小麥矮縮病毒的快速可視化檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了小麥矮縮病毒的快速可視化檢測(cè)方法，包括下述步驟：1)提取步驟：從待檢查標(biāo)本提取DNA；2)擴(kuò)增步驟：使用引物，以步驟1)的DNA為模板，通過(guò)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法進(jìn)行DNA的擴(kuò)增反應(yīng)；3)判斷步驟：檢測(cè)所述擴(kuò)增步驟中是否包含小麥矮縮病毒堿基序列判斷是否存在小麥矮縮病毒。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)便，快速，能夠高通量提取和檢測(cè)DNA，進(jìn)行小麥矮縮病毒的可視化檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】小麥矮縮病毒的快速可視化檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及小麥矮縮病毒，尤其涉及小麥矮縮病毒的檢測(cè)方法，屬于農(nóng)業(yè)生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]小麥矮縮病毒，即Wheat dwarf virus (WDV),是屬于聯(lián)體病毒科玉米線條病毒屬的DNA病毒。已知小麥矮縮病毒的宿主包括小麥(Triticumaestivum)、大麥(Hordeumvulgare)、燕麥(Avena sativa)和多種雜草，由異沙葉蟲(chóng)單(PsammotettixalienusDahlb)以持久性非增殖方式傳播。感染了小麥矮縮病毒的小麥植株矮縮、黃化、條斑。發(fā)病嚴(yán)重的植株在拔節(jié)前即死亡，發(fā)病較輕的植株雖能拔節(jié)，但多不抽穗，即使抽穗，籽粒也不實(shí)。拔節(jié)前的小麥?zhǔn)艿絎DV侵染會(huì)造成植株矮縮，重者僅10cm，且植株不再增高。拔節(jié)后的小麥?zhǔn)芮秩緯?huì)造成分蘗長(zhǎng)短不一，根部產(chǎn)生眾多的小分蘗，因此小麥矮縮病毒會(huì)給植株帶來(lái)上述諸多損害，對(duì)小麥矮縮病毒的及時(shí)殺滅或拔除感染了小麥矮縮病毒的植株就顯得尤為必要，在這之中如何準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)、發(fā)現(xiàn)小麥矮縮病毒是重中之重。
[0003]傳統(tǒng)的用來(lái)檢測(cè)小麥矮縮病毒的方法包括FLISA法、POR法，采用FLISA法進(jìn)行小麥矮縮病毒檢測(cè)包括以下步驟:在固相化有特異性地識(shí)別小麥矮縮病毒的一級(jí)抗體的微孔板中，使檢查標(biāo)本中所含的小麥矮縮病毒粒子和一級(jí)抗體反應(yīng)的步驟；清洗未與一級(jí)抗體結(jié)合的檢查標(biāo)本中的成分的步驟；使與一級(jí)抗體結(jié)合的小麥矮縮病毒粒子和經(jīng)酶標(biāo)且特異性地識(shí)別小麥矮縮病毒的二級(jí)抗體反應(yīng)的步驟；清洗未與小麥矮縮病毒粒子結(jié)合的二級(jí)抗體的步驟；使酶標(biāo)于二級(jí)抗體的酶和化學(xué)顯色底物或化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行酶反應(yīng)的步驟；根據(jù)通過(guò)酶反應(yīng)得到的顯色或發(fā)光的強(qiáng)度，估計(jì)小麥矮縮病毒粒子的量的步驟，F(xiàn)LISA法反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，靈敏度低，檢測(cè)對(duì)象為蛋白質(zhì)，不是核酸，因此并不能準(zhǔn)確斷定所檢測(cè)對(duì)象是否為小麥矮縮病毒。
