一種降解白酒酒糟纖維素的擴(kuò)展青霉菌株的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種降解白酒酒糟纖維素的擴(kuò)展青霉菌株。該降解白酒酒糟纖維素的擴(kuò)展青霉菌株，命名為擴(kuò)展青霉菌PenicilliumexpansumN53，本發(fā)明所述擴(kuò)展青霉（Penicilliumexpansum）N53可將白酒酒糟中的纖維素降解成葡萄糖，且具有纖維素酶酶活高，纖維素轉(zhuǎn)化生成葡萄糖的轉(zhuǎn)化率高等特點(diǎn)，極大程度上提高了白酒酒糟的利用率，對(duì)于后續(xù)生成蛋白飼料提供了保證，是一株極具研究開(kāi)發(fā)價(jià)值的白酒酒糟纖維素分解菌株。利用擴(kuò)展青霉（Penicilliumexpansum）發(fā)酵降解白酒酒糟纖維素的研究較少。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種降解白酒酒糟纖維素的擴(kuò)展青霉菌株
[0001](一)【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種降解白酒酒糟纖維素的擴(kuò)展青霉菌株。
[0002](二)【背景技術(shù)】
白酒酒糟是白酒生產(chǎn)中的副產(chǎn)物。由于白酒酒糟呈酸性，且含有未能完全利用的淀粉、蛋白質(zhì)及各種氨基酸、維生素、礦物元素等營(yíng)養(yǎng)成分，是微生物生長(zhǎng)的良好基質(zhì)，若未能及時(shí)處理，會(huì)對(duì)酒糟存放地周邊帶來(lái)嚴(yán)重的污染，不符合我國(guó)大力建設(shè)資源節(jié)約型、環(huán)境友好型社會(huì)的發(fā)展方針。近年來(lái)，白酒產(chǎn)業(yè)的日趨發(fā)展，僅2012年1-11月，全國(guó)白酒產(chǎn)量高達(dá)1023.32萬(wàn)千升，比2011年同期增長(zhǎng)了 112.02萬(wàn)千升。因此，白酒酒糟的綜合利用對(duì)于我國(guó)構(gòu)建節(jié)約型社會(huì)和環(huán)境保護(hù)方面具有十分重要的意義。
[0003]據(jù)統(tǒng)計(jì)，每100g白酒糟中就含有粗蛋白10_16g、粗纖維18_24g、粗脂肪3.83g、鈣0.21g、磷 0.38g、維生素 A 625mg、維生素 B 27.9 mg、維生素 C 37.5 mg、維生素 PP419.92mg、煙酰胺182.69 mg等[1]。纖維素是由葡萄糖分子以β _1，4糖苷鍵組成的大分子多糖，由于含有許多高能氫鍵，因此較難被一般微生物分解、利用。半纖維素是由幾種不同類(lèi)型的單糖構(gòu)成的異質(zhì)多聚體，單糖聚合體間分別以共價(jià)鍵、氫鍵、醚鍵和酯鍵連接，他們與伸展蛋白、其他結(jié)構(gòu)蛋白、壁酶、纖維素和果膠等構(gòu)成具有一定硬度和彈性的細(xì)胞壁，因而呈現(xiàn)穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0004]目前，國(guó)內(nèi)對(duì)白酒酒糟的應(yīng)用研究主要是利用酒糟生產(chǎn)飼料蛋白、直接烘干作為生產(chǎn)飼料[2]、提取植酸和植酸鈣及復(fù)合氨基酸等物質(zhì)[3，4]、制取甘油[3]、用于原酒再生產(chǎn)、制備糖用活性炭、釀醋、厭氧發(fā)酵回收沼氣、培養(yǎng)食用菌[3]等方面。但從解決酒糟的徹底性角度考慮，目前只有直接或發(fā)酵后用作飼料、農(nóng)肥方面可以從根本上解決酒糟廢棄物的污染問(wèn)題[1]。隨著當(dāng)今社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們對(duì)于生態(tài)環(huán)境更加注重，因而在白酒生產(chǎn)中更加注重其對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響，最大限度地利用資源，并盡可能地減少對(duì)環(huán)境的污染，把生產(chǎn)過(guò)程中各階段的副產(chǎn)物及廢棄物資源化利用，從而保護(hù)環(huán)境，達(dá)到人與自然環(huán)境協(xié)調(diào)發(fā)展。
[0005]由于白酒酒糟中粗纖維含量較高，直接利用酒糟生產(chǎn)菌體蛋白具有產(chǎn)值較低、利用不完全等缺點(diǎn)。因此選擇一株能夠分解利用白酒酒糟中的纖維素和半纖維素，將其轉(zhuǎn)化為較易被微生物吸收利用的葡萄糖，對(duì)于利用白酒酒糟生產(chǎn)菌體蛋白具有顯著地影響，能夠極大程度上提高白酒酒糟的利用率。發(fā)酵后的飼料營(yíng)養(yǎng)更均衡，含有豐富的維生素、多種微生物酶、生物活性物質(zhì)及成長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，動(dòng)物更易吸收利用，解決了目前配合飼料中營(yíng)養(yǎng)水平低、吸收效率不高的問(wèn)題。目前，能夠降解纖維素的菌株有很多，主要為綠色木霉、康寧木霉及黑曲霉Μ等幾個(gè)菌株。然而現(xiàn)在這些已研究或應(yīng)用的纖維素分解菌株仍存在著酶活活性不穩(wěn)定、纖維素降解能力差、產(chǎn)酶成本高等問(wèn)題，難以應(yīng)用在白酒酒糟的纖維素降解中。本專(zhuān)利利用篩選得到的一株擴(kuò)展青霉菌(Penicillium expansum)菌株分解利用白酒酒糟，產(chǎn)纖維素酶的酶活較高，性能穩(wěn)定，是一種具有應(yīng)用潛力的白酒酒糟稻殼纖維素降解菌株。
