壓力誘導(dǎo)心肌肥厚細(xì)胞模型及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種壓力誘導(dǎo)心肌肥厚細(xì)胞模型及其應(yīng)用。本發(fā)明的壓力誘導(dǎo)心肌肥厚細(xì)胞模型，是通過給培養(yǎng)的心肌細(xì)胞施加壓力培養(yǎng)獲得，其中所使用的壓力為60mmHg～180mmHg，優(yōu)選為180mmHg，所述心肌細(xì)胞可為大鼠H9c2細(xì)胞。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)壓力可以誘導(dǎo)大鼠H9c2心肌細(xì)胞肥厚，促進(jìn)細(xì)胞直徑、體積增大和蛋白含量的增加。本發(fā)明還公開了所述壓力誘導(dǎo)心肌肥厚細(xì)胞模型在心肌肥厚的基礎(chǔ)研究和藥物研究中的應(yīng)用。
【專利說明】壓力誘導(dǎo)心肌肥厚細(xì)胞模型及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種壓力誘導(dǎo)心肌肥厚細(xì)胞模型及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]心肌肥厚是心臟對急、慢性血流動力學(xué)超負(fù)荷的一種基本的適應(yīng)性反應(yīng)。以心肌細(xì)胞直徑、體積增大及細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成增加為主要特征，是引起心血管疾病的獨(dú)立危險因素，也是心血管疾病常見的一種病理狀態(tài)。早期心肌肥厚是心肌細(xì)胞對外界刺激的代償性改變，有利于維持心輸出量，對機(jī)體起到代償性保護(hù)作用，但長期的心肌肥厚將會誘發(fā)心力衰竭等心血管疾病，甚至引發(fā)猝死。因此，探討心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及其可能的調(diào)節(jié)機(jī)制，尋求防治心肌肥厚新靶點(diǎn)和開發(fā)更有效的藥物，對心肌肥厚誘發(fā)心衰等心血管疾病的預(yù)防和治療具有重要的意義。
[0003]心肌肥厚的發(fā)生機(jī)制極其復(fù)雜至今仍未完全明了，目前認(rèn)為導(dǎo)致心肌肥厚的原因主要可歸納為:機(jī)械性、神經(jīng)性與體液性。其中機(jī)械刺激主要就是指壓力誘導(dǎo)。壓力超負(fù)荷使心室壁張力增加，可導(dǎo)致心肌肥厚的產(chǎn)生。長期患有高血壓的患者，可引起左心室的心肌肥厚。壓力負(fù)荷一方面直接刺激細(xì)胞生長，另一方面可激活心肌細(xì)胞膜上的壓力信號開關(guān)，進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)以及各種細(xì)胞因子的分泌如去甲腎上腺素、血管緊張素II和甲狀腺素等等。2012年《Nature》雜志已經(jīng)報道血管緊張素受體樣受體APJ可能作為一個壓力感受的祀標(biāo)，參與心肌肥厚的發(fā)生(Scimia MC, et al.APJ acts as a dual receptor incardiac hypertrophy.Nature.2012, 16;488(7411):394-8.)。
[0004]壓力負(fù)荷即機(jī)械性因素在心肌肥厚中的作用最為重要。壓力負(fù)荷誘導(dǎo)心肌肥厚在實驗動物上可以通過腹主動脈狹窄來建立，而目前在體外培養(yǎng)的細(xì)胞上以前無法實現(xiàn)。壓力負(fù)荷可以激活機(jī)體產(chǎn)生眾多細(xì)胞因子如去甲腎上腺素、血管緊張素II和甲狀腺素的分泌，有報道單獨(dú)使用這些細(xì)胞因子也能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞肥厚，但處理因素單一，并且無法模擬體內(nèi)壓力負(fù)荷的環(huán)境。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種壓力誘導(dǎo)心肌肥厚細(xì)胞模型，其特征在于，其通過給培養(yǎng)的心肌細(xì)胞施加壓力培養(yǎng)獲得。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供一種壓力誘導(dǎo)心肌肥厚細(xì)胞模型，其特征在于，所使用的壓力為60mmHg~180mmHg。
[0007]本發(fā)明的另一目的在于提供一種壓力誘導(dǎo)心肌肥厚細(xì)胞模型，其特征在于，所使用的壓力為優(yōu)選為180mmHg。
[0008]本發(fā)明的另一目的在于提供一種壓力誘導(dǎo)心肌肥厚細(xì)胞模型，其特征在于，所使用的心肌細(xì)胞為大鼠H9c2細(xì)胞。
[0009]本發(fā)明的另一目的在于提供一種壓力誘導(dǎo)心肌肥厚細(xì)胞模型在心肌肥厚的基礎(chǔ)研究和藥物研究中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明的另一目的在于提供一種心肌肥厚細(xì)胞模型的制備方法，其特征在于，其通過給培養(yǎng)的心肌細(xì)胞施加壓力培養(yǎng)獲得。