[0004]采用POR法進(jìn)行小麥矮縮病毒檢測(cè)包括以下步驟:在POR管中加入反應(yīng)緩沖液、弓丨物、dNTPs、DNA聚合酶和擴(kuò)增模板，將混合好的反應(yīng)液置于POR儀中進(jìn)行核酸擴(kuò)增，取部分?jǐn)U增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將瓊脂糖凝膠進(jìn)行溴化乙錠染色和脫色，在UV照射下觀察POR擴(kuò)增條帶。采用POR法反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，不適合高通量檢測(cè)，需要復(fù)雜昂貴的儀器設(shè)備，溴化乙錠污染實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。
[0005]傳統(tǒng)技術(shù)中，通常采用CTAB法進(jìn)行小麥組織核酸提取，包括將小麥組織液氮冷卻，經(jīng)冷卻的小麥組織研磨破碎，破碎的小麥組織加入提取緩沖液后水浴加熱，提取液經(jīng)離心后采用酚和氯仿進(jìn)行抽提，抽提后的緩沖液加入乙醇低溫沉淀然后離心分離、洗脫、溶解核酸，采用此種方法反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，過(guò)程復(fù)雜。
[0006]由上述可見(jiàn)， 在現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)于小麥矮縮病毒的提取、檢測(cè)過(guò)程均存在一定缺陷，無(wú)法滿足應(yīng)用需要。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明公開(kāi)了一種小麥矮縮病毒的檢測(cè)方法，通過(guò)將等溫的基因擴(kuò)增反應(yīng)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)應(yīng)用于擴(kuò)增小麥矮縮病毒的編碼蛋白質(zhì)基因的特定區(qū)域，可以簡(jiǎn)便、快捷、高通量、高靈敏度地進(jìn)行小麥矮縮病毒的檢測(cè)。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的的，本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0009]小麥矮縮病毒的快速可視化檢測(cè)方法，包括下述步驟:1)提取步驟:從待檢查標(biāo)本提取DNA ；2)擴(kuò)增步驟:使用引物，以步驟I)的DNA為模板，通過(guò)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法進(jìn)行DNA的擴(kuò)增反應(yīng)；3)判斷步驟:檢測(cè)所述擴(kuò)增步驟中是否包含小麥矮縮病毒堿基序列判斷是否存在小麥矮縮病毒。
[0010]在本發(fā)明中，待檢查標(biāo)本是指可能存在小麥矮縮病毒感染的小麥等植物的機(jī)能組織，例如小麥的葉、莖和穗等，獲得待檢查標(biāo)本的時(shí)間并不受到限制，栽培時(shí)、采樣時(shí)和保存時(shí)等均可。
[0011]在本發(fā)明中，提取步驟用來(lái)提取存在于被細(xì)胞壁包圍的植物細(xì)胞的小麥矮縮病毒的DNA，可以通過(guò)各種方式進(jìn)行提取，例如可以通過(guò)在蒸餾水或具有弱堿性的pH的緩沖液中將待檢查標(biāo)本以物理方式勻漿,從而提取標(biāo)本的DNA。
[0012]適用于上述方法的緩沖液，其pH優(yōu)選pH8.0-9.5，包括但不限于Tris /鹽酸緩沖液、Tris /醋酸緩沖液、磷酸緩沖液、碳酸緩沖液、硼酸緩沖液等。
[0013]除上述方法外，任何適用于生物學(xué)領(lǐng)域從植物中獲取DNA的方法均可適用于本發(fā)明，這些方法可參考《分子克隆(Molecular donging)》(Maniatis等，1989年,冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)等記載的基因工程實(shí)驗(yàn)方案，從而可以高效的從檢查標(biāo)本提取小麥矮縮病毒的DNA。
[0014]為了有效的擴(kuò)增所提取的DNA，擴(kuò)增步驟所用引物為包含下述四種堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸的引物組:
[0015]WDV-FIP 引物，T0GATG0GA0CAAGCA0GTTGTA0GATG0CTTGGAATCTGC;
[0016]WDV-BIP 引物，AGGAAGTGGAA0GTGAA0CTTGCTA00CAGTTGTAG0GTTGG ；
