一種采用細(xì)胞融合技術(shù)生產(chǎn)異戊二烯的方法及其構(gòu)建的融合子的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種采用細(xì)胞融合技術(shù)生產(chǎn)異戊二烯的方法及其構(gòu)建的融合子，主要利用原生質(zhì)體融合技術(shù)，以大腸桿菌和真氧產(chǎn)堿桿菌為親本，通過(guò)以油脂為唯一碳源和抗性標(biāo)記質(zhì)粒篩選，獲得高效轉(zhuǎn)化油脂的重組細(xì)胞，并利用該融合子發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯，該方法能夠提高油脂代謝的速率、提高異戊二烯的產(chǎn)率，降低發(fā)酵成本。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種采用細(xì)胞融合技術(shù)生產(chǎn)異戊二烯的方法及其構(gòu)建的融合子
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯的方法，具體地說(shuō)涉及一種采用細(xì)胞融合技術(shù)生產(chǎn)異戊二烯的方法。
技術(shù)背景
[0002]發(fā)酵法生產(chǎn)異戊二烯的原料一般采用葡萄糖、甘油等，相關(guān)報(bào)道異戊二烯產(chǎn)率的最高水平是11%，還不能達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的要求。以葡萄糖、甘油等原料，MVA途徑的理論產(chǎn)率是25% ；以脂肪酸等油脂為原料，MVA途徑的理論產(chǎn)率是68% (以C12為例)，遠(yuǎn)高于其他原料。綜合考慮廉價(jià)的油脂原料來(lái)源廣泛，產(chǎn)率高等特點(diǎn)，相對(duì)于葡萄糖等原料，將油脂轉(zhuǎn)化生產(chǎn)異戊二烯更具有經(jīng)濟(jì)上優(yōu)勢(shì)，但是目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。
[0003]以油脂為原料，利用微生物合成其他化學(xué)品已有報(bào)道。這些微生物主要包括熱帶假絲酵母Candida tropicalis,Candida bombicola,解脂耶氏酵母Yarrowia Iipolytica,真氧產(chǎn)喊桿菌Ralstonia eutropha H16,三抱布拉霉Blakeslea trispora,裙皺假絲酵母Candida rugosa,綠膿假單胞菌Pseudomonas Aeruginosa等。真氧產(chǎn)堿桿菌能夠高效的利用植物油生產(chǎn)PHAs，油脂代謝率為2.0g/L/h左右，PHA含量為74%左右(Riedel 2012)，利用豆油合成PHA的油脂消耗速率為1.45g/L/h，產(chǎn)率在0.72~0.76g-PHA/g-soybean oil(Prihardi Kahar，2004)。以菜籽油為底物，利用解脂耶氏酵母發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸，菜籽油消耗速率為 0.7g/L/h,產(chǎn)率 150%( Svetlana V.Kamzolova, 2011)。Candida bombicola 能夠轉(zhuǎn)化菜籽油和葡萄糖，生產(chǎn)槐糖脂，產(chǎn)量達(dá)到365g/L (Young-Bum Kim, 2009)。添加豆油IOg/L,三孢布拉霉Blakeslea trispora發(fā)酵生產(chǎn)P _胡蘿卜素產(chǎn)量提高40倍,使得干菌體中(6-胡蘿卜素含量達(dá)到235mg/g DCffCFANI MANTZ0URID0U，2006)。然而上述菌株均為野生菌株，雖然油脂代謝速度快，但是遺傳背景不清楚，難以進(jìn)行改造為合成異戊二烯的生產(chǎn)菌株?！?br> [0004]目前沒(méi)有利用油脂生產(chǎn)異戊二烯的相關(guān)報(bào)道。如何找到油脂代謝能力強(qiáng)，同時(shí)遺傳背景清楚、基因操作簡(jiǎn)便的異戊二烯合成新菌株是生物法合成異戊二烯領(lǐng)域需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有異戊二烯生產(chǎn)工藝中大腸桿菌油脂代謝能力差、異戊二烯產(chǎn)率低的問(wèn)題，提供一種油脂代謝能力強(qiáng)的融合子。
[0006]該融合子于2013年8月15日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8030，分類(lèi)命名為大腸桿菌和真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的融合子，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)。
