一組用于鑒定硬腳和軟腳鐵皮石斛的微衛(wèi)星分子標(biāo)記的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一組用于鑒定硬腳和軟腳鐵皮石斛的微衛(wèi)星分子標(biāo)記。該微衛(wèi)星分子標(biāo)記包括HZs01、HZs02、HZs03、HZs04、HZs05、HZs06、HZs07。其中HZs01、HZs02、HZs03、HZs04為硬腳鐵皮石斛特有序列，HZs05、HZs06、HZs07為軟腳鐵皮石斛特有序列。本發(fā)明獲得的硬腳鐵皮石斛和軟腳鐵皮石斛特有的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，可以用于硬腳和軟腳鐵皮石斛的區(qū)分，用于商業(yè)打假和鐵皮楓斗的藥材鑒定。本發(fā)明可利用這些微衛(wèi)星分子標(biāo)記區(qū)別硬腳鐵皮石斛和軟腳鐵皮石斛，重復(fù)性好，是一種可靠有效的DNA分子標(biāo)記。
【專利說明】一組用于鑒定硬腳和軟腳鐵皮石斛的微衛(wèi)星分子標(biāo)記
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因組DNA分子標(biāo)記【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一組可用于鑒定硬腳和軟腳鐵皮石斛的微衛(wèi)星分子標(biāo)記。
【背景技術(shù)】
[0002]鐵皮石斛作為藥用石斛最主要的代表種，是我國最珍貴的傳統(tǒng)名貴中藥材之一，被尊列為“中華九大仙草”之首，素有“藥中黃金”之美稱。早在東漢末年的《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載，《本草綱目》和《中藥大詞典》等我國古代多部醫(yī)學(xué)著作中都記載了鐵皮石斛具有增強(qiáng)免疫力、消除腫瘤、抑制癌癥等作用，對(duì)咽喉疾病、腸胃疾病、白內(nèi)障、心血管疾病、糖尿病、腫瘤均具有顯著療效，特別是對(duì)人體肺癌細(xì)胞具有高達(dá)74.7~97.2 %的抑制率。
[0003]鐵皮石斛通常分為軟腳和硬腳兩大類:軟腳鐵皮石斛莖大多粗短且柔軟，石斛多糖和石斛堿含量高，味甘，咀嚼后幾乎沒有殘?jiān)?。?jīng)過邊炒邊扭的工藝加工炮制成螺旋形的石斛干品就是上等的“鐵皮楓斗”。一般來說，至少10公斤生鮮的軟腳鐵皮石斛才能加工成I公斤鐵皮楓斗。而正宗的野生鐵皮石斛通常在每公斤1000元左右，這導(dǎo)致鐵皮楓斗的價(jià)格堪比黃金。硬腳鐵皮石斛莖較長(zhǎng)且質(zhì)硬，黏性小(石斛多糖含量低)，不能被烘軟，只能煮水服用。
[0004]另一方面，野生鐵皮石斛生境獨(dú)特，繁殖困難，加上過度采收，歷史文獻(xiàn)報(bào)道的浙江、云南、貴州、廣西、湖南、安徽、江西等鐵皮石斛主要分布區(qū)，目前的實(shí)地調(diào)查中已經(jīng)很難找到大面積的野生鐵皮石斛分布。2011年鐵皮石斛成為第二批“國家重點(diǎn)一級(jí)保護(hù)的珍稀瀕危植物”，根本不可能用于生產(chǎn)，所以近10年來，鐵皮石斛人工栽培、規(guī)?；N植技術(shù)的研究成為熱點(diǎn)之一。目前，鐵皮石斛的人工栽培技術(shù)逐漸成熟，產(chǎn)業(yè)化規(guī)模不斷擴(kuò)大。形成了集科研、種植、加工、銷售為一體的鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)群。然而，生鮮的軟腳和硬腳鐵皮石斛因?yàn)樾螤睢⑸珴煞矫娴牟顒e，消費(fèi)者容易分辨。不過，經(jīng)過烘焙、卷曲等工序而成的鐵皮楓斗，其原料究竟是軟腳還是硬腳，單憑肉眼觀察，就算是行家已很難分辨，更不要說普通消費(fèi)者了。而且硬腳鐵皮石斛由于纖維含量高，不易折斷，更容易做出楓斗，所以市場(chǎng)上往往被用來以次充好，冒充或摻入軟腳鐵皮楓斗中。加上現(xiàn)有的植物分類學(xué)或化學(xué)手段，很難鑒定到物種水平，所以多年來一直沒有對(duì)軟腳和硬腳鐵皮石斛的高效、科學(xué)、通用的鑒定方法。
[0005]分子標(biāo)記鑒定是當(dāng)今流行的比傳統(tǒng)鑒定方法更科學(xué)和靈敏的重要方法之一。其中的微衛(wèi)星標(biāo)記(SSR, Simple Sequence Repeat)作為以DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR, Polymerase Chain Reaction)技術(shù)和測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記,被認(rèn)為是當(dāng)前種內(nèi)遺傳變異研究中分辨率最高、揭示力最強(qiáng)的分子標(biāo)記之一。迄今，國內(nèi)外尚無通過鐵皮石斛微衛(wèi)星分子標(biāo)記開發(fā)來進(jìn)行硬腳和軟腳鐵皮石斛品種鑒定的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一組鐵皮石斛的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，其能用于準(zhǔn)確區(qū)分硬腳和軟腳鐵皮石斛，為市場(chǎng)打假和藥材鑒定所用。[0007]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一組共7個(gè)鐵皮石斛微衛(wèi)星分子標(biāo)記，他們的引物對(duì)序列分別為:[0008]HZsOl 引物對(duì):上游 5’ -CGAAGGTGGCGAAACAAGAC-3’ ；