[0017]WDV-F3 引物，GTOCAOGATATTCTTGOOGA ；
[0018]WDV-B3 引物，OCAGAOGOCACTGACATC。
[0019]通過(guò)上述引物組，以DNA為模板，反復(fù)進(jìn)行采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法的等溫基因擴(kuò)增反應(yīng)。
[0020]在上述引物中，WDV-FIP引物為FlP引物，基于如下原則進(jìn)行設(shè)計(jì):在3’末端側(cè)具有作為與F2c區(qū)域互補(bǔ)的序列的F2區(qū)域，在5’末端側(cè)具有作為與Blc區(qū)域相同的序列。
[0021]在上述引物中，WDV-BIP引物為BlP引物，基于如下原則進(jìn)行設(shè)計(jì):在3’末端側(cè)具有作為與B2c區(qū)域互補(bǔ)的序列的B2區(qū)域，在5’末端側(cè)具有與Blc區(qū)域相同的序列。
[0022]在上述引物中，WDV-F3引物為F3引物，基于如下原則進(jìn)行設(shè)計(jì):具有作為與F3c區(qū)域互補(bǔ)的序列的F3區(qū)域。
[0023]在上述引物中，WDV-B3引物為B3引物，基于如下原則進(jìn)行設(shè)計(jì):具有作為與B3c區(qū)域互補(bǔ)的序列的B3區(qū)域。
[0024]通過(guò)上述引物組，可以快速、有效、大量的擴(kuò)增所提取的DNA。
[0025]在本發(fā)明的擴(kuò)增步驟中，采用LAMP法的DNA的擴(kuò)增反應(yīng)如下進(jìn)行即可:將含有提取步驟中所提取的DNA、使用上述包含4種寡核苷酸的引物組、鏈置換型DNA聚合酶、dNTPs (dATP、dTTP、dGTP、dCTP)和緩沖液的反應(yīng)液在等溫條件下靜置一定時(shí)間。
[0026]上述的溫度，為50-75 °C，優(yōu)選60-65 °C，最優(yōu)選是65 °C。
[0027]上述的靜置時(shí)間在15分鐘以上就可檢出DNA的擴(kuò)增，優(yōu)選15分鐘-60分鐘，更優(yōu)選20分鐘-40分鐘。
[0028]上述所用的鏈置換型DNA聚合酶、dNTPs和緩沖液，是本領(lǐng)域技術(shù)人員使用LAMP法進(jìn)行堿基序列擴(kuò)增時(shí)所通用的，可以使用已有的商業(yè)成品，例如Loopamp DNA擴(kuò)增試劑盒(榮研化學(xué)株式會(huì)社制)既包含上述各種試劑。
[0029]在完成DNA的擴(kuò)增后，小麥矮縮病毒的基因組DNA的靶區(qū)域的部分序列的DNA是通過(guò)采用上述引物組的LAMP法被反復(fù)擴(kuò)增的核心序列。與此核心序列互補(bǔ)的小麥矮縮病毒的基因組DNA的堿基序列，以及由上述4寡核苷酸分別退火結(jié)合的小麥矮縮病毒的基因組DNA的堿基序列，為小麥矮縮病毒的編碼蛋白質(zhì)基因的部分序列，包含這些堿基序列的小麥矮縮病毒的基因組DNA的區(qū)域適合作為用于通過(guò)LAMP法擴(kuò)增DNA的靶區(qū)域。因此，通過(guò)確認(rèn)是否有被擴(kuò)增的DNA，可以特異性地檢測(cè)小麥矮縮病毒的存在。
[0030]小麥矮縮病毒的有無(wú)的判斷可以采用如下多種方法進(jìn)行:
[0031]1.在用于判斷步驟的反應(yīng)開(kāi)始前將SYBRGreen I染料加入反應(yīng)液中，通過(guò)肉眼觀察進(jìn)行采樣LAMP法的DNA的擴(kuò)增反應(yīng)后的反應(yīng)液，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)液產(chǎn)生綠色的情況下，判斷為存在小麥矮縮病毒；發(fā)現(xiàn)反應(yīng)液保持橙紅色的情況下，判斷為不存在小麥矮縮病毒。通過(guò)在反應(yīng)前加入染料，有效避免了反應(yīng)后開(kāi)蓋，降低了由于開(kāi)蓋而使LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室環(huán)境導(dǎo)致的假陽(yáng)性污染。
[0032]2.在UV照射下發(fā)現(xiàn)綠色熒光的情況下，判斷為存在小麥矮縮病毒；未發(fā)現(xiàn)綠色熒光的情況下，判斷為不存在小麥矮縮病毒。