[0006](三)
【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)·的不足，提供了一種降解白酒酒糟纖維素的擴(kuò)展青霉菌株，該菌株可有效地將纖維素降解成葡萄糖，其纖維素酶的酶活較高，性能穩(wěn)定，是一株極具研究開(kāi)發(fā)價(jià)值的白酒酒糟纖維素降解菌株。
[0007]本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
一種降解白酒酒糟纖維素的擴(kuò)展青霉菌株，其特殊之處在于:命名為擴(kuò)展青霉菌Penicillium expansum N53,該菌株的 18S rDNA 序列如下:
tctagtataa gcactttata ctgtgaaact gcgaatggct cattaaatca gttatcgttt60
atttgatagt accttactac atggatacct gtggtaattc tagagctaat acatgctaaa120
aaccccgact tcaggaaggg gtgtatttat tagataaaaa accaacgccc ttcggggctc180
cttggtgaat cataataact taacgaatcg catggccttg cgccggcgat ggttcattca240
aatttctgcc ctatcaactt tcgatggtag gatagtggcc taccatggtg gcaacgggta300
acggggaatt agggttcgat tccggagagg gagcctgaga aacggctacc acatccaagg360
aaggcagcag gcgcgcaaat tacccaatcc cgatacgggg aggtagtgac aataaatact420
gatacggggc tcttttgggt ctcgtaattg gaatgagaac aatttaaatc ccttaacgag480
gaacaattgg agggcaagtc tggtgccagc agccgcggta attccagctc caatagcgta540
tattaaagtt gttgcagtta aaaagctcgt agttgaacct tgggtctggc tggccggtcc600
gcctcaccgc gagtactgtc cggctggacc tttccttctg gggaacctca tggccttcac660
tggctgtggg gggaaccagg acttttactg tgaaaaaatt agagtgttca aagcaggcct720
ttgctcgaat acattagcat ggaataatag aataggacgt gcggttctat tttgttggtt780
tctaggaccg ccgtaatgat taatagggat agtcgggggc gtcagtattc agctgtcaga840
ggtgaaattc ttggatttgc tgaagactaa ctactgcgaa agcattcgcc aaggatgttt900
tcattaatca gggaacgaaa gttaggggat cgaagacgat cagataccgt cgtagtctta960
accataaact atgccgacta gggatcggac gggattctat gatgacccgt tcggcacctt1020
acgagaaatc aaagtttttg ggttctgggg ggagtatggt cgcaaggctg aaacttaaag1080
aaattgacgg aagggcacca caaggcgtgg agcctgcggc ttaatttgac tcaacacggg1140
gaaactcacc aggtccagac aaaataagga ttgacagatt gagagctctt tcttgatctt1200
ttggatggtg gtgcatggcc gttcttagtt ggtggagtga tttgtctgct taattgcgat1260
aacgaacgag acctcggccc ttaaatagcc cggtccgcat ttgcgggccg ctggcttctt1320
agggggacta tcggctcaag ccgatggaag tgcgcggcaa taacaggtct gtgatgccct1380
tagatgttct gggccgcacg cgcgctacac tgacagggcc agcgagtaca tcaccttggc1440
cgagaggtct gggtaatctt gttaaaccct gtcgtgctgg ggatagagca ttgcaattat1500
tgctcttcaa cgaggaatgc ctagtaggca cgagtcatca gctcgtgccg attacgtccc1560
tgccctttgt acacaccgcc cgtcgctact accgattgaa tggctcagtg aggccttcgg1620
actggctcag gagggttggc aacgaccccc cagagccgga aagttggtca aactcggtca1680
ttagagaa1688，上述18S rDNA序列全長(zhǎng)1688個(gè)核苷酸 。
[0008]本發(fā)明所述產(chǎn)降解白酒酒糟纖維素的擴(kuò)展青霉菌(Penicillium expansum)N53是一株通過(guò)自然選育獲得的擴(kuò)展青霉菌株，菌株已于2013年3月5日保藏在“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，保藏號(hào)為CGMCC N0.7275。
