一種產(chǎn)高光學(xué)純度l-乳酸的干酪乳桿菌及其發(fā)酵方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產(chǎn)高光學(xué)純度L-乳酸的干酪乳桿菌及其發(fā)酵方法，是以野生型干酪乳桿菌ZW-63A為出發(fā)菌株，采用紫外誘變和硫酸二乙酯（DES）誘變,通過誘變手段獲得了一株產(chǎn)高光學(xué)純度L-乳酸的干酪乳桿菌突變菌株。所述的該突變菌株在搖瓶水平上，經(jīng)過96h的乳酸發(fā)酵后，L-乳酸產(chǎn)量為140g/L，L-乳酸光學(xué)純度為98.83%。
【專利說明】一種產(chǎn)高光學(xué)純度L-乳酸的干酪乳桿菌及其發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種產(chǎn)高光學(xué)純度L-乳酸的干酪乳桿菌及其發(fā)酵方法。
【背景技術(shù)】
[0002]干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)屬于乳桿菌屬，是革蘭氏陽性菌，不產(chǎn)芽孢，無鞭毛，不運動，兼性異型發(fā)酵乳糖，不液化明膠，最適生長溫度為37°C，G+C含量為45.6%~47.2%，菌體長短不一，兩端成方形，常成鏈；菌落粗糙，灰白色，有時呈微黃色，能發(fā)酵多種糖。
[0003]由于發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸，雖然產(chǎn)量大，但是L-乳酸的光學(xué)純度低，所以通過紫外誘變和DES誘變來提高L-乳酸的光學(xué)純度是一個經(jīng)濟可行的方法。如何培育出一株高光學(xué)純L-乳酸的突變菌株，能夠解決用發(fā)酵法L-乳酸光學(xué)純度低的缺點，以此來彌補上述缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004]本發(fā)明提供 一種干酪乳桿菌，保藏編號為CGMCC N0.8029，分類命名為干酪乳桿菌Lactobacillus casei,該菌株于2013年8月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。
[0005]上述干酪乳桿菌生產(chǎn)L-乳酸的光學(xué)純度高達(dá)98.83。
[0006]本發(fā)明還提供了一種所述干酪乳桿菌的應(yīng)用，是用CGMCC N0.8029發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。
[0007]所述發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的優(yōu)選培養(yǎng)基組成如下:葡萄糖、酵母粉、乙酸鈉、磷酸鹽、甜菜堿和微量元素液。
[0008]更進一步，優(yōu)選培養(yǎng)基組成為(g/100mL):葡萄糖16，酵母粉1，乙酸鈉0.2，KH2PO40.1，甜菜堿 0.2，MgSo4.7Η200.02，MnSO4.H2O0.005，CaCO3IO。
[0009]上述干酪乳桿菌的接種量優(yōu)選為10%。
[0010]上述發(fā)酵溫度優(yōu)選為37°C，搖床培養(yǎng)時間優(yōu)選為72h。
[0011]本發(fā)明的優(yōu)點在于:
[0012]1、通過誘變方法對干酪乳桿菌進行改造，方法簡單、誘變成本低，L-乳酸光學(xué)純度高達(dá) 98.83%。
[0013]2、誘變后所獲得菌株使得運用發(fā)酵法生產(chǎn)高光學(xué)純度的L-乳酸成為可能，有利于降低發(fā)酵成本。
[0014]3、發(fā)酵穩(wěn)定性較好，經(jīng)過多次發(fā)酵生產(chǎn)，其L-乳酸的產(chǎn)酸能力和純度比較穩(wěn)定，不發(fā)生較大程度的下降。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1CGMCC N0.8029發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸光學(xué)純度色譜圖。【具體實施方式】
[0016]本發(fā)明采用MRS培養(yǎng)基組成(g/L):蛋白胨10.0，牛肉膏8.0，酵母粉4.0，葡萄糖20.0,磷酸氫二鉀2.0,檸檬酸氫二胺2.0,乙酸鈉5.0,硫酸鎂0.2，硫酸錳0.04，吐溫-801.0，pH值5.7±0.2，于118 °C滅菌25min。YE培養(yǎng)基:15g酵母粉，20g葡萄糖，1000mL蒸餾水，酵母粉和葡萄糖分別滅菌，冷卻后混合，固體YE培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂，2%CaC03 (CaCO3與培養(yǎng)基分開滅菌)。
[0017]L-乳酸光學(xué)純度測定條件:米用Sumichiral 0A-50004.6mmX 150mm手性分離柱，流動相為2mmol/L CuS045%異丙醇，流速為lmL/min，柱溫35°C，紫外檢測波長236nm。
[0018]L-乳酸含量的測定:先將發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液混勻，移取發(fā)酵液IOOuL稀釋到500倍，10000/min離心lmin，用生物傳感分析儀測定，將三個平行的搖瓶實驗測定后取其平均值。
