在蜂房哈夫尼菌中穩(wěn)定的重組表達質粒載體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種通過將重組質粒載體轉移進入蜂房哈夫尼菌宿主細胞而獲得的轉化子，其中所述重組表達質粒載體包括一段編碼多肽表達產(chǎn)物的聚核苷酸，并由在蜂房哈夫尼菌中可復制骨架質粒衍生而成。本發(fā)明還涉及利用該轉化子制造生物基戊二胺的方法。
【專利說明】在蜂房哈夫尼菌中穩(wěn)定的重組表達質粒載體及其應用
[0001]分案聲明
[0002]本申請是2012年5月31日提交的申請?zhí)枮?01210177392.X、發(fā)明名稱為“在蜂
房哈夫尼菌中穩(wěn)定的重組表達質粒載體及其應用”的中國專利申請的分案申請。
【技術領域】
[0003]本申請屬于分子生物學領域，具體涉及一種穩(wěn)定的重組表達質粒載體及其用途?！颈尘凹夹g】
[0004]戊二胺是一種可用于生產(chǎn)多種化學品的平臺化合物。自20世紀80年代以來，用生物法生產(chǎn)戊二胺的研究領域獲得了廣泛關注。在生物法中，戊二胺可以通過賴氨酸脫羧生成。目前，用生物法生產(chǎn)戊二胺主要采用以下兩種方法:微生物發(fā)酵生產(chǎn)或生物體外酶催化生產(chǎn)。
[0005]在發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸的方法中，將賴氨酸脫羧酶基因加到賴氨酸生產(chǎn)菌株(如谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌)中，將生物合成賴氨酸的途徑進一步延伸為合成戊二胺的途徑。然而，已報告的戊二胺產(chǎn)率低于使用相同的不含賴氨酸脫羧酶基因的菌種生產(chǎn)賴氨酸的產(chǎn)率。產(chǎn)率低可能是由于戊二胺對生產(chǎn)菌株的毒性抑制作用。
[0006]此外，可以對細菌進行改造或利用誘導來表達賴氨酸脫羧酶，用于催化生物體外的賴氨酸脫羧反應。一種方法是在未經(jīng)改造的蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei, H.alvei)菌株中對染色體編碼的賴氨酸脫羧酶基因進行誘導表達。然而，此種方法所報道的酶產(chǎn)量低。另一種方法涉及重組細菌的構建。例如，日本一些公司(JP2009028045，U57189543，CN102056889)相繼報道能夠過量表達賴氨酸脫羧酶的大腸桿菌重組菌的構建，并利用全細胞或者細胞裂解液催化賴氨酸脫羧得到戊二胺。然而，大量表達對宿主細胞有毒的蛋白質使得表達質粒在幾次傳代后不穩(wěn)定。必須在`發(fā)酵液中使用抗生素以確保在培養(yǎng)過程中重組質粒的穩(wěn)定。
[0007]抗生素的使用可能導致對抗生素有抗藥性的細菌的發(fā)展，也會在環(huán)境中保持高水平的抗藥性微生物。例如，見 Martinez, " Environmental pollution by antibioticsand by antibiotic resistance determinants, " Environmental Pollution(2009),Vol.157，Issuell，2893-2902。由于對抗生素有抗藥性的細菌對健康和生態(tài)環(huán)境的危害，抗生素的使用是不環(huán)保的。因此，我們需要一個更有效的重組質粒載體，能夠在沒有抗生素篩選的條件下，多次連續(xù)傳代仍然保持穩(wěn)定。

