一株同步處理市政污水和實現(xiàn)油脂積累的斜生柵藻的制作方法
【專利摘要】一株同步處理市政污水和實現(xiàn)油脂積累的斜生柵藻，它涉及一種斜生柵藻。本發(fā)明是要解決微藻生物柴油生產(chǎn)系統(tǒng)與市政污水處理系統(tǒng)耦合過程中遇到的藻種抗逆性較差、藻細(xì)胞脂含量低、去污染能力差、難以降解污水中的碳源物質(zhì)并且在污水中生長需添加外源營養(yǎng)物質(zhì)的問題，本發(fā)明的斜生柵藻（Scenedesmus?obliquus）PF3，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期為2013年7月30日，保藏號為CGMCC?No.8015，本發(fā)明的斜生柵藻具有抗污染能力強,可以在不滅菌的一般城市污水中利用其碳、氮、磷等污染物為營養(yǎng)物質(zhì)生長繁殖并能積累油脂的優(yōu)點。
【專利說明】一株同步處理市政污水和實現(xiàn)油脂積累的斜生柵藻
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種斜生柵藻。
【背景技術(shù)】
[0002]面對日益嚴(yán)峻的化石能源和環(huán)境污染的挑戰(zhàn)，利用微藻生產(chǎn)生物柴油越來越受到重視，這是因為微藻作為生物柴油的生產(chǎn)原料，具有能量轉(zhuǎn)化效率高、油脂含量高且增殖速度快的優(yōu)勢。另外，微藻生物柴油生產(chǎn)過程不增加溫室氣體排放，有利于環(huán)境保護。但是，微藻生物柴油高昂的生產(chǎn)成本限制了其規(guī)?；a(chǎn)和廣泛使用，其中微藻生長需要的碳氮磷源等營養(yǎng)物質(zhì)是微藻生物柴油生產(chǎn)成本的重要組成部分。市政污水中含有豐富的碳氮磷污染物，這些物質(zhì)的大量排放給環(huán)境造成了沉重的負(fù)擔(dān)。因此，若能將微藻生物柴油生產(chǎn)系統(tǒng)與市政污水處理系統(tǒng)耦合，將污水中的碳氮磷等污染物變?yōu)槲⒃迳锊裼蜕a(chǎn)的營養(yǎng)物，既能降低微藻生物柴油的生產(chǎn)成本，又能實現(xiàn)廢水資源化，減少環(huán)境污染。在污水處理和微藻生物柴油生產(chǎn)系統(tǒng)耦合過程中遇到了藻種抗逆性較差、脂含量低、去污染能力差、底物利用能力差的問題。因此，獲得環(huán)境適應(yīng)能力強、可以在污水中穩(wěn)定高速生長、脂含量較高、去污染效果好的藻種資源對于實現(xiàn)污水處理資源化和微藻生物柴油生產(chǎn)商業(yè)化具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明是要解決微藻生物柴油生產(chǎn)系統(tǒng)與市政污水處理系統(tǒng)耦合過程中遇到的藻種抗逆性較差、藻細(xì)胞脂含量低、去污染能力差、難以降解污水中的碳源物質(zhì)并且在污水中生長需添加外源營養(yǎng)物質(zhì)的問題，提供了一株同步處理市政污水和實現(xiàn)油脂積累的斜生柵藻。
[0004]本發(fā)明一株同步處理市政污水和實現(xiàn)油脂積累的斜生柵藻，它為斜生柵藻(Scenedesmus obliquus) PF3,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2013年7月30日，保藏號為CGMCCN0.8015。
[0005]本發(fā)明的斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)PF3由2、4或8個細(xì)胞組成,通常由4個細(xì)胞組成。群體細(xì)胞并列排成一列或略作交互排列；細(xì)胞紡錘形、扁平，上下兩端逐漸尖細(xì)，群體兩側(cè)細(xì)胞游離面凹入或凸出，細(xì)胞壁平滑。兩端鈍圓，細(xì)胞壁薄。細(xì)胞長8-18μπι，寬 3_9 u rrio
[0006]本發(fā)明從中國黑龍江省哈爾濱太陽島西區(qū)外灘濕地公園湖泊中分離篩選出一株同步處理市政污水和實現(xiàn)油脂積累的斜生柵藻，基于細(xì)胞核編碼的核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer, ITS)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示藻種PF-3與柵藻屬(Scenedesmus)親緣關(guān)系密切，與斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)位于同一進化分支上。經(jīng)測序，藻種F3的核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer, ITS)片段大小為685bp。