ)，對(duì)Sanger法基因測(cè)序技術(shù)進(jìn)行大幅度改進(jìn)，減少了sanger法基因測(cè)序流程和操作步驟，縮短了基因測(cè)序時(shí)間。本發(fā)明測(cè)序方法操作簡(jiǎn)單、安全，同時(shí)不需要較多昂貴試劑的使用，經(jīng)濟(jì)高效；本發(fā)明測(cè)序方法能有效縮短操作時(shí)間，測(cè)序過程可在4～6小時(shí)內(nèi)完成；本發(fā)明的基因測(cè)序過程可以在96孔板或8連管中全部完成，不需要轉(zhuǎn)移試管，從而能夠有效防止污染。
【專利說明】—種簡(jiǎn)化的Sanger法基因測(cè)序方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種簡(jiǎn)化的Sanger法基因測(cè)序方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在分子生物學(xué)研究中，DNA的序列分析是進(jìn)一步研究和改造目的基因的基礎(chǔ)。目前用于DNA測(cè)序的技術(shù)主要有Frederick Sanger發(fā)明的Sanger雙脫氧鏈終止法(ChainTermination Method)。Sanger法是根據(jù)核苷酸在某一固定的點(diǎn)開始，隨機(jī)在某一個(gè)特定的堿基處終止，并且在每個(gè)堿基后面進(jìn)行熒光標(biāo)記，產(chǎn)生以A、T、C、G結(jié)束的四組不同長度的一系列核苷酸，這樣就形成了大量末端被突光標(biāo)記的、長短不一(終止位點(diǎn)不同)的延伸產(chǎn)物。接著，再用高分辨率的毛細(xì)管凝膠電泳分離這些延伸產(chǎn)物，通過對(duì)延伸產(chǎn)物末端四種不同熒光顏色的區(qū)分，計(jì)算機(jī)軟件會(huì)自動(dòng)“讀出”DNA序列，從而獲得可見的DNA堿基序列。Sanger基因測(cè)序技術(shù)經(jīng)過了 30年的不斷發(fā)展與完善，現(xiàn)在已經(jīng)可以對(duì)長達(dá)1，OOObp的DNA片段進(jìn)行測(cè)序，而且對(duì)每一個(gè)堿基的讀取準(zhǔn)確率高達(dá)99.999%。由于具有很高的讀取準(zhǔn)確率，Sanger法測(cè)序成為基因突變、單核苷酸多態(tài)性等基因分析的金標(biāo)準(zhǔn)。但是由于Sanger法測(cè)序前需要對(duì)樣本進(jìn)行前期處理，處理時(shí)間長，操作步驟多，處理過程中容易造成污染，從而限制了 Sanger法基因測(cè)序在臨床中的使用。
[0003]因此,本領(lǐng)域迫切需求開發(fā)Sanger法測(cè)序流程簡(jiǎn)化方案,用于減少Sanger法測(cè)序流程，縮短Sanger法測(cè)序時(shí)間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)化的Sanger法基因測(cè)序方法，本發(fā)明以熒光定量PCR和核酸純化技術(shù)為基礎(chǔ),對(duì)Sanger法基因測(cè)序技術(shù)進(jìn)行大幅度改進(jìn),減少了 sanger法基因測(cè)序流程和操作步驟，縮短了基因測(cè)序時(shí)間。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0006]一種簡(jiǎn)化的Sanger法基因測(cè)序方法，它包括如下步驟:
[0007](I)目的基因熒光定量PCR擴(kuò)增:采用熒光定量聚合酶連反應(yīng)，得到目的基因的定量結(jié)果和PCR產(chǎn)物；
[0008](2)根據(jù)步驟(1)中的定量結(jié)果，對(duì)步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化并對(duì)純化后的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序PCR反應(yīng):在步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物中加入核酸外切酶I和堿性磷酸酶的混合液，混合均勻后，再加入封閉液體，然后在封閉液體上加入測(cè)序引物、Bigdye和Bigdye buffer,運(yùn)行PCR程序，得到測(cè)序PCR產(chǎn)物；