`[0033]3.將所擴(kuò)增的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在存在多條梯形條帶這種LAMP特征性條帶的情況下，判斷為存在小麥矮縮病毒；只存在單一條帶的情況，或者不存在任何條帶的情況下，判斷為不存在小麥矮縮病毒。
[0034]在上述方法中，優(yōu)選采用方法3，其判斷結(jié)果更加細(xì)致。
[0035]進(jìn)一步的，為了快速實(shí)現(xiàn)小麥矮縮病毒的擴(kuò)增和檢測(cè)，可以將本發(fā)明的小麥矮縮病毒的檢測(cè)方法所需的各種試劑類預(yù)先封裝而試劑盒化。具體來(lái)說(shuō)，能夠以試劑盒的形式提供包含上述4種寡核苷酸的引物組、作為核酸合成的底物的4種dNTPs (dATP、dTTP、dGTP、dCTP)、具有鏈置換活性的鏈置換型DNA聚合酶、提供適于酶反應(yīng)的條件的緩沖液，此外還可以加入作為輔助因子的鹽類(鎂鹽或錳鹽等)、根據(jù)需要采用的反應(yīng)生成物的檢測(cè)所需的試劑類。
[0036]上述的試劑盒，可以是完全獨(dú)立生產(chǎn)的，也可以采用現(xiàn)有的試劑盒，例如將上述引物組加入Loopamp DNA擴(kuò)增試劑盒中即可作為本發(fā)明的試劑盒。
[0037]進(jìn)一步的，上述試劑盒中可以包含用于確認(rèn)LAMP反應(yīng)通過(guò)本發(fā)明的引物正常地進(jìn)行的陽(yáng)性對(duì)照。作為陽(yáng)性對(duì)照，例如可以包含被本發(fā)明的引物擴(kuò)增的區(qū)域的DNA。
[0038]通過(guò)本發(fā)明提供的檢測(cè)方法，不僅能夠簡(jiǎn)便，快速，高通量提取DNA，而且能夠快速，高靈敏度，高通量檢測(cè)核酸；本發(fā)明提供的試劑盒閉蓋，在不污染的LAMP產(chǎn)物的情況下實(shí)現(xiàn)了小麥矮縮病毒的可視化檢測(cè)?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】
[0039]圖1是小麥矮縮病毒的基因組DNA的靶區(qū)域的位置關(guān)系圖。
[0040]圖2為采用本發(fā)明的LAMP法和現(xiàn)有技術(shù)的POR法進(jìn)行小麥矮縮病毒的檢測(cè)的結(jié)果;
[0041]圖3為采用本發(fā)明檢測(cè)方法檢測(cè)存在和不存在小麥矮縮病毒的檢測(cè)結(jié)果圖像?！揪唧w實(shí)施方式】
[0042]實(shí)施例1:采用 本發(fā)明的發(fā)明檢測(cè)小麥矮縮病毒
[0043]I)小麥矮縮病毒的檢測(cè)中使用的小麥組織樣品的制備
[0044]將從感染小麥矮縮病毒的小麥葉片(新鮮或冰凍材料)作為小麥矮縮病毒的檢測(cè)用標(biāo)本，將無(wú)病毒的小麥葉片(新鮮或冰凍材料)作為對(duì)照檢測(cè)標(biāo)本，由這些標(biāo)本分別制備小麥組織樣品。
[0045]取以上小麥組織樣品IOmg左右，放入200 μ LPOR管或者POR八連管中。以上步驟應(yīng)在冰上進(jìn)行操作。每管中加入70 μ L緩沖液Α,蓋上管蓋后立刻將POR管或POR八連管放入POR儀中加熱到95°C，加熱時(shí)間為10分鐘。加熱結(jié)束后從POR儀中取出POR管或POR八連管，迅速加入等體積的緩沖液B，振蕩混勻后瞬時(shí)離心，使葉片等殘?jiān)恋淼焦艿撞?，上清即為制備得到的DNA試樣。
[0046]2)引物
[0047]引物采用作為FIP引物的WDV-RP引物、作為BIP引物的WDV-BIP引物、作為F3引物的WDV-F3引物、作為B3引物的WDV-B3引物。通過(guò)使用這4種引物進(jìn)行采樣LAMP法的DNA的擴(kuò)增反應(yīng)，可以擴(kuò)增包含作為小麥矮縮病毒的編碼蛋白質(zhì)基因的DNA的部分序列的喊基序列的DNA。
[0048]3) DNA 的擴(kuò)增
[0049]采樣LMAP法的DNA的擴(kuò)增使用Loopamp DNA擴(kuò)增試劑盒(榮研化學(xué)株式會(huì)社制)進(jìn)行。具體來(lái)說(shuō)，按照制造商的實(shí)驗(yàn)方案，在200 μ LPOR管或POR八連管中進(jìn)行反應(yīng)。向反應(yīng)液中分別加入經(jīng)梯度稀釋的上述DNA試樣(2μ L)，向其中加入上述引物、鏈置換型DNA聚合酶、dNTPs和緩沖液。