[0009]上述降解白酒酒糟纖維素的擴(kuò)展青霉菌N53，其生物學(xué)特征(6)是:在固體培養(yǎng)(分離培養(yǎng)基)平板上30°C培養(yǎng)96h后觀察，菌落圓形鋪展，向四周成輻射狀，中間成絨狀，孢子成暗綠色，有白色的邊緣，最后變?yōu)楹稚９鈱W(xué)顯微鏡下觀察菌體分生孢子梗有隔膜且較長(zhǎng)，比較光滑，頂端排列成帚狀的分枝，分枝1-2次，頂層以切離法生成分生孢子，分生孢子串呈不分枝的鏈狀，單個(gè)孢子成橢圓形，光滑無(wú)色。
[0010]對(duì)本發(fā)明的菌株CGMCC N0.7275測(cè)定18S rDNA的基因序列的結(jié)果顯示，該菌屬于擴(kuò)展青霉，測(cè)序核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0011]通過(guò)使用美國(guó)生物工程信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI ) BLAST 程序比對(duì)，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的 CGMCC N0.7275 菌株 18S rDNA 的基因序列與 NCBI 注冊(cè)的擴(kuò)展青梅(Penicillium expansum) HDJZ-ZWM-17 (⑶227344) 18SrDNA的基因序列具有高度同源性，并結(jié)合生理生化實(shí)驗(yàn)，初步鑒定CGMCC N0.7275菌株是一株擴(kuò)展青梅(Penicillium expansum)。
[0012]上述用于菌體形態(tài)觀察的固體培養(yǎng)基組成:CMC-Na 10 g/L、K2HPO4.3H20 2 g/L、(NH4) 2S04 4 g/L、MgSO4.7H20 0.1 g/L、FeSO4
?7H20 0.15 g/L、蛋白胨 5 g/L、酵母膏 3 g/L、瓊脂 20 g/L, pH 自然。
[0013]本發(fā)明所述的降解白酒酒糟纖維素的擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)菌種選育的基本方法是:
使用篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)都得到單菌落，加入剛果紅溶液染色，再經(jīng)過(guò)NaCl溶液脫色篩選得到透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株，再將其接入到液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，選取纖維素酶酶活較高的菌株，經(jīng)過(guò)多次分離純化，獲得擴(kuò)展青霉N53菌株(CGMCC N0.7275)，其中剛果紅溶液染色2h，NaCl溶液中NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，脫色lh。
[0014]本發(fā)明所述的降解白酒酒糟纖維素的擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)在白酒酒糟纖維素降解中的應(yīng)用。
[0015]利用擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)降解白酒酒糟纖維素的方法如下:
搖瓶發(fā)酵:取30°C培養(yǎng)3-4天的新鮮斜面倒入無(wú)菌水刮取孢子制備孢子懸液，接種發(fā)酵培養(yǎng)基，35°C搖瓶發(fā)酵72小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束測(cè)定纖維素酶酶活及纖維素含量，纖維素酶活最高可達(dá)10_14u/ml,纖維素轉(zhuǎn)化率為60-80%。
[0016]固體發(fā)酵:30°C培養(yǎng)3-4天的新鮮斜面倒入無(wú)菌水刮取孢子制備孢子懸液，按3%的接種量接入到預(yù)先準(zhǔn)備好的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C靜置培養(yǎng)48h，發(fā)酵結(jié)束測(cè)定發(fā)酵培養(yǎng)基中的纖維素酶酶活和纖維素含量，纖維素酶活最高可達(dá)ll_15u/ml，纖維素轉(zhuǎn)化率為65%-85%。
[0017]上述篩選用平板培養(yǎng)基組成為:CMC-Na10 g/L,K2HPO4.3Η20 2 g/L、(NH4) 2SO4 4g/L、MgSO4.7H20 0.1 g/L、FeSO4.7H20 0.15 g/L、蛋白胨 5 g/L、酵母膏 3 g/L、瓊脂 20g/L, pH 自然;
上述斜面培養(yǎng)基組成為:土豆200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L，pH值自然；
上述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:白酒酒糟10-90 g/L、麩皮10-90g/L (兩者比例從1:9至9:1 均可)、豆柏 5-40 g/L、(NH4) 2S04 0-20 g/L、KH2PO4 0-4 g/L、MgSO4.7H20 0-1.5 g/L、GaC12.2H20 0.05-1 g/L、MnSO4.H2O 0-0.4 g/L、ZnSO4.7H20 0-0.2 g/L, pH4.0-8.0。