[0019]菌體濃度的測定:先將發(fā)酵過后的發(fā)酵液室溫靜置30min，移取上清液IOOuL稀釋50倍，利用分光光度計在波長600nm處測定菌體OD值，將三個平行的搖瓶實驗測樣后取其平均值作為OD值的測定結(jié)果，發(fā)酵液中總的OD值為0D_X稀釋倍數(shù)。
[0020]實施例1:野生型干酪乳桿菌的生長曲線的繪制
[0021]將野生型干酪乳桿菌ZW-63A為出發(fā)菌株從_80°C取出，用滅過菌的牙簽挑取之后劃線到Y(jié)E平板上，37°C恒溫培養(yǎng)2d，用牙簽挑取單克隆接種到3mL的液體無菌MRS培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，以1%的接種量轉(zhuǎn)接到100mL的滅過菌的液體MRS培養(yǎng)基中，菌種采用先靜置12h再振蕩培養(yǎng)的方式進行培養(yǎng),菌種培養(yǎng)期間每隔2h測定一次OD值,將菌液稀釋到一定濃度后，稀釋過后控制OD值在0.1~0.9之間，用紫外分光光度計在600nm處測定菌體OD值，設(shè)定三個平行重復(fù)實驗，以保證結(jié)果的可信度。由野生型干酪乳桿菌的生長曲線圖可以看出當(dāng)菌種生長至20h時菌體OD值達(dá)到最大，隨后進入穩(wěn)定期，菌體培養(yǎng)至18h時菌種處于對數(shù)生長期的旺盛時期，一次選取菌種培養(yǎng)至18h時停止培養(yǎng)，對其開始下一步的誘變。
[0022]實施例2:紫外誘變選育L-乳酸高光學(xué)純度菌株
[0023]首先紫外誘變時的菌液稀釋濃度，先將培養(yǎng)至18h的菌種放置冰上lOmin，然后在4°C的條件下5000r/min離心5min,棄上清,用滅過菌的0.9%的生理鹽水洗漆,在4°C的條件下5000r/min離心5min,棄上清,用生理鹽水洗漆2次。最后用IOOmL滅過菌的超純水溶解菌體，充分使菌體混勻。移取100uL的菌液依次稀釋至10-1'10-2'10-3.10-4.10-5.10-6.10-710_8、10_9、10,倍，每個稀釋倍數(shù)設(shè)置兩個平行重復(fù)的平板，每個稀釋的梯度都取IOOuL涂布到Y(jié)E平板上，放在37°C恒溫培養(yǎng)2d，然后計算單菌落個數(shù)。
[0024]挑取菌落數(shù)在200~300之間的濃度稀釋倍數(shù)作為紫外誘變稀釋的倍數(shù)，通過對結(jié)果計算得菌液稀釋至10_5的平板上菌落數(shù)在200~300之間，確定菌體稀釋濃度之后，再確定紫外誘變時間，誘變的時間梯度設(shè)置為:0、10、20、30、40、50、60s，每個梯度設(shè)置兩個平行，計算每個誘變時間的存活率，當(dāng)誘變時間為60s時，存活率為34.23%，接近于30%的存活率，此時誘變正突變率高，所以最后誘變時間選取60s作為最適誘變時間。
[0025]確定好紫外誘變稀釋濃度和誘變時間之后，在菌液稀釋10_5倍和紫外線照射60s的條件下進行誘變，上述所有的紫外誘變操作都是先將菌液涂布到平板上然后再進行紫外燈照射。[0026]紫外誘變后，在37°C恒溫培養(yǎng)2d之后，長出單克隆，每批用牙簽挑12個單克隆接入到裝有3mL滅過菌的液體MRS培養(yǎng)基試管中，以1/100的的比例轉(zhuǎn)接到IOOmL滅過菌的液體MRS培養(yǎng)基中，37°C先靜置12h再150r/min搖床培養(yǎng)至20h，以10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為100mL，37°C、150r/min搖床培養(yǎng)72h，發(fā)酵結(jié)束后測定L-乳酸的產(chǎn)量和光學(xué)純度，與出發(fā)菌株的L-乳酸的光學(xué)純度和產(chǎn)量作對比，篩選出L-乳酸光學(xué)純度和產(chǎn)量都提高的最高的突變菌株作為下一步硫酸二乙酯(DES)誘變的出發(fā)菌株。
[0027]實施例3:用硫酸二乙酯(DES)對紫外誘變獲得的突變菌株進行誘變選育和穩(wěn)定性試驗
[0028]將紫外誘變篩選到的L-乳酸高光學(xué)純度的突變菌株劃到Y(jié)E平板上，在37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，長出單克隆之后，用滅過菌的牙簽條單克隆菌落接到3mL滅過菌的液體MRS培養(yǎng)基中，37°C、150r/min過夜搖床培養(yǎng)，以1/100的比例轉(zhuǎn)接到IOOmL滅過菌的液體MRS培養(yǎng)基中，37°C先靜置培養(yǎng)12h再150r/min振蕩培養(yǎng)到20h，然后放置到冰上30min，在無菌操作臺中將菌液依次轉(zhuǎn)移到滅過菌的50mL的離心管中，5000r/min離心5min，收集菌體沉淀，用滅過菌的0.9%生理鹽水洗滌2次，最后用20mL的0.9%的生理鹽水溶解并定容至20mL，加入一定體積分?jǐn)?shù)的DES溶液(DES溶液配比:50%體積分?jǐn)?shù)的無水乙醇和50%體積分?jǐn)?shù)的DES)，處理一定時間，按照加入DES體積的10倍來加入5%的Na2S2O3溶液終止反應(yīng)，通過改變DES的體積分?jǐn)?shù)和誘變處理時間來來控制存活率，依次確定誘變的最適DES體積分?jǐn)?shù)和處理時間。