[0009](3)利用磁珠法對(duì)步驟(2)得到的測(cè)序PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到純化后的測(cè)序PCR產(chǎn)物；
[0010](4)將步驟(3)純化后的測(cè)序PCR產(chǎn)物加樣至測(cè)序儀進(jìn)行序列分析。
[0011 ] 上述方案中，步驟(1)所述熒光定量PCR擴(kuò)增中，上游引物5 ’端插入通用M13序列:TGTAAAACGACGGCCAGT，下游引物 5’端插入通用 Ml3 序列 CAGGAAACAGCTATGACC ;步驟(2)所述的測(cè)序引物為通用序列:TGTAAAACGACGGCCAGT。
[0012]上述方案中，步驟(2)所述核酸外切酶I和堿性磷酸酶的添加量為:每微升PCR產(chǎn)物中加入IU的核酸外切酶I和0.4U的堿性磷酸酶。
[0013]上述方案中，步驟(2 )所述封閉液體為液體石蠟或其他具有相同屬性的化學(xué)物質(zhì)。
[0014]上述方案中，步驟(2)所述PCR測(cè)序程序?yàn)?37°C 15分鐘，80°C 2分鐘；96°C I分鐘；96°C 10 #,50°C 5 #,60°C 75 秒，40 個(gè)循環(huán)；4°C 5 分鐘。
[0015]上述方案中，步驟(3)所述的磁珠法純化測(cè)序PCR產(chǎn)物的具體過程為:向測(cè)序PCR產(chǎn)物中加入氯化鈉溶液，再加入異丙醇和磁珠，混勻后，室溫下靜置3~5分鐘，再置于磁力架靜置I~3min ;棄廢液，然后再加入體積濃度為70%的乙醇，混勻，室溫下靜置I~3min，再置于磁力架靜置I~3分鐘；棄廢液，將液體吸干后室溫下晾干；然后加入雙蒸水，混勻，60°C放置3~5min，再置于磁力架靜置I~3min ;取上清，然后將上清置于95°C，5min，再放在_20°C，5min,即得到純化后的測(cè)序PCR產(chǎn)物。
[0016]本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)化的Sanger基因測(cè)序方法，該方法可以在一個(gè)96孔板或者8連管中完成整個(gè)基因測(cè)序過程，該方法能簡(jiǎn)化操作步驟，縮短操作時(shí)間，并且能夠極大的防止污染。
[0017]本發(fā)明的有益效果:[0018](I)本發(fā)明測(cè)序方法操作簡(jiǎn)單、安全，同時(shí)不需要較多昂貴試劑的使用，經(jīng)濟(jì)高效；
[0019](2)本發(fā)明測(cè)序方法能有效縮短操作時(shí)間，測(cè)序過程可在4~6小時(shí)內(nèi)完成；
[0020](3)本發(fā)明的基因測(cè)序過程可以在96孔板或8連管中全部完成，不需要轉(zhuǎn)移試管，從而能夠有效防止污染。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為傳統(tǒng)sanger基因測(cè)序流程圖。
[0022]圖2為本發(fā)明簡(jiǎn)化的sanger基因測(cè)序流程圖。
[0023]圖3為實(shí)施例1熒光定量PCR擴(kuò)增曲線。
[0024]圖4為實(shí)施例1測(cè)序結(jié)果峰圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖、實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)例。
[0026]實(shí)施例1
[0027]1、引物探針的合成
[0028]對(duì)EGFR基因18、19、20和21外顯子設(shè)計(jì)引物和探針，用人工合成的方法合成如下引物和探針:
[0029]EGFR18F:TTGTCTCTGTGTTCTTGTCCC