【發(fā)明內容】

[0008]詳細說明
[0009]下面描述中的具體細節(jié)僅僅是為了能夠充分理解本發(fā)明的實施例。但是作為本領域的技術人員應該知道本發(fā)明的實施并不限于這些細節(jié)。另外，公知的結構和功能沒有被詳細的描述或者展示，以避免模糊了本發(fā)明實施例的要點。[0010]在本發(fā)明中所使用的氨基酸，多肽，堿基序列，核酸的縮寫，是基于國際理論和應用化學聯(lián)合會及國際生物聯(lián)合會對生物化學命名的規(guī)定，發(fā)表在European Journal ofBiochemistryl984年第138卷第9期的“準備含堿基序列和氨基酸序列的說明書的指導”(美國專利和商標局)一文中的縮寫，以及在生物【技術領域】中通用的縮寫。
[0011]在本公開中所討論的“核苷酸序列”，“聚核苷酸”或“DNA分子”，可能包括雙鏈DNA (B卩，由正義鏈和反義鏈組成的雙鏈DNA)或單鏈DNA，及其片段。在此“其片段”是指該核苷酸序列的一部分，其編碼的多肽與該核苷酸序列的完整序列所編碼的多肽的功能基本相同。例如，一種編碼抗毒素基因的核苷酸表達可以中和毒素多肽的多肽。編碼抗毒素基因的核苷酸的一個片段所表達的多肽也能中和該毒素多肽，因此與編碼抗毒素基因的核苷酸的全序列所表達的多肽相比提供了大致相同的功能。同樣，編碼毒素基因的核苷酸的一個片段所表達的多肽與編碼毒素基因的核苷酸的全序列所表達的多肽對與細胞有基本相同的毒性。[0012]這里提到的核苷酸序列，聚核苷酸或DNA分子不僅限于功能區(qū)，可能包括至少一個表達調控區(qū)，編碼區(qū)，前導序列，外顯子，內含子和表達盒(見，例如Papadakis etal., " Promoters and Control Elements:Designing Expression Cassettes for GeneTherapy, " Current Gene Therapy (2004), 4,89-113)。此外，核苷酸序列或聚核苷酸的例子可能指RNA或DNA。具有特定的氨基酸序列的多肽和具有特定的DNA序列的聚核苷酸可能包括該序列的片段、同源序列、衍生序列和突變序列。核苷酸序列或聚核苷酸的突變體(如突變DNA)的例子，包括自然發(fā)生的突變、人工突變，和/或刪除，替換，添加和/或插入等突變。這種突變體所編碼的多肽應該理解為與未突變的原核苷酸序列編碼的多肽實質上具有相同的功能。
[0013]本發(fā)明所公開的內容包括一個穩(wěn)定的重組表達質粒載體，包括以下部分:
[0014]—段編碼抗毒素基因的聚核苷酸，其表達一種多肽，來中和一種對宿主細胞有毒的多肽，與之對應的有毒的多肽由一段編碼毒素基因的聚核苷酸在宿主細胞中表達，
[0015]一段編碼多肽表達產(chǎn)物的聚核苷酸，其中，
[0016]該穩(wěn)定的重組表達質粒載體由在宿主細胞中可復制骨架質粒衍生而成。
[0017]在一些實施例中，該毒素基因在宿主細胞的染色體基因組中編碼。
[0018]在一些實施例中，該穩(wěn)定的重組表達質粒載體進一步包括編碼毒素基因的聚核苷酸。
[0019]在一些實施例中，該編碼毒素基因的聚核苷酸和/或編碼抗毒素基因的聚核苷酸是重組的。
[0020]在一些實施例中，毒素基因，抗毒素基因和編碼多肽表達產(chǎn)物的聚核苷酸中的一個或多個基因被進一步用密碼子優(yōu)化技術進行優(yōu)化，以在宿主細胞中對相應多肽提供更好的表達。例如，優(yōu)化毒素基因可以包括DNA序列的優(yōu)化，以與序列SEQ ID N0:1或SEQ ID:3相比更好地表達多肽毒素。在某些實施例中，抗毒素基因包括進一步優(yōu)化的DNA序列，以與序列SEQ ID N0:2或SEQ ID:4相比更好地表達抗毒素多肽。在某些實施例中，多肽表達產(chǎn)物的基因包括進一步優(yōu)化的DNA序列，以與序列SEQ ID N0:5或SEQ ID:6相比更好地表達多肽表達產(chǎn)物。