[0007]上述融合子CGMCC N0.8030是通過(guò)如下方法構(gòu)建:
[0008]將工程大腸桿菌(攜帶異戊二烯合成途徑的質(zhì)粒)和帶有慶大霉素抗性標(biāo)記的真氧產(chǎn)堿桿菌分別接種在相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期，取菌液離心收集菌體，重懸于3~IOmL蔗糖高滲溶液I (SMMP)，用終濃度0.4~2g/L的溶菌酶35~40°C，處理8~16h。然后加入8-14mL的40%聚乙二醇溶液，混勻后30°C 2分鐘進(jìn)行原生質(zhì)體融合，3000r/min離心10分鐘，棄上清液，用2mL蔗糖高滲溶液II (SMM)溶液充分懸浮，然后涂布在含有5-34mg/L氯霉素、15-100mg/L青霉素和2.55_10mg/L慶大霉素的再生培養(yǎng)基(CMR)中，30°C培養(yǎng)1-2天。融合子經(jīng)過(guò)搖瓶發(fā)酵，篩選異戊二烯產(chǎn)量最高的菌株。
[0009]本發(fā)明還提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯的方法，是利用融合子CGMCC N0.8030發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯。
[0010]是融合子CGMCC N0.8030利用油脂為底物制備異戊二烯。
[0011]本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0012]本發(fā)明提供的以油脂為底物合成異戊二烯的重組細(xì)胞和育種方法，包括利用原生質(zhì)體融合技術(shù)，以產(chǎn)生異戊二烯的工程大腸桿菌和真氧產(chǎn)堿桿菌為親本，通過(guò)以油脂為唯一碳源和抗性標(biāo)記質(zhì)粒篩選，獲得重組細(xì)胞，融合子能夠高效轉(zhuǎn)化油脂生產(chǎn)異戊二烯。
[0013]所述的產(chǎn)生異戊二烯的工程大腸桿菌主要是來(lái)源于野生型細(xì)胞或商品化細(xì)胞，可以是 BL21 (DE3)、MG1655、JM109、JM109 (DE3)、DH5 a、K12、C41、C41 (DE3)和 XLl-blue。
[0014]所述的原生質(zhì)體融合包括以下步驟:
[0015]將工程大腸桿菌(攜帶異戊二烯合成途徑的質(zhì)粒)和帶有慶大霉素抗性標(biāo)記的真氧產(chǎn)堿桿菌分別接種在相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期，取菌液離心收集菌體，重懸于3~IOmL蔗糖高滲溶液I (SMMP)，用終濃度0.4~2g/L的溶菌酶35~40°C，處理8~16h。然后加入8-14mL的40%聚乙二醇溶液，混勻后30°C 2分鐘進(jìn)行原生質(zhì)體融合，3000r/min離心10分鐘，棄上清液，用2mL蔗糖高滲溶液II (SMM)溶液充分懸浮，然后涂布在含有5-34mg/L氯霉素、15-100mg/L青霉素和2.55_10mg/L慶大霉素的再生培養(yǎng)基(CMR)中，30°C培養(yǎng)1-2天。融合子經(jīng)過(guò)搖瓶發(fā)酵，篩選異戊二烯產(chǎn)量最高的菌株。
[0016]所使用的培養(yǎng)基SMMP為6g/L牛肉膏，6g/L酵母抽提物，20g/L蛋白胨，14g/LNaCl，4g/L 葡萄糖，14.7g/L K2HPO4, 5.4g/L KH2PO4,170g/L 蔗糖，2g/L 順丁烯二酸，4g/LMgCl2 6H20, pH7.00
[0017]所使用的SMM 為 170g/L 蔗糖，2g/L 順丁烯二酸，4g/L MgCl2 6H20, pH7.0。
[0018]所使用的CMR為(I )8g瓊脂去離子水定容200mL ； (2)lmol/L琥珀酸鈉溶液500mL，pH7.3 ；(3) 5%酪蛋白水解物IOOmL ；( 4) 10%酵母膏溶液50mL ；(5) 20%葡萄糖25mL ；(6)
.3.5% K2HPO4 和 1.5% KH2PO4 溶液 IOOmL ；(7) lmol/L MgCl2 溶液 20mL,混勻。
[0019]所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基為MgS04 0.2~2g/L，KH2PO4 I~6g/L,甜菜堿0.2~2g/L,硫酸銨I~5g/L,牛肉浸粉I~10g/L,檸檬酸0.5~2g/L，檸檬酸三鈉0.5~2g/L，KCl.0.5 ~2g/L，F(xiàn)eS04 ? 7H20 20 ~100mg/L。吐溫 60 0.5 ~5g/L，DMSO 0.5 ~5g/L。