[0030]EGFR18R:TTCCCAAACACTCAGTGAAAC
[0031 ] EGFR18P:FAM-CCCAGCTTGTGGAGCCTCTTACACCC-BHQl
[0032]EGFR19F:ACATTATCAGGCTTAGGTGCG[0033]EGFR19R:CAGACAGTAGAAAAGGTGGGC
[0034]EGFR19P:FAM-CTCCACAGCCCCAGTGTCCCTCA-BHQ1
[0035]EGFR20F:TCCCTGTGCTAGGTCTTTTG
[0036]EGFR20R:TCCCTTCCCTGATTACCTTT
[0037]EGFR20P:FAM-CGATCTGCACACACCAGTTGAGC-BHQl
[0038]EGFR21F:CTTTCATGCGCCTTTCCAT
[0039]EGFR2IR:GCCACCTCCTTACTTTGCCT
[0040]EGFR21P:FAM-ACGTTCGCCAGCCATAAGTCCTCG-BHQl
[0041]上述引物和探針序列均為5’端至3’端，F(xiàn)表示上游引物，R表示下游引物，P表示探針，F(xiàn)AM表示探針中熒光基團(tuán)，BHQl表示淬滅基團(tuán)。所有的上游引物5’端均添加通用序列:TGTAAAACGACGGCCAGT，下游引物 5’ 端均添加通用序列:CAGGAAACAGCTATGACC。
[0042]2、檢測(cè)樣本DNA的熒光定量PCR擴(kuò)增
[0043](I)提取樣本DNA:采用Qiagen公司商品化石蠟DNA提取試劑盒，提取樣本DNA的具體步驟如下:
[0044]1.1從石蠟樣本切8片左右8~10 μ m厚的石蠟切片，放入1.5ml離心管中；
[0045]1.2加入Iml 二 甲苯，蓋上離心管蓋，渦旋混勻至蠟明顯的溶解，室溫，4000rpm，離心2min，用移液器小心棄上 清，注意不要將組織去掉；
[0046]1.3加入Iml無水乙醇，渦旋混勻(乙醇將殘留的二甲苯去掉)，14000rpm，離心2min,用移液器小心棄上清，注意不要將組織去掉；
[0047]1.4室溫(15~25°C)晾干或37°C金屬浴烘干殘留的乙醇；
[0048]1.5加入180 μ I ATL (檢測(cè)是否有沉淀出現(xiàn)，沉淀使用70°C水浴溶解)緩沖液混勻，再加入20 μ I蛋白酶K，渦旋混勻；
[0049]1.656°C水浴Ih以上(最好過夜)，直至樣本被完全裂解(中途可以震蕩幾次)；
[0050]1.790°C水浴Ih (加ATL緩沖液90°C保溫，在一定程度上可以修復(fù)甲醛對(duì)核酸結(jié)構(gòu)的改變，但是保溫時(shí)間過長或溫度過高，會(huì)導(dǎo)致DNA斷裂。如果只有一個(gè)加熱器，56°C結(jié)束后將樣品放在室溫，等溫度升至90°C后再將樣品放入加熱器)；
[0051]1.8短暫離心，加入200 μ I的AL緩沖液(檢測(cè)是否有沉淀出現(xiàn)，沉淀使用70°C水浴溶解)，渦旋混勻；然后加入200 μ I無水乙醇，渦旋混勻(樣本、AL緩沖液和乙醇的混勻要迅速，如果同時(shí)提取大量樣本，可以先將AL緩沖液和乙醇混合，然后一起加入樣本混勻)；
[0052]1.9短暫離心，將全部裂解物轉(zhuǎn)移至試劑盒提供的純化柱中(純化柱裝入2ml的收集管中)，蓋上收集管蓋，8000rpm離心lmin，將純化柱放入新的收集管中；
[0053]1.10向純化柱加入500 μ I AWl緩沖液(檢查AWl中是否已經(jīng)加入乙醇)，蓋上收集管蓋，8000rpm離心lmin，倒掉收集管中液體，將純化柱放入收集管中；
[0054]1.11向純化柱加入500 μ I AW2緩沖液(檢查AW2中是否已經(jīng)加入乙醇)，蓋上收集管蓋，8000rpm離心lmin，倒掉收集管中液體，將純化柱放入收集管中；
[0055]1.1214000rpm離心3min，使純化柱膜完全干燥(可以考慮室溫開蓋放置2~5分鐘以便充分干燥);
[0056]1.13純化柱放入新的滅菌的1.5ml離心管中(自備)，向純化柱膜正中加入20~100 μ I ATE或ddH20，室溫放置2~5min，14000rpm離心lmin，收集液體即得到石蠟樣本DNA, 4°C保存，長期存放放置在_20°C。