[0029]1、DES體積分?jǐn)?shù)對存活率的影響
[0030]設(shè)定DES體積分?jǐn)?shù)為0.5%、0.75%、1%、1.25%和1.5%,每個DES體積分?jǐn)?shù)做兩個平行重復(fù)試驗，分別測定存活率，當(dāng)DES體積分?jǐn)?shù)為1%時，存活率為23.5%，此時誘變的正突變率高，當(dāng)DES小于1%時，存活率迅速增加，這是因為相同時間內(nèi)小劑量的DES不足以作用于所有的菌，所以`會隨著DES體積分?jǐn)?shù)的降低存活率會迅速增加，當(dāng)DES體積分?jǐn)?shù)為1.5%時，存活率為1.5%,近似幾乎所有菌體都已致死，綜合考慮，所以選擇1%的DES體積分?jǐn)?shù)作為最適的誘變體積分?jǐn)?shù)。
[0031]2、誘變時間對存活率的影響
[0032]DES 誘變處理時間設(shè)置為 15min、20min、25min、30min、35min 和 40min。剛開始隨著誘變時間的增加，存活率降低速度較快，當(dāng)達(dá)到30min時，存活率降低的速度開始變緩，分析原因可能是誘變時間較少時，DES —直作用于菌體致使菌體不斷死亡，當(dāng)達(dá)到40min時菌體幾乎全部致死，綜合考慮，選擇誘變處理時間為30min為最適。
[0033]確定DES誘變的體積分?jǐn)?shù)和誘變處理時間之后，進行如下操作:將誘變之后的菌液用2mL的5%的Na2S2O3終止反應(yīng)，用0.9%的生理鹽水洗滌三次，最后用20mL的滅過菌的超純水溶解菌體并定容至20mL，取IOOuL的菌懸液，稀釋至10_5倍，將其涂布到Y(jié)E平板上，37°C恒溫培養(yǎng)2d，用牙簽挑取12個單克隆到3mL的滅過菌的液體MRS培養(yǎng)基中，以1/100的比例轉(zhuǎn)接到IOOmL的滅過菌的液體MRS培養(yǎng)基中，37°C靜置12h然后150r/min搖床培養(yǎng)至20h，以10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為100mL，37°C、150r/min培養(yǎng)72h，分別測定L-乳酸的光學(xué)純度和產(chǎn)量。通過DES誘變最終篩選出一株L-乳酸光學(xué)純度為98.83%，搖瓶上L-乳酸產(chǎn)量為140g/L的突變菌株，并將其命名為ZW-63B。
[0034]將DES誘變獲得突變菌株ZW-63B接種到滅過菌的液體MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20h后以10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵72h之后測定L-乳酸的光學(xué)純度和產(chǎn)量，然后將培養(yǎng)20h的種子培養(yǎng)基以1%的比例轉(zhuǎn)接到IOOmL的滅過菌的液體MRS培養(yǎng)基中，再次培養(yǎng)20h，以10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，重復(fù)此步驟5次。最后終極突變株的L-乳酸光學(xué)純度色譜圖見圖1，傳代實驗中，第五代和第一代的L-乳酸產(chǎn)量和光學(xué)純度見表1。誘變前后，L-乳酸產(chǎn)量和L-乳酸光學(xué)純度變化如表2所示。
[0035]表1穩(wěn)定性實驗,第一代出發(fā)菌株與第五代的L-乳酸產(chǎn)量和光學(xué)純度
[0036]
【權(quán)利要求】
1.一種干酪乳桿菌，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為 CGMCC N0.8029。
2.權(quán)利要求1所述的干酪乳桿菌用于發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，以保藏編號為CGMCCN0.8029的干酪乳桿菌接入培養(yǎng)基，發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的培養(yǎng)基包括:葡萄糖、酵母粉、乙酸鈉、磷酸鹽、甜菜堿和微量元素液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/100mL)為:葡萄糖 16，酵母粉 I，乙酸鈉 0.2，KH2PO4 0.1，甜菜堿 0.2，MgS04.7Η20 0.02，MnSO4.H2O0.005，CaCO3 10。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述干酪乳桿菌的接種量為10%。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為37V。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，搖床培養(yǎng)時間為72h。
【文檔編號】C12R1/245GK103642711SQ201310474231
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月12日
【發(fā)明者】咸漠, 鄒慧斌, 劉煒, 程濤 申請人:中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所