[0021]密碼子優(yōu)化是一種技術，其通過增加感興趣的基因在宿主細胞內的翻譯效率來得到最大限度的蛋白表達。一個物種的DNA核苷酸序列被優(yōu)化成為另一個物種的DNA核苷酸序列。DNA序列被分成三個一組(密碼子)。一種氨基酸的低頻率密碼子被宿主細胞中相同氨基酸的高頻率密碼子所取代。由此，優(yōu)化的DNA序列在宿主細胞中的表達得到改善。例如見 http: //www.guptalab.0rg/shubhg/pdf/shubhra codon, pdf,關于密碼子優(yōu)化技術介紹，在此作為參考全部納入。
[0022]這里使用的毒素/抗毒素基因對有兩個基因，其中一個是毒素基因，表達對宿主細胞有毒性的多肽，另一個是抗毒素基因，表達的多肽能夠中和該毒素多肽對宿主細胞的毒性。
[0023]某些原核生物含有一個或多個染色體編碼的毒素基因。某些原核生物含有編碼特定毒素/抗毒素基因對的內源性質粒。(見，Wertz et al.“Chimeric nature of twoplasmids of Hafnia alvei encoding the bacteriocins alveicins A and B.，，Journalof Bacteriology., (2004) 186:1598-1605.)毒素/抗毒素基因對通常在維持遺傳信息的穩(wěn)定和應激反應中發(fā)揮作用。當細胞中有染色體或質粒編碼的抗毒素基因時，抗毒素蛋白能夠持續(xù)表達，中和毒素蛋白，維持細胞的存活。在某些原核生物中，抗毒素蛋白的降解速度比毒素蛋白快。如果帶有抗毒素基因的質粒從細胞內丟失，已合成的毒素蛋白遺留的時間會比抗毒素蛋白長，能夠殺死細胞或抑制細胞生長。因此，在保持細胞存活的前提下，帶有抗毒素基因或毒素/抗毒素基因對的質粒不易丟失。
[0024]毒素/抗毒素基因對包括但不限于，abt/abi基因對，aat/aai基因對,及其片段。在某些實施例中，毒素基因包括DNA序列SEQ ID NO: 1，或SEQ ID NO: 3。在某些實施例中，抗毒素基因包括DNA序列SEQ ID NO: 2，或SEQ ID NO: 4。
[0025]這里使用的宿主菌是指可以被穩(wěn)定的重組質粒載體轉化的微生物。宿主菌包括，但不限于，蜂房哈夫尼菌(H.alvei)。
[0026]在某些實施例中，宿主菌天然不含有內源性質?；蛳嗽械膬仍葱再|粒。術語“消除”(cured)在此指將內源性質粒從`宿主菌中消除。所得到的不含內源性質粒的宿主菌被稱為“已消除的”宿主菌。
[0027]在一些實施例中，作為宿主的H.alvei菌株可以從任何已知的H.alvei株中選擇。例如，無內源性質粒的H.alvei株,有pAlvA內源性質粒的H.alvei株和其質粒消除株(pAIvA-株)，有pAlvB內源性質粒的H.alvei株和其質粒消除株(pAlvB-株)。
[0028]在某些實施例中，宿主菌是適合應用于工業(yè)規(guī)?；虼笠?guī)模生產(chǎn)的工業(yè)菌株。例如，工業(yè)菌株可以在發(fā)酵器中培養(yǎng)。培養(yǎng)的規(guī)?？梢詮膸装偕翈装偃f升。相反實驗室菌株通常在幾升或更小的規(guī)模中培養(yǎng)。在一些實施例中，工業(yè)菌株可以在相對實驗室菌株更簡單和更經(jīng)濟的培養(yǎng)液中生長。