[0009]下游5’ -GAAAACTACAAATTACCAAAGAC-3’ ；
[0010]HZs02 引物對(duì):上游 5’ -AAGTGGATAACGGGGATAAG-3’ ；
[0011]下游5，-TTTTGGCAATGAACCTAATG-3，；
[0012]HZs03 引物對(duì):上游 5’ -GCAAAAGCTAGGGTAGAGTTC-3 ’ ；
[0013]下游5，-CTCCTTCCCAATGAGCTT-3，；
[0014]HZs04 引物對(duì):上游 5’ -GAGAGAAGGGGAGCAATG-3 ’ ；
[0015]下游5，-CTAAGTTCGCACTCATCTCTG-3，；
[0016]HZs05 引物對(duì):上游 5’ -GGAGGAAGTAGGGAGTCAAC-3 ’ ；
[0017]下游5 ’ -TAAACCTTATAGAAGCCAAA-3，；
[0018]HZs06 引物對(duì):上游 5’ -TGGGCTAACCATTGATTTAC-3 ’ ；
[0019]下游5，-CAGACTTTATTGTTTGCCTAATT-3，；
[0020]HZs07 引物對(duì):上游 5’ -CAAATTCTCCGATCTCCGTT-3 ’ ；
[0021 ]下游 5 ’ -AAGTCCCCAAACCTTATCAA-3，。
[0022]作為本發(fā)明的鐵皮石斛微衛(wèi)星分子標(biāo)記的另一個(gè)核心內(nèi)容，他們的引物對(duì)的PCR退火溫度分別為:HZsOl:58°C ；HZs02:55°C ；HZs03:55°C ；HZs04:55°C ；HZs05:50°C ；HZs06:53 °C ；HZs07:56°C。
[0023]本發(fā)明的另一個(gè)目的是上述鐵皮石斛微衛(wèi)星分子標(biāo)記可用于對(duì)硬腳和軟腳鐵皮石斛進(jìn)行鑒定，HZsO 1、HZs02、HZs03、HZs04為硬腳鐵皮石斛特有序列，HZs05、HZs06、HZs07為軟腳鐵皮石斛特有序列。
[0024]本發(fā)明是在生物信息學(xué)方法基礎(chǔ)上，利用金釵石斛EST序列，篩選微衛(wèi)星分子標(biāo)記，并進(jìn)一步用于尋找鐵皮石斛微衛(wèi)星分子標(biāo)記，選出在不同時(shí)間、地點(diǎn)和操作人員條件下，都可獲得的4個(gè)穩(wěn)定有效的硬腳鐵皮石斛特有微衛(wèi)星分子標(biāo)記和3個(gè)穩(wěn)定有效的軟腳鐵皮石斛特有微衛(wèi)星分子標(biāo)記。
[0025]本發(fā)明是通過這樣的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:
[0026]步驟(1).金釵石斛EST序列的獲得:構(gòu)建金釵石斛花的EST文庫，完成測(cè)序和拼接工作，得到金釵石斛EST序列；
[0027]步驟(2).含有微衛(wèi)星EST序列的篩選:用計(jì)算機(jī)微衛(wèi)星分析程序和在線微衛(wèi)星位點(diǎn)分析軟件，對(duì)所測(cè)序的金釵石斛EST序列進(jìn)行篩選，獲得含有微衛(wèi)星位點(diǎn)的金釵石斛EST序列；
[0028]步驟(3).引物設(shè)計(jì):在含有微衛(wèi)星位點(diǎn)的金釵石斛EST序列上，用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增含有微衛(wèi)星位點(diǎn)的DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物，該引物含有的堿基數(shù)控制在18~22個(gè)，兩引物退火溫度差<4°C，擴(kuò)增的DNA片段在350個(gè)堿基以內(nèi)；
[0029]步驟(4).微衛(wèi)星驗(yàn)證:利用上述步驟(3)設(shè)計(jì)的引物對(duì)鐵皮石斛基因組DNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分離、銀染檢測(cè)、微衛(wèi)星位點(diǎn)的再擴(kuò)增、亞克隆和測(cè)序確認(rèn)工作。
[0030]通過上述四步驟，最終篩選出的4個(gè)硬腳鐵皮石斛特有微衛(wèi)星標(biāo)記引物的核苷酸序列(5’ -3’)如下:
[0031]HZsOl 引物對(duì):上游 5’ -CGAAGGTGGCGAAACAAGAC-3’ ；
[0032]下游5'-GAAAACTACAAATTACCAAAGAC-3'；
[0033]HZs02 引物對(duì):上游 5’ -AAGTGGATAACGGGGATAAG-3 ’ ；
