一種能快速增加細胞膜通透性從而快速破膜形成高阻封接的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種能快速增加細胞膜通透性從而快速破膜形成高阻封接的方法。它是將含伊維菌素的細胞外液灌入快速加藥管中，再將含兩性霉素的細胞內(nèi)液灌入微電極中，然后利用含含兩性霉素的細胞內(nèi)液的微電極鉗制細胞達到高阻封接后，提起貼壁細胞至快速加藥管口，打開快速加藥管，使細胞在含伊維菌素的細胞外液中撫育，使細胞在電生理測試狀態(tài)下Ra值降至10，再停止撫育。本發(fā)明能夠快速高效的溶解兩性霉素B于細胞內(nèi)液，并結(jié)合伊維菌素快速增加細胞膜通透性從而在膜片鉗實驗中快速破膜形成高阻封接進行實驗。
【專利說明】一種能快速增加細胞膜通透性從而快速破膜形成高阻封接的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體涉及一種能快速增加細胞膜通透性從而快速破膜形成高阻封接的方法。
【背景技術(shù)】:
[0002]膜片鉗技術(shù)的基本方法是用玻璃微電極(尖端直徑在微米級)貼附在細胞表面，施加負壓使電極與細胞之間形成高阻封接(即IO9歐米量級的緊密封接)。在實驗中，向玻璃電極內(nèi)液中加入特定的抗生素，如兩性霉素B，可以使細胞膜穿孔，細胞內(nèi)液和電極內(nèi)液連通，這樣記錄到的玻璃電極內(nèi)和細胞所處浴液之間的電勢差即為細胞的膜電位，這就是穿孔膜片鉗。穿孔全細胞膜片鉗有效的避免了洗脫作用，并且胞質(zhì)滲漏極為緩慢，可長時間穩(wěn)定記錄；同時具有對細胞損傷小的優(yōu)點。抗生素穿孔形成的孔道，分子直徑大于0.Snm的離子和分子不能通過，而所有離子都可通過，這些孔道沒有電壓依賴性，同時使得記錄過程不受電極鉗制電位的影響。
[0003]兩性霉素B是一種具有抑菌或殺菌作用的抗霉菌劑。主要是通過作用于細胞膜上的麥角留醇而改變細胞膜通透性。雖然穿孔膜片鉗具有這么多優(yōu)點，但是兩性霉素B基本不溶于水溶液，因此對穿孔膜片鉗實驗帶了一定難度。也使得穿孔膜片鉗實驗很少使用。
[0004]伊維菌素(IVERMECTIN)是一種新型廣譜、高效、低毒的抗寄生蟲藥，這個大環(huán)類脂類藥物可以有效的插入細胞膜增加細胞膜的通透性，但長時間作用會導致細胞溶解。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005]本發(fā)明的目的是提供一種快速增加細胞膜通透性從而快速破膜形成高阻封接的方法。
[0006]本發(fā)明的快速增加細胞膜通透性從而快速破膜形成高阻封接的方法，其特征在于，將含伊維菌素的細胞外液灌入快速加藥管中，再將含兩性霉素的細胞內(nèi)液灌入微電極中，然后利用含含兩性霉素的細胞內(nèi)液的微電極鉗制細胞達到高阻封接后，提起貼壁細胞至快速加藥管口，打開快速加藥管，使細胞在含伊維菌素的細胞外液中撫育，使細胞在電生理測試狀態(tài)下Ra值降至10，再停止撫育；
[0007]所述的含兩性霉素的細胞內(nèi)液是通過以下方法制備的:先將兩性霉素B溶解于DMSO中，配制成20mg/mL兩性霉素B的DMSO溶液，然后將兩性霉素B的DMSO溶液、IOOmmol/L的SDS溶液和常規(guī)細胞內(nèi)液按照體積比50:15:1000的比例混合均勻，由此得到含lmg/mL兩性霉素B的細胞內(nèi)液，即為含兩性霉素B的細胞內(nèi)液；
[0008]所述的含伊維菌素的細胞外液是將伊維菌素溶于常規(guī)細胞外液中，使伊維菌素終濃度為2mM/L，由此得到含伊維菌素的細胞外液。