[0029]多肽表達產(chǎn)物是由宿主菌產(chǎn)生的一種多肽。多肽表達產(chǎn)物包括但不限于，任何大腸桿菌可以生產(chǎn)的多肽表達產(chǎn)物，例如，酶(如脫羧酶，水解酶，磷酸化酶)。例如，脫羧酶為氨基酸脫羧酶。例如，脫羧酶為賴氨酸脫羧酶，酪氨酸脫羧酶，精氨酸脫羧酶，鳥氨酸脫羧酶，或谷氨酸脫羧酶。在一個實施例中，脫羧酶是賴氨酸脫羧酶。在另一個實施例中，編碼賴氨酸脫羧酶的聚核苷酸包括cadA基因，haldc基因或其片段。在另一個實施例中，編碼賴氨酸脫羧酶的聚核苷酸包括DNA序列SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6。在另一個實施例中，水解酶為葡萄糖苷酶，α-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶，甘露糖苷酶，α-甘露糖苷酶，β-甘露糖苷酶，果糖苷酶，β_果糖苷酶，木糖苷酶，α-木糖苷酶，β_木糖苷酶，半乳糖苷酶，α-半乳糖苷酶，β_半乳糖苷酶，乳糖酶，淀粉酶，α-淀粉酶，淀粉酶，芥子酶，幾丁質酶，蔗糖酶，麥芽糖酶，轉化酶，透明質酸酶，或神經(jīng)氨酸酶。在一個優(yōu)選的實施例中，編碼β -半乳糖苷酶的聚核苷酸包括IacZ基因或其片段。
[0030]可復制骨架質?？梢允悄軌蛟谒拗骶袕椭频娜魏我环N質粒。在一個實施例中，穩(wěn)定的重組表達質粒是由一個可以在蜂房哈夫尼菌中復制的骨架質粒衍生而成的。骨架質粒包括但不限于，PUC(例如pUC18和pUC19質粒)，pBR322，pACYC質粒，和它們的衍生質
粒。
[0031]此處使用的，所謂重組質?！坝稍谒拗骷毎锌蓮椭乒羌苜|粒衍生而成”，是指該重組質粒通過在骨架質粒中插入一個或多個編碼抗毒素基因的聚核苷酸，一個或多個編碼毒素基因的聚核苷酸，和/或一個或多個編碼多肽表達產(chǎn)物的聚核苷酸，和它們的任意組合來構建重組質粒。
[0032]本發(fā)明所公開的內容還包括將一個或多個在此公開的穩(wěn)定的重組質粒載體轉化進宿主菌而得到的轉化子。
[0033]這里提到的轉化子是指通過引入一個或多個穩(wěn)定的重組質粒載體而改變的宿主菌。在某些實施例中，轉化子是通過轉化向具備感受態(tài)的宿主細胞引進重組質粒載體而獲得的。
[0034]所述轉化子中帶有抗毒素基因或毒素/抗毒素基因對的質粒的穩(wěn)定性高于同樣宿主菌中不含有抗毒素基因或者毒素/抗毒素基因對的重組質粒的穩(wěn)定性。
[0035]在一個實施例中，宿主菌是一株不含有內源性質粒的蜂房哈夫尼菌。不含有內源性質粒的H.alvei株可以是天然沒有內源性質粒的菌株，也可以如前文所述是一個質粒消除后的菌株。穩(wěn)定的重組質粒載體帶有一個或多個抗毒素基因，選自abi基因，aai基因，及其片段，和/或帶有一個或多個毒素/抗毒素基因對，選自abt/abi基因對，aat/aai基因對及其片段。
[0036]本發(fā)明所公開的內容還包括一個生產(chǎn)戊二胺的方法:
[0037]Ia)培養(yǎng)一個具有在此公開的穩(wěn)定的重組表達質粒的轉化子；
[0038]Ib)用步驟Ia中得到的菌液催化賴氨酸脫羧生成戊二胺；
[0039]Ic)從步驟Ib的反應液中回收戊二胺。
[0040]在此處提到的“使用步驟Ia獲得的菌液”可能包括對步驟Ia獲得的菌液的進一步處理。例如用緩沖溶液稀釋菌液，或離心獲得菌體、再將菌體重懸于緩沖溶液中，或將菌體裂解制得裂解液，或/和從菌體裂解液中提純賴氨酸脫羧酶。