[0018]上述固體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:白酒酒糟與麩皮的比例為7:3、料液比為1:0.8，其中營(yíng)養(yǎng)液中豆柏 5-40 g/L、(NH4) 2S04 0-20 g/L、KH2P040_4g/L、MgSO4.7H20 0-1.5 g/L、GaC12.2H20 0.05-1 g/L、MnSO4.H2O 0-0.4 g/L、ZnSO4.7H20 0-0.2 g/L, pH4.0-8.0。[0019]上述纖維素酶活按下述方法測(cè)定:
使用DNS閉塞法測(cè)定。測(cè)定原理是纖維素酶能將羧甲基纖維素降解成寡糖和單糖，而寡糖和單糖能在沸水浴條件下與DNS試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，反應(yīng)顏色的強(qiáng)度與酶解產(chǎn)生的還原糖量成正比，其又與反應(yīng)液中的纖維素酶的活力成正比。
[0020]上述纖維素含量按下述方法測(cè)定:
使用硫酸蒽酮比色法測(cè)定。測(cè)定原理是纖維素在酸性條件下加熱水解成葡萄糖，然后在濃硫酸作用下，單糖脫水生成糠醛類(lèi)化合物，利用蒽酮試劑與糠醛類(lèi)化合物的藍(lán)綠色反應(yīng)即可進(jìn)行比色測(cè)定。
[0021 ] 上述纖維素轉(zhuǎn)化率測(cè)定按下述方法測(cè)定:
纖維素轉(zhuǎn)化率(％)=[初始培養(yǎng)基中纖維素含量(g/L)-發(fā)酵后培養(yǎng)基中纖維素含量(g/L)]/初始培養(yǎng)基中纖維素含量(g/L)
由于白酒酒糟中粗纖維含量較高，因而對(duì)其中的半纖維素進(jìn)行酸解，提取具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的木糖，而后再將提取木糖后的白酒酒糟進(jìn)行纖維素降解，使降解后的白酒酒糟生產(chǎn)的蛋白飼料營(yíng)養(yǎng)更加全面、充足，并實(shí)現(xiàn)白酒酒糟的全面利用。[0022]本發(fā)明所述擴(kuò)展青霉(Penici 11 ium expansum)N53可將白酒酒糟中的纖維素降解成葡萄糖，且具有纖維素酶酶活高，纖維素轉(zhuǎn)化生成葡萄糖的轉(zhuǎn)化率高等特點(diǎn)，極大程度上提高了白酒酒糟的利用率，對(duì)于后續(xù)生成蛋白飼料提供了保證，是一株極具研究開(kāi)發(fā)價(jià)值的白酒酒糟纖維素分解菌株。利用擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)發(fā)酵降解白酒酒糟纖維素的研究較少。
[0023](四)【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0024]本發(fā)明提供的擴(kuò)展青霉菌株菌(Penicillium expansum) N53,已于2013年3月5日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院，郵政編碼:100080，其保藏編號(hào)為CGMCC N0.7275。
[0025]圖1擴(kuò)展青霉菌(Penicillium expansum) N53平板透明圈；
圖2擴(kuò)張青霉菌(Penicillium expansum) N53菌落形態(tài)圖；
圖3擴(kuò)張青霉菌(Penicillium expansum) N53光學(xué)顯微鏡下分生孢子梗；
圖4擴(kuò)張青霉菌(Penicillium expansum) N53構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
[0026](五)【具體實(shí)施方式】
實(shí)施例1降解白酒酒糟纖維素?cái)U(kuò)展青霉菌株的篩選
白酒酒糟及土樣中的微生物經(jīng)富集培養(yǎng)后，梯度稀釋至適當(dāng)濃度涂布到篩選培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)3-4天，挑取單菌落轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)3-4天，然后劃線到篩選培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)，待長(zhǎng)出單菌落后加入其質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的剛果紅溶液染色2h，再經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為l%NaCl溶液脫色lh，觀察有無(wú)透明圈的產(chǎn)生，并記錄透明圈直徑及菌落直徑的大小，如圖1。選取透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株進(jìn)行復(fù)篩。將初篩分離得到的菌株接種到液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，300C、180r/min培養(yǎng)3天后，測(cè)定各菌株發(fā)酵液的纖維素酶酶活，選取酶活較高的菌株。將測(cè)定出的纖維素酶酶活較高的菌株以一株接三瓶的方式接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C、180r/min培養(yǎng)3天后，測(cè)定各菌株纖維素酶的酶活，最終篩選出一株酶活較高且穩(wěn)定的菌株，命名為擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum) N53。[0027]上述菌株擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)N53,已于2013年3月5日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址:北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)，郵政編碼:100080，其保藏編號(hào)為CGMCC N0.7275。