[0011]本發(fā)明的另一目的在于提供一種心肌肥厚細(xì)胞模型的制備方法，其特征在于，所使用的壓力為60mmHg~180mmHg。
[0012]本發(fā)明的另一目的在于提供一種心肌肥厚細(xì)胞模型的制備方法，其特征在于，所使用的壓力為優(yōu)選為180mmHg。
[0013]本發(fā)明的另一目的在于提供一種心肌肥厚細(xì)胞模型的制備方法，其特征在于，所使用的心肌細(xì)胞為大鼠H9c2細(xì)胞。
[0014]本發(fā)明的另一目的在于提供一種心肌肥厚細(xì)胞模型的制備方法在心肌肥厚的基礎(chǔ)研究和藥物研究中的應(yīng)用。
[0015]在本發(fā)明中，發(fā)明人應(yīng)用自制的壓力細(xì)胞培養(yǎng)箱，可以將心肌細(xì)胞置于體外的壓力負(fù)荷環(huán)境來培養(yǎng)，從而可以在體外實驗中模擬體內(nèi)的壓力負(fù)荷環(huán)境。應(yīng)用壓力培養(yǎng)可以彌補(bǔ)單一因子誘導(dǎo)培養(yǎng)的不足。壓力培養(yǎng)箱的壓力還可以調(diào)節(jié)，從而可以模擬體內(nèi)壓力負(fù)荷的動態(tài)變化。該模型實施的操作便利，在短時間內(nèi)(通常48小時)即可復(fù)制出心肌肥厚細(xì)胞模型，重復(fù)性很好，與動物實驗也可以做平行研究，具有較好的可比性。
[0016]在本發(fā)明中，發(fā)明人將普通細(xì)胞培養(yǎng)箱改裝成壓力細(xì)胞培養(yǎng)箱，通過這種壓力細(xì)胞培養(yǎng)箱，給培養(yǎng)的心肌細(xì)胞施加壓力。發(fā)明人的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)壓力可以誘導(dǎo)大鼠H9c2心肌細(xì)胞肥厚，促進(jìn)細(xì)胞直徑、體積增大和蛋白含量的增加，并且細(xì)胞內(nèi)血管緊張素受體樣受體APJ表達(dá)的增加。
[0017]發(fā)明人進(jìn)一步設(shè)計`并合成小分子RNA用于干擾APJ的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾APJ后可以逆轉(zhuǎn)壓力誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞直徑、體積增大和蛋白含量的增加。整個實驗結(jié)果可通過如圖1所述的信號通路圖來描述說明:壓力刺激細(xì)胞膜上的壓力感受器一APJ受體，使APJ受體表達(dá)增加，然后誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥厚；而1?^干擾抑制APJ的表達(dá)后能逆轉(zhuǎn)壓力誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥厚(如圖1)。此外，使用磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑LY294002和細(xì)胞自噬抑制劑3-Methyladenine兩種工具藥也可以逆轉(zhuǎn)壓力誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥厚。
[0018]綜上所述，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了用發(fā)明人自制的壓力細(xì)胞培養(yǎng)箱可以誘導(dǎo)H9c2心肌肥厚細(xì)胞模型，深入研究后發(fā)現(xiàn)APJ介導(dǎo)壓力誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥厚。本發(fā)明為壓力如何誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥厚提供了實驗的證據(jù)。這一心肌細(xì)胞模型及其制備方法在心肌肥厚的基礎(chǔ)研究和藥物研究中都有重要的意義和廣泛的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1信號通路圖，顯示壓力刺激細(xì)胞膜上的壓力感受器一APJ受體，使APJ受體表達(dá)增加，然后誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥厚；而1?嫩干擾抑制APJ的表達(dá)后能逆轉(zhuǎn)壓力誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥厚。
[0020]圖2本發(fā)明自制的壓力細(xì)胞培養(yǎng)箱實物照片。
[0021]圖3Western Blot結(jié)果圖，顯示壓力誘導(dǎo)大鼠H9c2心肌細(xì)胞中APJ的表達(dá)顯著增加( T 士s，n=6 )。[0022]圖4shRNA 干擾 APJ 的結(jié)果圖(無士S，11=6 )。
[0023]圖5本發(fā)明自制的壓力細(xì)胞培養(yǎng)箱外部結(jié)構(gòu)圖，I為壓力控制器，2為放氣閥，3為溫度計，4為壓力表，5為溫控開關(guān)，6為氣瓶。