[0050]以上各反應(yīng)成分加好后混合均勻，再滴加2滴礦物油或液體石蠟，覆蓋在反應(yīng)液的表面。然后在管蓋內(nèi)加入10 μ LSYBRGreen I，小心將POR管或POR八連管蓋好，不要讓所加入的IOyL SYBR Green I向下進(jìn)入到POR管或POR八連管內(nèi)。在不使用熱蓋的POR儀或水浴等儀器中，65°C靜置50分鐘。
[0051]4)經(jīng)擴(kuò)增的DNA的檢測(cè)
[0052]在LAMP反應(yīng)結(jié)束后，將蓋好蓋子的POR管或POR八連管上下混勻，使管蓋的SYBRGreen I進(jìn)入到反應(yīng)液中，輕微離心后觀察反應(yīng)液的顏色變化。
[0053]確認(rèn)采用LAMP法的DNA的擴(kuò)增的情況下，SYBRGreen I染料會(huì)嵌入到擴(kuò)增得到的雙鏈DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中間，從而使反應(yīng)液的顏色發(fā)生改變，反應(yīng)液表現(xiàn)出翠綠色。如果沒(méi)有發(fā)生采用LAMP法的DNA的擴(kuò)增的情況下，由于沒(méi)有雙鏈DNA的產(chǎn)生，SYBRGreen I染料不會(huì)嵌入其中，反應(yīng)液的顏色就不會(huì)發(fā)生改變，依然保持為淡橙色。[0054]將反應(yīng)結(jié)束后的各反應(yīng)管置于紫外燈下照射，發(fā)生采用LAMP法的DNA的擴(kuò)增的情況下，反應(yīng)液發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光；沒(méi)有發(fā)生采用LAMP法的DNA的擴(kuò)增的情況下，反應(yīng)液無(wú)特異性熒光的出現(xiàn)。
[0055]通過(guò)上述所擴(kuò)增的DNA是相當(dāng)于小麥矮縮病毒的編碼蛋白質(zhì)基因的DNA的部分序列的堿基序列，因此反應(yīng)液出現(xiàn)翠綠色顏色表現(xiàn)時(shí)判斷為存在小麥矮縮病毒，其堿基序列如序列表1所示。
[0056]參考附圖2-A，為使用小麥矮縮病毒檢測(cè)用檢查標(biāo)本的DNA稀釋試樣和對(duì)照檢查標(biāo)本的DNA試樣通過(guò)POR法進(jìn)行小麥矮縮病毒的檢測(cè)的結(jié)果。
[0057]參考附圖2-B，為使用小麥矮縮病毒檢測(cè)用檢查標(biāo)本的DNA稀釋試樣和對(duì)照檢查標(biāo)本的DNA試樣通過(guò)LAMP法進(jìn)行小麥矮縮病毒的檢測(cè)的結(jié)果。
[0058]觀察上述附圖可知，對(duì)照檢查標(biāo)本的DNA試樣都未檢出小麥矮縮病毒，對(duì)于小麥矮縮病毒檢測(cè)用檢查標(biāo)本的DNA稀釋試樣，采用POR法和LAMP法均可檢出小麥矮縮病毒，但是檢查靈敏度不同。根據(jù)以上的結(jié)果，明確采用LAMP法的檢測(cè)中，感染了小麥矮縮病毒的小麥矮縮病毒檢測(cè)用檢查標(biāo)本檢出了小麥矮縮病毒，示意檢測(cè)靈敏度高于后述的采用POR法的檢測(cè)。
[0059]綜上所述，實(shí)施例1中所示的采用LMAP法的小麥矮縮病毒的檢測(cè)方法靈敏度遠(yuǎn)高于下述對(duì)比實(shí)施例采用的POR法，僅通過(guò)視覺(jué)上判斷反應(yīng)液的顏色就可以容易地判定小麥矮縮病毒的有無(wú)的方法，準(zhǔn)確、高效。
[0060]對(duì)比實(shí)施例:采用POR法進(jìn)行小麥矮縮病毒檢測(cè)
[0061]I)小麥矮縮病毒的檢測(cè)用POR模板的制作
[0062]同前述(實(shí)施例 1)采用LAMP法的小麥矮縮病毒的檢測(cè)中I)小麥矮縮病毒的檢測(cè)中使用的小麥組織樣品的制備。
[0063]2) POR法中使用的引物
[0064]弓丨物采用作為F引物的WDV-F弓丨物(CAACTGGTTGAATAGOGACAGGAC)、作為R引物的WDV-R引物(OGTATAGGCACATACAACATCAAAOG)。采用上述引物進(jìn)行采用PCR法的DNA的擴(kuò)增反應(yīng)，可以擴(kuò)增重復(fù)包含作為小麥矮縮病毒的編碼蛋白質(zhì)基因的DNA的部分序列的堿基序列的DNA。
[0065]3)采樣POR法的DNA的擴(kuò)增