[0028]上述富集培養(yǎng)基組成為:CMC-Na10 g/L、K2HPO4.3H20 I g/L、Na2CO3 5 g/L、MgSO4.7H20 0.1 g/L、FeSO4.7H20 0.15 g/L、蛋白胨 10 g/L、酵母膏 10 g/L, pH 自然;
上述平板分離培養(yǎng)基組成為=CMC-Na 10 g/L、K2HPO4.3H20 2 g/L、(NH4) 2SO4 4 g/L、MgSO4.7Η20 0.1 g/L,FeSO4.7H20 0.15 g/L、蛋白胨 5 g/L、酵母膏 3 g/L、瓊脂 20 g/L,pH自然；
上述斜面培養(yǎng)基組成為:土豆200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L, pH自然。
[0029]上述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:白酒酒糟10-90 g/L、麩皮10_90g/L(兩者比例從1:9 至 9:1 均可)、豆柏 5-40 g/L、(NH4) 2S04 0-20 g/L、KH2PO4 0-4 g/L、MgSO4.7H20 0-1.5 g/UGaC12.2H20 0.05-1 g/L、MnSO4.H2O 0-0.4 g/L、ZnSO4.7H20 0-0.2 g/L, pH4.0-8.0。
[0030]上述降解白酒酒糟纖維素的擴(kuò)展青霉菌N53，其生物學(xué)特征(6)是:在固體培養(yǎng)(分離培養(yǎng)基)平板上30°C培養(yǎng)96h后觀察，菌落圓形鋪展，向四周成輻射狀，中間成絨狀，孢子成暗綠色，有白色的邊緣，最后變?yōu)楹稚?，如圖2所示。光學(xué)顯微鏡下觀察菌體分生孢子梗有隔膜且較長(zhǎng)，比較光滑，頂端排列成帚狀的分枝，分枝1-2次，頂層以切離法生成分生孢子，分生孢子串呈不分枝的鏈狀，單個(gè)孢子成橢圓形，光滑無(wú)色，如圖3所示。
[0031]上述用于菌體形態(tài)觀察的固體培養(yǎng)基組成:
CMC-Na 10 g/L、K2HPO4.3H20 2 g/L、(NH4) 2S04 4 g/L、MgSO4.7H20 0.1 g/L、FeSO4
?7H20 0.15 g/L、蛋白胨 5 g/L、酵母膏 3 g/L、瓊脂 20 g/L, pH 自然。
[0032]實(shí)施例2 擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum) CGMCC N0.7275 18S rDNA 測(cè)序 將實(shí)施例1選育得到的白酒酒糟纖維素降解菌株N53即CGMCC N0.7275菌株委托濟(jì)南
力戈科技有限公司進(jìn)行18S rDNA測(cè)序。
[0033]實(shí)驗(yàn)方法是:挑取斜面培養(yǎng)物于700 μ 165°C預(yù)熱的FPCB Solution和7 μ I β -巰基乙醇中，65°C水浴后離心取上清液作為模板，使用UNIQ-10 Genomic DNA Preps KU，以NS1、NS6為引物，擴(kuò)增目的片段。取5μ I進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使用UNIQ-10 Spin ColumnDNA Gel Extraction Kit 切膠回收目的片斷，以 Seq ForwarcUSeq Reverse Seq Internal為引物對(duì)上述回收產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序。
[0034]測(cè)序結(jié)果:擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum)CGMCC N0.7275 18S rDNA測(cè)序核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0035]通過(guò)使用美國(guó)生物工程信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NcBI ) BLASTN 程序比對(duì)，發(fā)現(xiàn) CGMCC N0.7275 菌株 18S rDNA 序列與NCBI 注冊(cè)的擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum) HDJZ-ZWM-17 18S rDNA 序列具有高度同源性，結(jié)合菌落形態(tài)及鏡檢觀察，如圖2及圖3，說(shuō)明CGMCC N0.7275菌株是一株擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)。
[0036]擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum) N53 序列表:
SEQ ID N0.1
SEQUENCE LISTING
<110>山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院〈120〉一種降解白酒酒糟纖維素的擴(kuò)展青霉菌株〈130〉 2012-11-15〈160〉 I
<170> PatentIn version 3.3〈210〉 I〈211〉 1688〈212〉 DNA <213> 擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)