[0020]1000 倍微量元素儲(chǔ)液((NH4)6Mo7O24 ? 4H20 0.37g; ZnSO4 ? 7H20 0.29g; H3BO4
.2.47g; CuSO4 ? 5H20 0.25g;MnCl2 ? 4H20 1.58g 用蒸餾水定容至 IOOmL 過(guò)濾除菌)。
[0021]優(yōu)選，在發(fā)酵培養(yǎng)基中按照0.1%比例加入1000倍微量元素儲(chǔ)液。
[0022]本發(fā)明提供的以油脂為底物合成異戊二烯的重組細(xì)胞及其育種方法，是基于這樣的思路:首先，大腸桿菌遺傳背景清楚，基因操作方便，生長(zhǎng)速度快，能夠以葡萄糖為碳源，在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵，是生成異戊二烯的常用宿主。但是，在利用油脂生產(chǎn)異戊二烯的發(fā)酵工藝中，大腸桿菌油脂代謝速率低的問(wèn)題是整個(gè)異戊二烯生產(chǎn)工藝的瓶頸。其次，真氧產(chǎn)堿桿菌的具有極強(qiáng)的油脂代謝能力，基因組包含2個(gè)脂肪酸3氧化途徑和脂肪酶。第三，原生質(zhì)體融合技術(shù)能夠有效地結(jié)合大腸桿菌和真氧產(chǎn)堿桿菌兩個(gè)親本的優(yōu)勢(shì)，篩選出高效代謝油脂的融合子，同時(shí)具有異戊二烯的生產(chǎn)能力。第四，大腸桿菌和真氧產(chǎn)堿桿菌都屬于革蘭氏陰性菌，具有較好的同源性，有利于原生質(zhì)體的融合和基因重組。
[0023]本發(fā)明具有以下創(chuàng)新點(diǎn)和有益效果:
[0024]1、新的重組細(xì)胞油脂代謝能力強(qiáng)，同時(shí)基因操作簡(jiǎn)便。
[0025]2、新的重組細(xì)胞能夠生產(chǎn)異戊二烯 。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
[0026]圖1菌株Y3型態(tài)
[0027]圖2菌株Y5型態(tài)
[0028]圖3菌株Y6型態(tài)
【具體實(shí)施方式】
[0029]實(shí)施例1
[0030]帶有慶大霉素抗性標(biāo)記的真氧產(chǎn)堿桿菌接種在LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期，取菌液離心收集菌體，重懸于3mL蔗糖高滲溶液I (SMMP)，用終濃度0.4g/L的溶菌酶35°C，處理8h。制備真氧產(chǎn)堿桿菌的原生質(zhì)體。
[0031 ] 所使用的培養(yǎng)基SMMP為6g/L牛肉膏，6g/L酵母抽提物，20g/L蛋白胨，14g/LNaCl，4g/L 葡萄糖，14.7g/L K2HPO4, 5.4g/L KH2PO4,170g/L 蔗糖，2g/L 順丁烯二酸，4g/LMgCl2 6H20, pH7.00
[0032]所使用的SMM 為 170g/L 蔗糖，2g/L 順丁烯二酸，4g/L MgCl2 6H20, pH7.0。
[0033]實(shí)施例2
[0034]將工程大腸桿菌(攜帶異戍二烯合成途徑的質(zhì)粒,可參見(jiàn)yang, plosone, 2012)接種在LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期，取菌液離心收集菌體，重懸于IOmL蔗糖高滲溶液I (SMMP)，用終濃度2g/L的溶菌酶40°C，處理16h。制備大腸桿菌原生質(zhì)體。
[0035]然后與實(shí)施例1中獲得的真氧產(chǎn)堿桿菌的原生質(zhì)體的融合和再生。加入14mL的40%聚乙二醇溶液，混勻后30°C 2分鐘進(jìn)行原生質(zhì)體融合，3000r/min離心10分鐘，棄上清液，用2mL蔗糖高滲溶液II (SMM)溶液充分懸浮，然后涂布在含有34mg/L氯霉素、100mg/L青霉素和10mg/L慶大霉素的再生培養(yǎng)基(CMR)中，30°C培養(yǎng)1_2天。共獲得18株融合子，以月桂酸和花生油為碳源，經(jīng)搖瓶篩選，其中融合子Y3、Y5、Y6異戊二烯產(chǎn)量分別為SOmg/L、1.2mg/L 和 L 9mg/L。
[0036]該融合子Y3于2013年8月15日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8030，分類(lèi)命名為大腸桿菌和真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的融合子，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)。