[0024]圖6本發(fā)明自制的壓力細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖，I為壓力控制器，2為放氣閥，3為溫度計，4為壓力表，5為溫控開關(guān)，6為氣瓶，7為高壓箱體。氣體流通路徑:6氣瓶一4壓力表一 I壓力控制器一7高壓箱體。
[0025]圖7本發(fā)明自制的壓力細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)置高壓小箱體二維圖，I為內(nèi)六角螺栓，2為密封墊圈，3為高壓箱體門。
【具體實施方式】
[0026]建立壓力誘導(dǎo)心肌肥厚細(xì)胞模型的實驗方法如以下實施例所示。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0027]實施例1大鼠H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)
[0028]大鼠H9c2心肌細(xì)胞(市售可得，可從例如中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫或其它公司獲得)是源于B DlX大鼠胚胎心臟組織的亞克隆細(xì)胞株，用含10%胎牛血清(FBS)的 DMEM(1.5g/LNaHC03，4.5g/L C6H12O6,4mM L-谷氨酰胺)培養(yǎng)；每2411 換一次培養(yǎng)液，換液前用 0.01M PBS (稱取 8g NaCl、0.2g KCl、1.44gNa2HP04 和 0.24g KH2P04，溶于 800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1L)洗3遍后再加入新鮮培養(yǎng)液；當(dāng)細(xì)胞生長到約70%融合時可傳代，用0.25%胰酶細(xì)胞消化液消化，顯微鏡下觀察到貼壁細(xì)胞從長梭形變?yōu)閳A形時停止消化，加入新鮮培養(yǎng)基吹打均勻后分瓶培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察，大鼠H9c2心肌細(xì)胞呈長梭形、帶狀三角形，細(xì)胞間有突起相連，未見心肌搏動。取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。
[0029]實施例2壓力培養(yǎng)箱培養(yǎng)大鼠H9c2心肌細(xì)胞
[0030]將生長狀態(tài)良好的大鼠H9c2心肌細(xì)胞放入自制的壓力細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)?？孔⑷?%C02混合氣體(即95%的空氣和5%的CO2),可以調(diào)節(jié)壓力培養(yǎng)箱中的壓力。
[0031]本發(fā)明自制的壓力細(xì)胞培養(yǎng)箱實物照片參見圖2。
[0032]實施例3大鼠H9c2心肌細(xì)胞肥厚的檢測
[0033]1.大鼠H9c2心肌細(xì)胞直徑和體積測定
[0034]收集培養(yǎng)后的大鼠H9c2心肌細(xì)胞，用0.01M PBS洗3次，加入0.25%胰酶細(xì)胞消化液，充分消化后吹打均勻制成細(xì)胞懸液，離心棄掉上清，再加入0.5ml PBS重懸細(xì)胞，使其呈單個懸浮液，并且用PBS調(diào)節(jié)細(xì)胞密度在5X 104-5X 105/ml，取200 μ I裝于2ml的EP管中；用Scepterf.0手持式細(xì)胞計數(shù)器(Millipore公司，美國)測量細(xì)胞直徑和體積，直徑單位:μ m/cell,體積單位:μ m3/cell。
[0035]2.大鼠H9c2心肌細(xì)胞蛋白含量測定
[0036]收集培養(yǎng)后的大鼠H9c2心肌細(xì)胞，對各組心肌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。進(jìn)一步離心沉淀細(xì)胞后加入5倍體積的含90%RIPA裂解液和10%苯甲基磺酰氟(PMSF)的細(xì)胞裂解液，裂解大鼠H9c2心肌細(xì)胞的細(xì)胞膜，4°C 12000rpm離心30min后吸取上清，用BCA蛋白定量分析試劑盒(Pierce公司，美國)測定H9c2大鼠心肌細(xì)胞的蛋白含量,單位:pg/cell。
[0037]實施例4蛋白質(zhì)印跡Western Blot[0038]取培養(yǎng)后的大鼠H9c2心肌細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS洗3次，濾紙吸去多余液體，加入含90%RIPA裂解液和10%苯甲基磺酰氟(PMSF)的細(xì)胞裂解液50-70 μ 1，冰上裂解20min，用細(xì)胞刮匙刮取蛋白收集于1.5ml EP管中，4°C 12000rpm離心15min，收集上清后用BCA蛋白定量分析試劑盒進(jìn)行蛋白定量。加入25%蛋白樣品體積的4X上樣緩沖液并混勻，煮沸l(wèi)Omin，取30μ g蛋白樣品上樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，于電泳緩沖液中80V恒壓電泳30min，待樣品進(jìn)入分離膠后改用120V恒壓電泳，直至樣品電泳至分離膠底部。