將此序列與NCBI Genebank數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行序列同源性比對，發(fā)現(xiàn)該藻株與柵藻屬(Scenedesmus)親緣關(guān)系最近，與斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)序列同源性可達到100%，根據(jù)顯微觀察和核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)綜合分析，該藻種應(yīng)是隸屬于綠藻門(Chlorophyta)、綠藻綱(Chlorophyceae)、綠球藻目(Chlorococcales)、柵藻科(Scenedesmaceae)、棚藻屬(Scenedesmus)的斜生棚藻(Scenedesmus obliquus)。
[0007]本發(fā)明分離篩選獲得的斜生柵藻(Scenedesmus obliquus) PF3,具有抗污染能力強，可以在不滅菌的一般城市污水中利用其碳、氮、磷等污染物為營養(yǎng)物質(zhì)生長繁殖并能積累油脂的優(yōu)點。市政污水經(jīng)斜生柵藻(Scenedesmus obliquus) PF3處理后，C0D、氮、磷等污染物去除率分別可達60%、71.5%,99%左右，達到《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB8978-2002)。同時，該株柵藻能將污水中的碳源污染物轉(zhuǎn)化成生物油脂，藻細(xì)胞的油脂含量高達37.65%，實現(xiàn)了市政污水的資源化處理。
[0008]本發(fā)明涉及斜生柵藻(Scenedesmus obliquus) PF3,它隸屬于綠藻門(Chlorophyta)、綠藻綱(Chlorophyceae)、綠球藻目(Chlorococcales)、棚藻科(Scenedesmaceae)、棚藻屬(Scenedesmus)的斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)。保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2013年7月30日，保藏號為 CGMCC N0.8015。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1為本發(fā)明的斜生柵藻PF3細(xì)胞形態(tài)放大400倍的顯微照片；
[0010]圖2為本發(fā)明的斜生柵藻PF3細(xì)胞形態(tài)放大400倍的顯微照片；
[0011]圖3為基于本發(fā)明的斜 生柵藻PF3細(xì)胞核編碼的核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)構(gòu)建的最大簡約樹。
【具體實施方式】
[0012]【具體實施方式】一:本實施方式一株同步處理市政污水和實現(xiàn)油脂積累的斜生柵藻，它為斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)PF3,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2013年7月30日，保藏號為CGMCC N0.8015。
[0013]本實施方式一株同步處理市政污水和實現(xiàn)油脂積累的斜生柵藻，它為斜生柵藻(Scenedesmus obliquus) PF3,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2013年7月30日，保藏號為CGMCCN0.8015。
[0014]本實施方式的斜生柵藻(Scenedesmus obliquus) PF3由2、4或8個細(xì)胞組成,通常由4個細(xì)胞組成。群體細(xì)胞并列排成一列或略作交互排列；細(xì)胞紡錘形、扁平，上下兩端逐漸尖細(xì)，群體兩側(cè)細(xì)胞游離面凹入或凸出，細(xì)胞壁平滑。兩端鈍圓，細(xì)胞壁薄。細(xì)胞長8-18 μ m，寬3-9 μ m (如圖1和圖2所示)。
[0015]本實施方式從中國黑龍江省哈爾濱太陽島西區(qū)外灘濕地公園湖泊中分離篩選出一株同步處理市政污水和實現(xiàn)油脂積累的斜生柵藻，基于細(xì)胞核編碼的核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer, ITS)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示，由圖3可知藻種F3與柵藻屬(Scenedesmus )親緣關(guān)系密切，與斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)位于同一進化分支上。經(jīng)測序，藻種F3的核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(InternalTranscribed Spacer, ITS)片段大小為685bp。