〈400〉 I
tctagtataa gcactttata ctgtgaaact gcgaatggct cattaaatca gttatcgttt60
atttgatagt accttactac atggatacct gtggtaattc tagagctaat acatgctaaa120
aaccccgact tcaggaaggg gtgtatttat tagataaaaa accaacgccc ttcggggctc180
cttggtgaat cataataact taacgaatcg catggccttg cgccggcgat ggttcattca240
aatttctgcc ctatcaactt tcgatggtag gatagtggcc taccatggtg gcaacgggta300
acggggaatt agggttcgat tccggagagg gagcctgaga aacggctacc acatccaagg360
aaggcagcag gcgcgcaaat tacccaatcc cgatacgggg aggtagtgac aataaatact420
gatacggggc tcttttgggt ctcgtaattg gaatgagaac aatttaaatc ccttaacgag480
gaacaattgg agggcaagtc tggtgccagc agccgcggta attccagctc caatagcgta540
tattaaagtt gttgcagtta aaaagctcgt agttgaacct tgggtctggc tggccggtcc600
gcctcaccgc gagtactgtc cggctggacc tttccttctg gggaacctca tggccttcac660
tggctgtggg gggaaccagg acttttactg tgaaaaaatt agagtgttca aagcaggcct720
ttgctcgaat acattagcat ggaataatag aataggacgt gcggttctat tttgttggtt780
tctaggaccg ccgtaatgat taatagggat agtcgggggc gtcagtattc agctgtcaga840
ggtgaaattc ttggatttgc tgaagactaa ctactgcgaa agcattcgcc aaggatgttt900
tcattaatca gggaacgaaa gttaggggat cgaagacgat cagataccgt cgtagtctta960
accataaact atgccgacta gggatcggac gggattctat gatgacccgt tcggcacctt1020
acgagaaatc aaagtttttg ggttctgggg ggagtatggt cgcaaggctg aaacttaaag1080
aaattgacgg aagggcacca caaggcgtgg agcctgcggc ttaatttgac tcaacacggg1140
gaaactcacc aggtccagac aaaataagga ttgacagatt gagagctctt tcttgatctt1200
ttggatggtg gtgcatggcc gttcttagtt ggtggagtga tttgtctgct taattgcgat1260
aacgaacgag acctcggccc ttaaatagcc cggtccgcat ttgcgggccg ctggcttctt1320
agggggacta tcggctcaag ccgatggaag tgcgcggcaa taacaggtct gtgatgccct1380
tagatgttct gggccgcacg cgcgctacac tgacagggcc agcgagtaca tcaccttggc1440
cgagaggtct gggtaatctt gttaaaccct gtcgtgctgg ggatagagca ttgcaattat1500
tgctcttcaa cgaggaatgc ctagtaggca cgagtcatca gctcgtgccg attacgtccc1560
tgccctttgt acacaccgcc cgtcgctact accgattgaa tggctcagtg aggccttcgg1620
actggctcag gagggttggc aacgaccccc cagagccgga aagttggtca aactcggtca1680
ttagagaa1688實(shí)施例3 擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum) CGMCC N0.7275菌株的應(yīng)用將擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum) CGMCC N0.7275菌株移接斜面活化；
按上述斜面培養(yǎng)基的組成配置斜面培養(yǎng)基，劃線30°C 3-4天后，倒入無(wú)菌水刮取孢子制備孢子懸液。按白酒酒糟10-90 g/L、麩皮10-90g/L(兩者比例從1:9至9:1均可)、豆柏5-40 g/L、(NH4) 2S04 0-20 g/L、KH2P04 0-4 g/L、MgS04.7H20 0-1.5 g/L、GaC12.2H20
0.05-1 g/L、MnS04.H20 0-0.4 g/L、ZnS04.7H20 0-0.2 g/L, pH4.0-8.0 培養(yǎng)基的組成配制發(fā)酵培養(yǎng)基，初始纖維素含量為248g/L (根據(jù)前面麩皮及酒糟的含量適當(dāng)變化)，250ml三角瓶裝液量為30ml，121 °C蒸汽滅菌20分鐘，冷卻至室溫，接種孢子懸液液1ml，置旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速為150-220r/min、旋轉(zhuǎn)半徑為40mm搖床上，25-37°C培養(yǎng)64-72小時(shí)結(jié)束發(fā)酵，發(fā)酵液以4000 r/min離心10分鐘,取上清液測(cè)定纖維素酶酶活為10_14u/ml,沉淀測(cè)定纖維素含量為57 g/L,纖維素轉(zhuǎn)化率為60-80%。