[0066]米樣POR法的DNA的擴(kuò)增使用Taq DNA聚合酶(Promegra制)進(jìn)行。具體來(lái)說(shuō)，按照制造商的實(shí)驗(yàn)方案，在200 μ LPOR管或POR八連管中進(jìn)行反應(yīng)。向反應(yīng)液中分別加入經(jīng)梯度稀釋的上述DNA試樣(2 μ L)，向其中加入上述的2種引物、Taq DNA聚合酶、dNTPs和緩沖液。以上各反應(yīng)成分加好后混合均勻，采用POR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為:變性溫度95°C反應(yīng)3分鐘，然后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)，擴(kuò)增循環(huán)包括3個(gè)步驟，首先95°C使DNA變性50秒，然后55°C退火50秒，最后72°C延伸反應(yīng)I分鐘，共30個(gè)循環(huán)。循環(huán)擴(kuò)增后72°C延伸10分鐘，
[0067]10 °C保存反應(yīng)液。
[0068]4)經(jīng)擴(kuò)增的DNA的檢測(cè)
[0069]在POR反應(yīng)結(jié)束后，將POR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。電泳后的凝膠通過(guò)在溴化乙錠中浸潰10分鐘而將被分離的DNA片段染色，通過(guò)紫外線照射，可以觀察到DNA條帶。確認(rèn)POR法擴(kuò)增的情況下，由于引物WDV-F和引物WDV-R擴(kuò)增得到595bp的核酸片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)在595bp處出現(xiàn)單一的核酸條帶。如果沒(méi)有發(fā)生POR擴(kuò)增的情況下，引物WDV-F和引物WDV-R不能擴(kuò)增得到595bp的核酸片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)在595bp處不出現(xiàn)單一的核酸條帶。通過(guò)上述的采用POR法的DNA的擴(kuò)增所擴(kuò)增的DNA是相當(dāng)于小麥矮縮病毒的編碼蛋白質(zhì)基因的DNA的部分序列的序列表的序列編號(hào)8中所不的喊基序列，因此瓊脂糖凝膠電泳在595bp處出現(xiàn)單一的核酸條帶時(shí)判斷為存在小麥矮縮病毒。
[0070]參考附圖2-B，使用小麥矮縮病毒檢測(cè)用檢查標(biāo)本的DNA稀釋試樣和對(duì)照檢查標(biāo)本的DNA試樣通過(guò)LAMP法進(jìn)行小麥矮縮病毒的檢測(cè)的結(jié)果。
[0071]綜合附圖2可以看到，對(duì)照檢查標(biāo)本的DNA試樣都未檢出小麥矮縮病毒，但對(duì)于小麥矮縮病毒檢測(cè)用檢查標(biāo)本的DNA稀釋試樣，將小麥組織樣品稀釋IX IO4倍時(shí)，采用POR法可以檢出小麥矮縮病毒，但是當(dāng)小麥組織樣品稀釋IXlO5倍未檢出小麥矮縮病毒。對(duì)于小麥矮縮病毒檢測(cè)用檢查標(biāo)本的DNA稀釋試樣，將小麥組織樣品稀釋I X IO6倍時(shí)，采用LAMP法仍可以檢出小麥矮縮病毒。根據(jù)以上的結(jié)果，明確采用POR法的檢測(cè)中，感染了小麥矮縮病毒的小麥矮縮病毒檢測(cè)用檢查標(biāo)本檢出了小麥矮縮病毒，但與本發(fā)明的采用LAMP法的檢測(cè)相比，檢測(cè)靈敏度低于采用LAMP法的檢測(cè)10-100倍。[0072]參考附圖3-A、3-B、3_C，對(duì)于待檢測(cè)標(biāo)本2中不存在小麥矮縮病毒的情況，SYBRGreen I染料呈紅色熒光，在待檢測(cè)標(biāo)本I中存在小麥矮縮病毒的情況，SYBRGreen I染料結(jié)合雙鏈DNA呈綠色熒光。其中A圖為肉眼可見(jiàn)熒光表現(xiàn)，B圖為UV照射下熒光表現(xiàn)。此即為本發(fā)明實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)的技術(shù)原理。
[0073]本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)了小麥矮縮病毒的可視化檢測(cè)，便于操作。