將此序列與NCBI Genebank數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行序列同源性比對，發(fā)現(xiàn)該藻株與柵藻屬(Scenedesmus)親緣關(guān)系最近，與斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)序列同源性可達到100%,根據(jù)顯微觀察和核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)綜合分析，該藻種應(yīng)是隸屬于綠藻門(Chlorophyta)、綠藻綱(Chlorophyceae)、綠球藻目(Chlorococcales)、棚藻科(Scenedesmaceae)、棚藻屬(Scenedesmus)的斜生棚藻(Scenedesmus obliquus)。
[0016]本實施方式分離篩選獲得的斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)PF_3,具有抗污染能力強，可以在不滅菌的一般城市污水中利用其碳、氮、磷等污染物為營養(yǎng)物質(zhì)生長繁殖并能積累油脂的優(yōu)點。市政污水經(jīng)斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)PF3處理后,COD、氮、磷等污染物去除率分別可達60%、71.5%、99%左右，達到《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB8978-2002)。同時，該株柵藻能將污水中的碳源污染物轉(zhuǎn)化成生物油脂，藻細(xì)胞的油脂含量高達37.65%，實現(xiàn)了市政污水的資源化處理。
[0017]本實施方式涉及斜生柵藻(Scenedesmus obliquus) PF3,它隸屬于綠藻門(Chlorophyta)、綠藻綱(Chlorophyceae)、綠球藻目(Chlorococcales)、柵藻科(Scenedesmaceae)、棚藻屬(Scenedesmus)的斜生棚藻(Scenedesmus obliquus)。保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2013年7月30日，保藏號為CGMCC N0.8015。
[0018]【具體實施方式】二:本實施方式的斜生柵藻(Scenedesmus obliquus) PF3從黑龍江哈爾濱太陽島西區(qū)外灘濕地公園湖泊中篩選得到。篩選按以下步驟進行:
[0019](I)用無菌燒杯小心采集水中的浮游微藻，采集的水樣用裝有無菌培養(yǎng)基的透明玻璃瓶保存，玻璃瓶放入裝有 冰塊的保溫瓶中，然后帶入實驗室24小時內(nèi)進行分離純化。
[0020](2)取適量藻源加入盛有滅菌BGll培養(yǎng)基的三角瓶中，同時加入少量玻璃珠，置于搖床上震蕩24h左右，取出后靜止30min左右，吸取中層液體50mL，加入盛有150mL左右無菌BGll培養(yǎng)基的三角瓶中，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每4h搖晃一次,一次搖2min。
[0021](3)取ImL的富集藻液，用無菌水依次稀釋ΙΟ4、105、IO6倍，而后吸取0.5ml，滴入無菌的含有固體BGll培養(yǎng)基的平板中進行涂布,置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待長出明顯的可見的藻落后，用接種環(huán)挑取單藻落，接入無菌平板進行三區(qū)劃線，置于光照恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長出明顯可見的藻落，接入無菌定向富集培養(yǎng)的三角瓶中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。重復(fù)上述三區(qū)劃線一液體培養(yǎng)基一三區(qū)劃線步驟3—6次，直到平板上的藻落和顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)一致認(rèn)為是純藻種，進一步用ITS片段確認(rèn)后，便可獲得單一的純藻種。對獲得的藻種，將其在污水中培養(yǎng)，測定其油脂產(chǎn)率、藻密度和污染物去除情況，反復(fù)測定直到穩(wěn)定，選擇油脂產(chǎn)率最好的藻種作為目的藻種。
[0022]對篩選得到的斜生柵藻(Scenedesmus obliquus) PF3進行分子鑒定,按以下步驟進行:
[0023]一、采用 CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide)方法提取藻類基因組,并參考《Molecular systematics》，具體方法如下:
[0024]取IOml藻液,8000rpm離心IOmin,加入100 μ L TE,振蕩懸浮細(xì)胞,再加入800 μ L