[0041]轉化子可以在含有碳源和非碳營養(yǎng)源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。碳源包含但不限于糖(碳水化合物，如葡萄糖和果糖)，油和/或脂肪，脂肪酸，和/或其衍生物。油和脂肪包括十碳以上的飽和和/或不飽和脂肪酸，如椰油，棕櫚油，棕櫚仁油等。脂肪酸可以是飽和和/或不飽和脂肪酸，如己酸，辛酸，癸酸，月桂酸，油酸，棕櫚酸，亞油酸，亞麻酸，肉豆蔻酸等。月旨肪酸衍生物包括但不限于脂肪酸酯和脂肪酸鹽。非碳營養(yǎng)源包括但不限于氮源，無機鹽和其他有機營養(yǎng)源。
[0042]例如，培養(yǎng)基包含轉化子可吸收的碳源，還可以包含一種或一種以上的其他營養(yǎng)源，如氮源、無機鹽和其他有機營養(yǎng)源。在某些實施例中，培養(yǎng)基中氮源的重量百分比占0.01至0.1%。氮源包括氨，銨鹽(如氯化銨，硫酸銨和磷酸銨)，蛋白胨，肉類提取物，酵母提取物等。無機鹽包括但不限于，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，磷酸鎂，硫酸鎂，氯化鈉等。其他有機營養(yǎng)源包括，但不限于，氨基酸(如甘氨酸，丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸和脯氨酸)，維生素(如維生素BI，維生素B12和維生素C)，等等。
[0043]菌液培養(yǎng)可以在任何能夠讓菌細胞生長的溫度下進行。較適宜的溫度在約20至40°C，或約35°C。培養(yǎng)時間可以是約I天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天或約10天左右。
[0044]在一個實施例中，轉化子的培養(yǎng)基含有肽，蛋白胨，維生素(如B族維生素)，微量元素(如氮，硫，鎂)，和礦物質。這樣的培養(yǎng)基包括，但不限于眾所周知的LB培養(yǎng)基(由胰蛋白胨、酵母提取物和NaCl溶解于水(如蒸餾水或去離子水)制成)。
[0045]在一個實施例中，步驟Ic還包括以下步驟:
[0046]Id)分離由步驟Ib所得到的反應液的固體和液體部分；
[0047]Ie)將步驟Id中得到的液體部分的pH調節(jié)到約14或更高；
[0048]If)除去步驟Ie中得到的液體中的水分；
[0049]Ig)回收戊二胺。[0050]在步驟Id中，分離步驟Ib反應液的固液部分，可以通過傳統(tǒng)的離心和/或過濾來實現(xiàn)。
[0051]在步驟Ie中，步驟Id中所得的液體成分的pH值可以通過添加堿，如氫氧化鈉來調節(jié)。氫氧化鈉可以以固體或溶液(如水溶液)的形式來添加。
[0052]在步驟If中，水份可以通過常壓或者真空蒸餾除去。
[0053]在步驟Ig中，戊二胺可以通過常壓或者真空蒸餾回收。
[0054]本發(fā)明所公開的內容，還包括用在此公開的方法所制得的生物基戊二胺。
[0055]這里提到的“生物基”的化合物是指根據(jù)ASTMD6866標準被認為是生物基的化合物。所述ASTMD6866標準指美國材料試驗標準協(xié)會ASTM D6866測試標準，其名稱為“用放射性碳分析法測定固體、液體和氣體試樣生物含量的試驗方法”(Standard Test Methodsfor Determining the Biobased Content of Solid，Liquid，and Gaseous Samples UsingRadiocarbon Analysis)，ASTM D6866是工業(yè)利用碳14測定生物質含量的標準方法。