[0057](2)利用上述合成的上游引物、下游引物和探針，采用熒光定量PCR擴(kuò)增樣本DNA，得到熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，PCR反應(yīng)體系(5 μ I)為:
【權(quán)利要求】
1.一種簡(jiǎn)化的Sanger法基因測(cè)序方法，其特征在于，包括如下步驟: (I)目的基因熒光定量PCR擴(kuò)增:采用熒光定量聚合酶連反應(yīng)，得到目的基因的熒光定量結(jié)果和PCR產(chǎn)物； (2 )根據(jù)步驟(1)中的定量結(jié)果，對(duì)步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化并對(duì)純化后的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序PCR反應(yīng):在步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物中加入核酸外切酶I和堿性磷酸酶，混合均勻后，再加入封閉液體，然后在封閉液體上加入測(cè)序引物、Bigdye和Bigdye緩沖液,運(yùn)行PCR程序，得到測(cè)序PCR產(chǎn)物； (3)利用磁珠法對(duì)步驟(2)得到的測(cè)序PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到純化后的測(cè)序PCR產(chǎn)物； (4)將步驟(3)純化后的測(cè)序PCR產(chǎn)物加樣至測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因測(cè)序方法，其特征在于步驟(2)所述核酸外切酶I和堿性磷酸酶的添加量為:每微升PCR產(chǎn)物中加入IU的核酸外切酶I和0.4U的堿性磷酸酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因測(cè)序方法，其特征在于步驟(2)所述 封閉液體為液體石臘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因測(cè)序方法，其特征在于步驟(2)所述PCR程序?yàn)?37°C15分鐘，80°C 2分鐘；96°C I分鐘；96°C 10秒，50°C 5秒，60°C 75秒，40個(gè)循環(huán)；4°C 5分鐘。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因測(cè)序方法，其特征在于步驟(1)所述熒光定量PCR擴(kuò)增中，上游引物5’端插入通用M13序列:TGTAAAACGACGGCCAGT，下游引物5’端插入通用M13序列CAGGAAACAGCTATGACC ;步驟(2)所述的測(cè)序引物為通用序列:TGTAAAACGACGGCCAGT。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因測(cè)序方法，其特征在于步驟(3)所述的磁珠法純化測(cè)序PCR產(chǎn)物的具體過程為:向測(cè)序PCR產(chǎn)物中加入氯化鈉溶液，再加入異丙醇和磁珠，混勻后，室溫下靜置3~5分鐘，再置于磁力架靜置I~3min ;棄廢液，然后再加入體積濃度為70%的乙醇，混勻，室溫下靜置I~3min，再置于磁力架靜置I~3分鐘；棄廢液，將液體吸干后室溫下晾干；然后加入雙蒸水，混勻，60°C放置3~5min，再置于磁力架靜置I~3min ;取上清，然后將上清置于95°C，5min,再放在_20°C，5min,即得到純化后的測(cè)序PCR產(chǎn)物。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103484552SQ201310469440
【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月9日
【發(fā)明者】葉倫, 李雪梅, 付金玲, 陳剛 申請(qǐng)人:武漢康錄生物技術(shù)有限公司