裂解液和0.8 μ L β -巰基乙醇，迅速充分振蕩混勻，置于65°C溫浴30min，其間來回顛倒數(shù)次，，再加入700 μ L氯仿,充分混勻，12000rpm離心5min,離心后將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入700ul結(jié)合緩沖液，充分混合均勻，再加入到離心吸附柱中去，放置lmin，12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，再加入700 μL洗滌緩沖液，12000rpm離心lmin，重復(fù)洗滌3次，最后一次12000rpm離心2min，充分除去洗滌緩沖液，取出離心吸附柱，將其套入一個干凈的1.5mL離心管,并加入50 μ L洗脫緩沖液,放置Imin后，于12000rpm離心lmin,取出離心吸附柱，取10 μ L電泳。
[0025]二、序列擴增和測定
[0026]用于PCR擴增的弓丨物序列:
[0027]ITSF:5/ -CAAGGTTTCCTAGTTTCT-3;
[0028]ITSR:5/ -GGCATCCTGGTGTAGGTGA-3'
[0029]50 μ L ITS 序列 PCR 反應(yīng)體系包括:10 X PCR buffer, 0.2mM dNTP, 2.5mM Mg2 +，IU Taq酶，模板DNA，正反向引物，ddH20。反應(yīng)程序為:95°C變性5min，然后按95°C 30s，55°C 30s, 72°C lmin程序34個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖膠中電泳。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后直接由華大基因公司進行測序。經(jīng)測序，待鑒定的樣品核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer, ITS)片段大小為685bp (如序列表SeqID No:3所示)。將此序列與NCBI Genebank數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行序列同源性比對，發(fā)現(xiàn)該藻株與柵藻屬(Scenedesmus)親緣關(guān)系最近,與斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)序列同源性可達到100%。
[0030]三、發(fā)育樹構(gòu)建
[0031]利用Blast功能，將所得到的樣品ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進行比較。下載GenBank上相似藻類的序列，利用Clustal X對基因序列進行比對，輔以SEAVIEW手工校正，采用MEGA5構(gòu)建形態(tài)發(fā)育樹，分析樣品的系統(tǒng)發(fā)育位置。
[0032]對本實施方式的斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)PF3進行處理市政污水和油脂積累的功能性驗證:
[0033]將斜生柵藻(Scenedesmusobliquus) PF3 接種到 pH 為 8.0、COD 含量為 310mg/L、TN含量33mg/L、TP含量3.6mg/L的未經(jīng)滅菌的市政污水中，初始接種量為5*105個/ml,在人工光源照射下使藻種利用污水中的養(yǎng)分生長,培養(yǎng)條件為:光暗比18h:6h,光強18001ux，攪拌速率150r/min，曝氣速率200ml/min，溫度25 °C。培養(yǎng)7天后，采用離心的方法收集微藻，排出處理后水。處理后污水的COD、TN、TP的去除率分別為56.25%,71.5%、99.2%，達到《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB8978-2002) 二級排放標(biāo)準(zhǔn)。收集的微藻油脂含量為37.6%。
【權(quán)利要求】
1.一株同步處理市政污水和實現(xiàn)油脂積累的斜生柵藻，其特征在于它為斜生柵藻(Scenedesmus obliquus) PF3,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2013年7月30日，保藏號為CGMCCN0.8015。
【文檔編號】C12N1/12GK103484374SQ201310475694
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年10月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月14日
【發(fā)明者】于艷玲, 馮玉杰, 張大偉, 儀超 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)