[0056]本發(fā)明所公開的內容還包括一種聚酰胺，其包括結構式I的結構:
[0057]
【權利要求】
1.一種轉化子，其是通過將重組質粒載體轉移進入宿主細胞而獲得的，其中所述的宿主細胞是蜂房哈夫尼菌；所述的重組質粒載體包含一段編碼多肽表達產(chǎn)物的聚核苷酸，并且所述重組質粒載體由在蜂房哈夫尼菌中可復制骨架質粒衍生而成。
2.根據(jù)權利要求1所述的轉化子，其中所述的重組質粒載體是穩(wěn)定的，并且還包括一段編碼重組型抗毒素基因的聚核苷酸，其表達一種多肽，來中和對宿主細胞有毒的多肽，該有毒的多肽由一段編碼毒素基因的聚核苷酸在宿主細胞中表達。
3.根據(jù)權利要求2所述的轉化子，其中所述的重組質粒載體還包括編碼毒素基因的聚核苷酸。
4.根據(jù)權利要求3所述的轉化子，其中所述的毒素基因和抗毒素基因選自aat/aai基因對，abt/abi基因對及其片段的基因對。
5.根據(jù)權利要求3或4所述的轉化子，其中所述的毒素基因包含選自SEQID N0:1或SEQ ID NO: 3所示的DNA序列，或其片段。
6.根據(jù)權利要求1至5中的任一項所述的轉化子，其中所述的抗毒素基因包含選自SEQID NO: 2或SEQ ID NO:4所示的DNA序列，或其片段。
7.根據(jù)權利要求1所述的轉化子，其中所述的骨架質粒為包含pUC(pUC18/19)，PBR322，pACYC和其衍生質粒的任一質粒。
8.根據(jù)權利要求1至7中的任一項所述的轉化子，其中所述的蜂房哈夫尼菌是無內源性質粒的蜂房哈夫尼菌。
9.根據(jù)權利要求1至 7中的任一項所述的轉化子，其中所述的蜂房哈夫尼菌是有內源性質粒的蜂房哈夫尼菌。
10.根據(jù)權利要求1至7中的任一項所述的轉化子，其特征在于所述的蜂房哈夫尼菌為蜂房哈夫尼菌的工業(yè)菌株。
11.根據(jù)權利要求1至10中的任一項所述的轉化子，其中所述的多肽表達產(chǎn)物包含脫羧酶，水解酶和磷酸化酶中的至少一種。
12.根據(jù)權利要求11所述的轉化子，其中所述的脫羧酶是氨基酸脫羧酶。
13.根據(jù)權利要求12所述的轉化子，其中所述的脫羧酶選自賴氨酸脫羧酶，酪氨酸脫羧酶，精氨酸脫羧酶，鳥氨酸脫羧酶，或谷氨酸脫羧酶。
14.根據(jù)權利要求13所述的轉化子，其中編碼所述賴氨酸脫羧酶的聚核苷酸選自haldc基因，cadA基因以及其片段。
15.根據(jù)權利要求14所述的轉化子，其中所述的編碼賴氨酸脫羧酶的聚核苷酸是如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的DNA序列，或其片段。
16.一種生產(chǎn)1，5_戊二胺的方法，包括: Ia)培養(yǎng)如權利要求14或15所述的轉化子； Ib)用步驟Ia中得到的菌液催化賴氨酸脫羧生成1，5_戊二胺；和 Ic)從步驟Ib中得到的反應液中提取純化得到1，5_戊二胺。
【文檔編號】C12R1/01GK103667167SQ201310473169
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年5月31日 優(yōu)先權日:2012年5月2日
【發(fā)明者】龐振華, 李乃強, 劉馳 申請人:上海凱賽生物技術研發(fā)中心有限公司, 上海凱賽生物科技有限公司, 山東凱賽生物科技材料有限公司, 山東凱賽生物技術有限公司, 吉林凱賽生物技術有限公司, 凱賽生物產(chǎn)業(yè)有限公司