[0037]所使用的培養(yǎng)基SMMP為6g/L牛肉膏，6g/L酵母抽提物，20g/L蛋白胨，14g/LNaCl，4g/L 葡萄糖，14.7g/L K2HPO4, 5.4g/L KH2PO4,170g/L 蔗糖，2g/L 順丁烯二酸，4g/LMgCl2 6H20, pH7.00[0038]所使用的SMM 為 170g/L 蔗糖，2g/L 順丁烯二酸，4g/L MgCl2 6H20, pH7.0。
[0039]所使用的CMR為(I )8g瓊脂去離子水定容200mL ； (2)lmol/L琥珀酸鈉溶液500mL，ρΗ7.3 ；(3) 5%酪蛋白水解物IOOmL ；( 4) 10%酵母膏溶液50mL ；(5) 20%葡萄糖25mL ；(6)
3.5%K2HP04 和 1.5%KH2P04 溶液 IOOmL ；(7) lmol/L MgCl2 溶液 20mL，混勻。
[0040]所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基為月桂酸5g/L，花生油5g/L，MgS04 0.2~2g/L，KH2PO4 I~6g/L,舌甘菜堿0.2~2g/L,硫酸銨I~5g/L,牛肉浸粉I~10g/L，梓檬酸0.5~2g/L,梓檬酸三鈉 0.5 ~2g/L，KCl 0.5 ~2g/L，F(xiàn)eS04.7Η20 20 ~100mg/L,吐溫 60 0.5 ~5g/L,DMSO 0.5 ~5g/L。
[0041]1000 倍微量元素儲(chǔ)液((NH4)6Mo7O24.4H20 0.37g; ZnSO4.7H20 0.29g; H3BO4
2.47g; CuSO4.5H20 0.25g;Mn Cl2.4H20 1.58g 用蒸餾水定容至 IOOmL 過(guò)濾除菌)。
【權(quán)利要求】
1.一種利用油脂生產(chǎn)異戊二烯的融合子，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8030，分類(lèi)命名為大腸桿菌和真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的融合子。
2.一種采用細(xì)胞融合技術(shù)生產(chǎn)異戊二烯的方法，是利用融合子CGMCC N0.8030發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，CGMCCN0.8030是以油脂為底物發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基為月桂酸5g/L，花生油5g/L，MgSO4 0.2~2g/L，KH2PO4 I~6g/L,甜菜堿0.2~2g/L，硫酸銨I~5g/L,牛肉浸粉I~10g/L，檸檬酸 0.5 ~2g/L，檸檬酸三鈉 0.5 ~2g/L，KCl 0.5 ~2g/L，F(xiàn)eSO4 ? 7H20 20 ~100mg/L,吐溫 60 0.5 ~5g/L, DMSO 0.5 ~5g/L。
5.權(quán)利要求1所述融合子的構(gòu)建方法，是將攜帶異戊二烯合成途徑的質(zhì)粒的大腸桿菌和帶有慶大霉素抗性標(biāo)記的真氧產(chǎn)堿桿菌分別接種在相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期，取菌液離心收集菌體，重懸于蔗糖高滲溶液I，用溶菌酶處理，然后加入聚乙二醇溶液，混勻后進(jìn)行原生質(zhì)體融合，離心棄上清液，用蔗糖高滲溶液II溶液充分懸浮，然后涂布在含有氯霉素、青霉素和慶大霉素的再生培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1-2天，篩選融合子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，將攜帶異戊二烯合成途徑的質(zhì)粒的大腸桿菌和帶有慶大霉素抗性標(biāo)記的真氧產(chǎn)堿桿菌分別接種在相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期，取菌液離心收集菌體， 重懸于3~IOmL蔗糖高滲溶液I，用終濃度0.4~2g/L的溶菌酶35~40°C，處理8~16h，然后加入8_14mL的40%聚乙二醇溶液，混勻后300C 2分鐘進(jìn)行原生質(zhì)體融合，3000r/min離心10分鐘，棄上清液，用2mL蔗糖高滲溶液II溶液充分懸浮，然后涂布在含有5-34mg/L氯霉素、15-100mg/L青霉素和2.55-10mg/L慶大霉素的再生培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)1-2天，篩選融合子。
【文檔編號(hào)】C12R1/19GK103571820SQ201310474165
【公開(kāi)日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月12日
【發(fā)明者】咸漠, 劉輝, 張海波, 鄒慧斌 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所