然后轉(zhuǎn)膜，于轉(zhuǎn)膜液中250mA恒流濕法電轉(zhuǎn)2.5h使蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%BSA封閉液搖床室溫封閉PVDF膜2h后加APJ (兔抗)一抗(1:1000)，4°C搖床孵育過夜。次日，用TBST洗膜4次，IOmin/次，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(羊抗兔)(1:3000)室溫下?lián)u床孵育lh, TBST洗膜4次，15min/次，然后將PVDF膜放入發(fā)光劑(Millipore公司，美國)中孵育2分鐘，隨后將膜放置于Tanon-6200化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)的平臺上，曝光，拍照。應(yīng)用軟件Alphalmager2200 (FORM公司，美國)進(jìn)行圖像分析，統(tǒng)計灰度掃描值 。
[0039]實施例5針對APJ的RNA干擾可以逆轉(zhuǎn)壓力誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥厚
[0040]shRNAs在上海吉瑪公司設(shè)計和合成的，共合成了四條APJ干擾鏈(分別為pGPU6/Neo-APJ-rat-53I, pGPU6/Neo-APJ-rat-399, pGPU6/Neo-APJ-rat-107I 和 pGPU6/Neo-APJ-rat-759)。以pGPU6/Neo_shNC并連接一段與目的基因APJ無同源性的siRNA作為對照。細(xì)胞待長到70%左右的時候，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染的時候，先將質(zhì)粒2μ I(含l.0ygDNA)溶于100 μ I無血清培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染試劑Attractene (Qiagen公司，德國)4.5 μ I溶于100 μ I無血清培養(yǎng)基中，然后兩者混合后常溫下靜置30分鐘，再加入六孔板培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞中，同時加入2ml培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，6個小時后，進(jìn)行一次換液。24小時后提取蛋白，檢測APJ的表達(dá)。
[0041]實施例6結(jié)果分析
[0042](一)壓力誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥厚
[0043]分別使用壓力(60mmHg、90mmHg、120mmHg、150mmHg和 180mmHg)來處理大鼠 H9c2細(xì)胞48小時，并檢測細(xì)胞的直徑、體積和蛋白含量的變化。結(jié)果顯示:與Control組比較，用120mmHg、150mmHg和180mmHg的壓力培養(yǎng)大鼠H9c2心肌細(xì)胞，心肌細(xì)胞直徑、體積明顯
增大，蛋白含量顯著增加(表1)。
[0044]表1壓力培養(yǎng)對大鼠H9c2心肌細(xì)胞直徑、體積和蛋白含量的影響
[0045]
【權(quán)利要求】
1.一種壓力誘導(dǎo)心肌肥厚細(xì)胞模型，其特征在于，其通過給培養(yǎng)的心肌細(xì)胞施加壓力培養(yǎng)獲得。
2.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞模型，其特征在于，所使用的壓力為60mmHg~180mmHg。
3.權(quán)利要求2所述的細(xì)胞模型，其特征在于，所使用的壓力優(yōu)選為ISOmmHg。
4.權(quán)利要求1~3任一項所述的細(xì)胞模型，其特征在于，所述心肌細(xì)胞為大鼠H9c2細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1~4任一項所述的細(xì)胞模型在心肌肥厚的基礎(chǔ)研究和藥物研究中的應(yīng)用。
6.一種心肌肥厚細(xì)胞模型的制備方法，其特征在于，其通過給培養(yǎng)的心肌細(xì)胞施加壓力培養(yǎng)獲得。
7.權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于,所使用的壓力為60mmHg~180mmHg。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所使用的壓力優(yōu)選為ISOmmHg。
9.權(quán)利要求6~8任一項所述的方法，其特征在于，所述心肌細(xì)胞為大鼠H9c2細(xì)胞。
10.權(quán)利要求6~9任一項所述 的方法在心肌肥厚的基礎(chǔ)研究和藥物研究中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N5/071GK103525754SQ201310472471
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月11日
【發(fā)明者】李蘭芳, 謝鳳, 柳威, 呂德官, 陳臨溪, 陳冠峰 申請人:李蘭芳