[0037]或者:
按上述斜面培養(yǎng)基的組成配置斜面培養(yǎng)基，劃線30°C 3-4天后，倒入無(wú)菌水刮取孢子制備孢子懸液。按白酒酒糟與麩皮的比例為7:3、料液比為1:0.8，其中營(yíng)養(yǎng)液中豆柏5-40g/L、(NH4) 2S04 0-20 g/L、KH2P040_4g/L、MgSO4.7H20 0-1.5 g/L、GaC12.2H20 0.05-1 g/L、MnSO4.H2O 0-0.4 g/L、ZnSO4.7H20 0-0.2 g/L, pH4.0-8.0 上述固體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成配制發(fā)酵培養(yǎng)基，初始纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21.7%，121 °C蒸汽滅菌20分鐘，冷卻至室溫，按3%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，25-37°C靜置培養(yǎng)36-48h，發(fā)酵結(jié)束測(cè)定發(fā)酵培養(yǎng)基中的纖維素酶酶活力和纖維素含量，纖維素酶活最高可達(dá)ll-15u/ml，纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.23%，纖維素轉(zhuǎn)化率為65-85%。
[0038]上述纖維素酶活 按下述方法測(cè)定:
使用DNS閉塞法測(cè)定。測(cè)定原理是纖維素酶能將羧甲基纖維素降解成寡糖和單糖，而寡糖和單糖能在沸水浴條件下與DNS試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，反應(yīng)顏色的強(qiáng)度與酶解產(chǎn)生的還原糖量成正比，其又與反應(yīng)液中的纖維素酶的活力成正比。
[0039]上述纖維素含量按下述方法測(cè)定:
使用硫酸蒽酮比色法測(cè)定。測(cè)定原理是纖維素在酸性條件下加熱水解成葡萄糖，然后在濃硫酸作用下，單糖脫水生成糠醛類(lèi)化合物，利用蒽酮試劑與糠醛類(lèi)化合物的藍(lán)綠色反應(yīng)即可進(jìn)行比色測(cè)定。
[0040]上述纖維素轉(zhuǎn)化率測(cè)定按下述方法測(cè)定:
纖維素轉(zhuǎn)化率(％)=[初始培養(yǎng)基中纖維素含量(g/L)-發(fā)酵后培養(yǎng)基中纖維素含量(g/L)]/初始培養(yǎng)基中纖維素含量(g/L)。
[0041]參考文獻(xiàn):
[I]王肇穎，肖敏.白酒酒糟的綜合利用及其發(fā)展前景[J].釀酒科技，2004，(I): 64-67。
[0042][2]吳忠會(huì)，劉清波，劉正安.白酒丟糟“零排放”的研究[J].食品科學(xué)，2008，29(8): 201-204。
[0043][3]李政一.白酒糟綜合利用研究[J].北京工商大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2003，21(1):9-13。
[0044][4]施安輝.當(dāng)前釀酒工業(yè)固體酒糟生態(tài)型綜合利用的前景，2004，(3):9_11。
[0045][5]魯文普，楊玉能.酒糟的飼料化利用概況，2009，33 (4):9_10。[0046] [6]魏景超.真菌分類(lèi)鑒定手冊(cè)[M]上海出版社， 1974:508-509。
【權(quán)利要求】
1.一種降解白酒酒糟纖維素的擴(kuò)展青霉菌株，其特征在于:命名為擴(kuò)展青霉菌Penicillium expansum N53，該菌株的 18S rDNA 序列如下: tctagtataa gcactttata ctgtgaaact gcgaatggct cattaaatca gttatcgttt60
atttgatagt accttactac atggatacct gtggtaattc tagagctaat acatgctaaa120
aaccccgact tcaggaaggg gtgtatttat tagataaaaa accaacgccc ttcggggctc180
cttggtgaat cataataact taacgaatcg catggccttg cgccggcgat ggttcattca240
aatttctgcc ctatcaactt tcgatggtag gatagtggcc taccatggtg gcaacgggta300
acggggaatt agggttcgat tccggagagg gagcctgaga aacggctacc acatccaagg360
aaggcagcag gcgcgcaaat tacccaatcc cgatacgggg aggtagtgac aataaatact420
gatacggggc tcttttgggt ctcgtaattg gaatgagaac aatttaaatc ccttaacgag480
gaacaattgg agggcaagtc tggtgccagc agccgcggta attccagctc caatagcgta540
tattaaagtt gttgcagtta aaaagctcgt agttgaacct tgggtctggc tggccggtcc600