【權(quán)利要求】
1.小麥矮縮病毒的快速可視化檢測(cè)方法，其特征在于包括下述步驟:1)提取步驟:從待檢查標(biāo)本提取DNA ；2)擴(kuò)增步驟:使用引物，以步驟I)的DNA為模板，通過(guò)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法進(jìn)行DNA的擴(kuò)增反應(yīng)；3)判斷步驟:檢測(cè)所述擴(kuò)增步驟中是否包含小麥矮縮病毒堿基序列判斷是否存在小麥矮縮病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于采用蒸餾水或具有弱堿性的pH緩沖液中將待檢查標(biāo)本以物理方式勻漿，從而提取待檢查標(biāo)本的DNA ;其中所用緩沖液選Tris /鹽酸緩沖液、Tris /醋酸緩沖液、磷酸緩沖液、碳酸緩沖液、硼酸緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于擴(kuò)增步驟所用引物為包含下述四種堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸的引物組:
WDV-FIP 引物，TOGATGOGAOCAAGCAOGTTGTAOGATGOCTTGGAATCTGC;
WDV-BIP 引物，AGGAAGTGGAAOGTGAAOCTTGCTAOOCAGTTGTAGOGTTGG ；
WDV-F3 引物，GTOCAOGATATTCTTGOOGA ； WDV-B3 引物，OCAGAOGOCACTGACATC。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于擴(kuò)增步驟的擴(kuò)增反應(yīng)將含有提取步驟中所提取的DNA、引物組、鏈置換型DNA聚合酶、dNTPs，包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP，和緩沖液的反應(yīng)液在等溫條件下靜置15分鐘以上，溫度為50-75°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述溫度為60-65°C，靜置時(shí)間15分鐘-60分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于判斷步驟所用的判斷方法為在判斷步驟開(kāi)始前，將SYBR Green I染料加入反應(yīng)管中；經(jīng)擴(kuò)增反應(yīng)后，反應(yīng)液產(chǎn)生綠色的情況下，判斷為存在小麥矮縮病毒；發(fā)現(xiàn)反應(yīng)液保持橙紅色的情況下，判斷為不存在小麥矮縮病毒。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于判斷步驟所用的判斷方法為擴(kuò)增后的反應(yīng)液在UV照射下發(fā)現(xiàn)綠色熒光的情況下，判斷為存在小麥矮縮病毒；未發(fā)現(xiàn)綠色熒光的情況下，判斷為不存在小麥矮縮病毒。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于判斷步驟所用的判斷方法為將所擴(kuò)增的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在存在多條梯形條帶情況下，判斷為存在小麥矮縮病毒；只存在單一條帶或者不存在任何條帶的情況下，判斷為不存在小麥矮縮病毒。
9.一種小麥矮縮病毒的檢測(cè)用試劑盒，其特征在于包含權(quán)利要求2或3所述的引物組、鏈置換型DNA聚合酶、dNTPs和反應(yīng)緩沖液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測(cè)用試劑盒，其特征在于為將權(quán)利要求2或3所述的引物組加入Loopamp DNA擴(kuò)增試劑盒中。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK103667523SQ201310471143
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月10日
【發(fā)明者】郝興安, 趙磊, 王喬春, 吳云鋒 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)