[0009]依此方法得到的細胞可以在3min內(nèi)快速溶解細胞膜，同時電極內(nèi)部的兩性霉素B繼續(xù)與細胞膜中的麥角留醇相互作用維持細胞膜長期處于穩(wěn)定的通透狀態(tài)，可以在l_2h內(nèi)記錄到穩(wěn)定的電流結(jié)果。并且不會因為細胞膜在記錄過程中反復的閉合造成記錄中斷。
[0010]所述的常規(guī)細胞內(nèi)液為含有130mM CsMeth, 24mM CsCl, IOmM HEPES, ImMCaCl2, ImM MgCl2，溶劑為水。
[0011]所述的常規(guī)細胞外液為含有154mM NaCl, IOmM D-glucose, IOmM HEPES, ImMCaCl2, ImM MgCl2，溶劑為水。
[0012]所述的含兩性霉素B的細胞內(nèi)液優(yōu)選通過以下方法配制:
[0013]將每0.01g的兩性霉素B溶解于500mL DMSO,置于渦旋振蕩器上以3200rpm轉(zhuǎn)速震蕩2min，混勻后放置在超聲儀中以40KHz的頻率超聲5min，最終配制成20mg/mL兩性霉素B的DMSO溶液，再按每吸取50 μ L兩性霉素B的DMSO溶液、15 μ LIOOmmoI/L的SDS溶液溶于ImL的常規(guī)細胞內(nèi)液中，置于渦旋振蕩器上震蕩lmin，然后以40KHz的頻率超聲lOmin，最后在以500rpm的轉(zhuǎn)速離心30s發(fā)現(xiàn)無懸浮顆粒沉降，因為懸浮顆粒的存在可能堵塞玻璃電極微米級的開口導致電流回路不暢，記錄數(shù)據(jù)不穩(wěn)定，由此得到含兩性霉素B的細胞內(nèi)液。
[0014]兩性霉素B對細胞膜通透性的影響具有濃度依賴性，如何最大限度的讓兩性霉素B溶解于細胞內(nèi)液的同時結(jié)合伊維菌素快速增加細胞膜的通透性，達到最短時間且最佳的穿透效果以此解決穿孔膜片鉗應用的主要問題。本發(fā)明解決兩性霉素B在細胞內(nèi)液中的溶解度，使其較好的溶解于細胞內(nèi)液中，在整個實驗過程中兩性霉素B處于水溶解狀態(tài)，同時結(jié)合伊維菌素增加細胞膜通透特性，實驗開始前孵育細胞輔助兩性霉素B —起在短時間內(nèi)破膜。破膜后停止撫育，同時在兩性霉素B的幫助下穩(wěn)定細胞膜處于穩(wěn)定通透狀態(tài)，從而使細胞能夠在l_2h內(nèi)處于穩(wěn)定的電流記錄狀態(tài)。
[0015]因此本發(fā)明能夠快速高效的溶解兩性霉素B于細胞內(nèi)液，并結(jié)合伊維菌素快速增加細胞膜通透性從而在膜片鉗實驗中快速破膜形成高阻封接進行實驗。
【具體實施方式】:
[0016]以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0017]實施例1:
[0018]將0.01g的兩性霉素B溶解于500mL DMSO,置于vortex-genie 2T渦旋振蕩器上以3200rpm轉(zhuǎn)速震蕩2min，混勻后放置在超聲儀中以40KHz的頻率超聲5min，最終配制成20mg/mL兩性霉素B的DMSO溶液。吸取50 μ L兩性霉素B的DMSO溶液、15 μ LIOOmmoI/L的SDS 溶液溶于 ImL 常規(guī)細胞內(nèi)液(含 130mM CsMeth, 24mM CsCl, IOmM HEPES, ImMCaCl2, ImMMgCl2，溶劑為水)中，置于渦旋振蕩器上震蕩lmin，然后以40KHz的頻率超聲lOmin，最后再以500rpm的轉(zhuǎn)速離心30s發(fā)現(xiàn)無懸浮顆粒沉降，因為懸浮顆粒的存在可能堵塞玻璃電極微米級的開口導致電流回路不暢，記錄數(shù)據(jù)不穩(wěn)定，由此得到含lmg/mL兩性霉素B的細胞內(nèi)液，即為含兩性霉素B的細胞內(nèi)液。
[0019]然后將伊維菌素溶于常規(guī)細胞外液(含有154mM NaCl, IOmM D-glucose, IOmMHEPES, ImM CaCl2, ImM MgCl2，溶劑為水)中，使伊維菌素的濃度為2mM/L，由此得到含伊維菌素的細胞外液。