gcctcaccgc gagtactgtc cggctggacc tttccttctg gggaacctca tggccttcac660
tggctgtggg gggaaccagg acttttactg tgaaaaaatt agagtgttca aagcaggcct720
ttgctcgaat acattagcat ggaataatag aataggacgt gcggttctat tttgttggtt780
tctaggaccg ccgtaatgat taatagggat agtcgggggc gtcagtattc agctgtcaga840
ggtgaaattc ttggatttgc tgaagactaa ctactgcgaa agcattcgcc aaggatgttt900
tcattaatca gggaacgaaa gttaggggat cgaagacgat cagataccgt cgtagtctta960
accataaact atgccgacta gggatcggac gggattctat gatgacccgt tcggcacctt1020
acgagaaatc aaagtttttg ggttctgggg ggagtatggt cgcaaggctg aaacttaaag1080
aaattgacgg aagggcacca caaggcgtgg agcctgcggc ttaatttgac tcaacacggg1140
gaaactcacc aggtccagac aaaataagga ttgacagatt gagagctctt tcttgatctt1200
ttggatggtg gtgcatggcc gttcttagtt ggtggagtga tttgtctgct taattgcgat1260
aacgaacgag acctcggccc ttaaatagcc cggtccgcat ttgcgggccg ctggcttctt1320
agggggacta tcggctcaag ccgatggaag tgcgcggcaa taacaggtct gtgatgccct1380
tagatgttct gggccgcacg cgcgctacac tgacagggcc agcgagtaca tcaccttggc1440
cgagaggtct gggtaatctt gttaaaccct gtcgtgctgg ggatagagca ttgcaattat1500
tgctcttcaa cgaggaatgc ctagtaggca cgagtcatca gctcgtgccg attacgtccc1560
tgccctttgt acacaccgcc cgtcgctact accgattgaa tggctcagtg aggccttcgg1620
actggctcag gagggttggc aacgaccccc cagagccgga aagttggtca aactcggtca1680ttagagaa1688，上述18S rDNA序列全長(zhǎng)1688個(gè)核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的降解白酒酒糟纖維素的擴(kuò)展青霉菌株，其特征在于:在固體培養(yǎng)或分離培養(yǎng)基的平板上進(jìn)行培養(yǎng)，然后觀察菌落圓形鋪展，向四周成輻射狀，中間成絨狀，孢子成暗綠色，有白色的邊緣，最后變?yōu)楹稚鈱W(xué)顯微鏡下觀察菌體分生孢子梗有隔膜且較長(zhǎng)，比較光滑，頂端排列成帚狀的分枝，頂層以切離法生成分生孢子，分生孢子串呈不分枝的鏈狀，單個(gè)孢子成橢圓形，光滑無(wú)色。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的降解白酒酒糟纖維素的擴(kuò)展青霉菌株，其特征在于:采用BLAST分析法，將擴(kuò)展青霉菌N53的18S rDNA全序列與與NCBI注冊(cè)的擴(kuò)展青梅HDJZ-ZWM-17 18S rDNA的基因序列具有高度同源性的基因序列比較，同源性為.98.0%-99.0%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的降解白酒酒糟纖維素的擴(kuò)展青霉菌株，其特征在于:該菌株是應(yīng)用在白酒酒糟纖維素降解中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的降解白酒酒糟纖維素的擴(kuò)展青霉菌株選育方法，其特征在于:包括以下步驟: 使用篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)都得到單菌落，加入剛果紅溶液染色，再經(jīng)過(guò)NaCl溶液脫色篩選得到透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株，再將其接入到液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，選取纖維素酶酶活較高的菌株，經(jīng)過(guò)多次分離純化，獲得擴(kuò)展青霉N53菌株。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的降解白酒酒糟纖維素的擴(kuò)展青霉菌株選育方法，其特征在于:NaCl溶液中NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK103667075SQ201310475001
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月17日
【發(fā)明者】徐慧, 劉建軍, 李文婧, 牛梅麗 申請(qǐng)人:山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院