[0020]將IOml本實施例的含伊維菌素的細胞外液灌入快速加藥管中，再將含兩性霉素B的細胞內(nèi)液灌入微電極中，然后利用含含兩性霉素B的細胞內(nèi)液的微電極鉗制細胞達到高阻封接后，提起貼壁細胞至快速加藥管口(含伊維菌素的細胞外液的加藥管口)，打開快速加藥管。細胞在含伊維菌素的細胞外液中撫育2min后細胞在電生理測試狀態(tài)下Ra值降至10，停止撫育。依此方法得到的細胞可以在3min內(nèi)快速溶解細胞膜，同時電極內(nèi)部的兩性霉素B繼續(xù)與細胞膜中的麥角留醇相互作用維持細胞膜長期處于穩(wěn)定的通透狀態(tài)，可以在1-2h內(nèi)記錄到穩(wěn)定的電流結(jié)果，不會因為細胞膜在記錄過程中反復的閉合造成記錄中
【權(quán)利要求】
1.一種快速增加細胞膜通透性從而快速破膜形成高阻封接的方法，其特征在于，將含伊維菌素的細胞外液灌入快速加藥管中，再將含兩性霉素的細胞內(nèi)液灌入微電極中，然后利用含含兩性霉素的細胞內(nèi)液的微電極鉗制細胞達到高阻封接后，提起貼壁細胞至快速加藥管口，打開快速加藥管，使細胞在含伊維菌素的細胞外液中撫育，使細胞在電生理測試狀態(tài)下Ra值降至10，再停止撫育； 所述的含兩性霉素的細胞內(nèi)液是通過以下方法制備的:先將兩性霉素B溶解于DMSO中，配制成20mg/mL兩性霉素B的DMSO溶液，然后將兩性霉素B的DMSO溶液、100mmol/L的SDS溶液和常規(guī)細胞內(nèi)液按照體積比50:15:1000的比例混合均勻，由此得到含lmg/mL兩性霉素B的細胞內(nèi)液，即為含兩性霉素B的細胞內(nèi)液； 所述的含伊維菌素的細胞外液是將伊維菌素溶于常規(guī)細胞外液中，使伊維菌素終濃度為2mM/L，由此得到含伊維菌素的細胞外液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的含兩性霉素B的細胞內(nèi)液通過以下方法配制:將每0.01g的兩性霉素B溶解于500mL DMSO,置于渦旋振蕩器上以3200rpm轉(zhuǎn)速震蕩2min，混勻后放置在超聲儀中以40KHz的頻率超聲5min，最終配制成20mg/mL兩性霉素B的DMSO溶液，再按每吸取50 μ L兩性霉素B的DMSO溶液、15 μ LIOOmmoI/L的SDS溶液溶于ImL的常規(guī)細胞內(nèi)液中，置于渦旋振蕩器上震蕩lmin，然后以40ΚΗζ的頻率超聲lOmin，最后在以500rpm的轉(zhuǎn)速離心30s發(fā)現(xiàn)無懸浮顆粒沉降，由此得到含兩性霉素B的細胞內(nèi)液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的常規(guī)細胞內(nèi)液為含有130mMCsMeth,24mM CsCl, IOmM HEPES, ImM CaCl2, ImM MgCl2，溶劑為水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的常規(guī)細胞外液為含有154mMNaCl, IOmM D-glucose, IOmM HEPES, ImM CaCl2, ImM MgCl2，溶劑為水。
【文檔編號】C12N13/00GK103571819SQ201310473138
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月11日
【發(fā)明者】李志遠, 梁欣, 尹世奎 申請人:中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院