[0034]下游5'-TTTTGGCAATGAACCTAATG-3'；
[0035]HZs03 引物對(duì):上游 5’ -GCAAAAGCTAGGGTAGAGTTC-3 ’ ；
[0036]下游5'-CTCCTTCCCAATGAGCTT-3'；
[0037]HZs04 引物對(duì):上游 5’ -GAGAGAAGGGGAGCAATG-3 ’ ；
[0038]下游5'-CTAAGTTCGCACTCATCTCTG-3'；
[0039]3個(gè)軟腳鐵皮石斛特有微衛(wèi)星標(biāo)記引物的核苷酸序列(5’ -3’ )如下:
[0040]HZs05 引物對(duì):上游 5'-GGAGGAAGTAGGGAGTCAAC-3'；
[0041]下游5'-TAAACCTTATAGAAGCCAAA-3'；
[0042]HZs06 引物對(duì):上游 5’ -TGGGCTAACCATTGATTTAC-3 ’ ；
[0043]下游5'-CAGACTTTATTGTTTGCCTAATT-3’ ；
[0044]HZs07 引物對(duì):上游 5’ -CAAATTCTCCGATCTCCGTT-3 ’ ；
[0045]下游5'-AAGTCCCCAAACCTTATCAA-3'。
[0046]硬腳鐵皮石斛和軟腳鐵皮石斛特有的微衛(wèi)星分子標(biāo)記在區(qū)分硬腳和軟腳鐵皮石斛上的應(yīng)用。
[0047]本發(fā)明獲得的硬腳鐵皮石斛和軟腳鐵皮石斛特有的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，可以用于硬腳和軟腳鐵皮石斛的區(qū)分，用于商業(yè)打假和鐵皮楓斗的藥材鑒定。本發(fā)明可利用這些微衛(wèi)星分子標(biāo)記區(qū)別硬腳鐵皮石斛和軟腳鐵皮石斛，重復(fù)性好，是一種可靠有效的DNA分子標(biāo)記。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0048]圖1是4個(gè)硬腳鐵皮石斛特有微衛(wèi)星標(biāo)記和3個(gè)軟腳鐵皮石斛特有微衛(wèi)星標(biāo)記的電泳圖；
[0049]圖2為實(shí)施例2的分析結(jié)果電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0050]以下是對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳述。
[0051]下面實(shí)施例并非是對(duì)于本發(fā)明的限制，本發(fā)明并非僅限于下面實(shí)施例，只要符合本發(fā)明要求，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0052]實(shí)施例1.[0053]1.金釵石斛EST序列的獲得
[0054]本實(shí)驗(yàn)室通過自己構(gòu)建金釵石斛花的EST文庫，完成測(cè)序和拼接工作，獲得大量的金釵石斛EST序列。
[0055]2.金釵石斛EST序列的篩選
[0056]利用計(jì)算機(jī)微衛(wèi)星位點(diǎn)分析程序(MISA)和在線微衛(wèi)星位點(diǎn)分析軟件(Microsatellite Repeats Finder),對(duì)金釵石斛EST序列進(jìn)行篩選,得到含有微衛(wèi)星位點(diǎn)的金釵石斛EST序列。
[0057]3.引物設(shè)計(jì)
[0058]在含有微衛(wèi)星位點(diǎn)的金釵石斛EST序列上，利用在線引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier3 (http: //frod0.w1.mit.edu/primer3/)設(shè)計(jì) DNA 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增引物，設(shè)計(jì)引物的大小在20個(gè)堿基左右，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在100~300堿基，兩條引物的退火溫度相差不超過4°C。當(dāng)一條DNA序列中若含有兩個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，且兩個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)相距100個(gè)堿基以上時(shí)，對(duì)兩個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)引物；當(dāng)兩個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在同一條序列中相距100個(gè)堿基以內(nèi)時(shí)，引物設(shè)計(jì)時(shí)就盡量使兩個(gè)位點(diǎn)在一對(duì)引物的擴(kuò)增范圍內(nèi)；放棄微衛(wèi)星位點(diǎn)在序列兩端的EST序列。
[0059]4.微衛(wèi)星位點(diǎn)測(cè)序驗(yàn)證:
[0060]①DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增
[0061]通過PCR方法用設(shè)計(jì)好的微衛(wèi)星標(biāo)記引物分別擴(kuò)增硬腳和軟腳鐵皮石斛基因組DNA，擴(kuò)增反應(yīng)體系和條件如下:反應(yīng)體系為20 μ 1，包括:10Χ緩沖液2μ l，MgCl2(25mmol/L) 1.2 μ 1，脫氧核糖核苷酸(10mmol/L)0.6y 1，DNA 聚合酶(5 單位/μ I) 0.25 μ 1，DNA 模板50~lOOng，引物(25mmol/L)0.5μ 1，用dd H2O定容至20 μ I。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)行32個(gè)循環(huán)(94°C變性40秒，各微衛(wèi)星引物退火溫度下復(fù)性40秒，72°C延伸90秒)，最后72°C終延伸10分鐘后于4°C保存。從而獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0062]各微衛(wèi)星引物的PCR 退火溫度分別為:HZs01:58°C ；HZs02:55°C ；HZs03:55°C ；HZs04:55°C ；HZs05:50°C ；HZs06:53°C ；HZs07:56°C。
[0063]②電泳分離和銀染檢測(cè)
`[0064]擴(kuò)增產(chǎn)物中加入變性緩沖液(該變性緩沖液為98 %甲酰胺，IOmmoI/L pH8.0的EDTA，0.25 %溴酚藍(lán)，0.2 % 二甲苯氰的混合液)，用質(zhì)量含量為4 %的變性聚丙烯酰胺膠(厚度0.4毫米)和IXTBE電泳緩沖液，在美國Bio-Rad公司生產(chǎn)的Sequ1-Gen GT測(cè)序電泳槽中進(jìn)行電泳，預(yù)電泳30分鐘后上樣100瓦恒功率電泳約2小時(shí)后銀染檢測(cè)，銀染方法過程主要如下:電泳完畢后，將粘有凝膠的玻璃板置入用于銀染的塑料盤中；加入質(zhì)量含量為10 %的醋酸，在搖床上輕微震蕩30分鐘進(jìn)行固定，然后加入去離子水漂洗3次，每次5分鐘；將酸處理后的凝膠置入質(zhì)量含量為0.1 %的硝酸銀染色液的染色盤中，在搖床上輕微震蕩30分鐘，然后用去離子水漂洗10秒鐘；將染色后的凝膠置入質(zhì)量含量為0.32 %的碳酸鈉的顯色盤中，在搖床上輕微震蕩直至條帶清晰以及條帶數(shù)不再增加為止；在顯色處理的凝膠上加入固定液(固定液是10 %的醋酸)，終止顯色反應(yīng)，用蒸餾水漂洗幾分鐘；去除凝膠和玻璃板上的水珠，放在乳白光燈箱上觀察并用數(shù)碼相機(jī)拍照。
[0065]③微衛(wèi)星位點(diǎn)的再擴(kuò)增和亞克隆
[0066]根據(jù)鐵皮石斛DNA序列微衛(wèi)星位點(diǎn)的特有電泳條帶特征初步判定電泳圖片，并通過割膠測(cè)序進(jìn)一步確認(rèn)。具體的步驟是:割下聚丙烯酰胺凝膠中的銀染信號(hào)最強(qiáng)的微衛(wèi)星位點(diǎn)上的條帶置于管中，加入10 μ I TE溶液(所述的TE溶液為lOmmol/LTris-HCl、lmmol/L EDTA的混合液，pH值為8.0)后，在PCR儀上94°C加熱30分鐘，然后離心取上清液作為二次PCR模板，在與上述①步相同的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，用各微衛(wèi)星位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的微衛(wèi)星引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用I %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，對(duì)目的條帶用膠回收試劑盒(QIAquick Gel Extraction Kit, QIAGEN)進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物用 pMD18_T載體(TAKARA)進(jìn)行16°C過夜連接，轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)胞(TAKARA)后進(jìn)行亞克隆，最后挑取陽性克隆培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取用試劑盒(QIAGEN Plasmid Mini Kit, QIAGEN)提取質(zhì)粒后進(jìn)行測(cè)序。
[0067]④測(cè)序確認(rèn)
[0068]將上述所得的質(zhì)粒，通過生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序，分析序列中的SSR位點(diǎn)，確認(rèn)為鐵皮石斛的微衛(wèi)星分子標(biāo)記。
[0069]二.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0070]通過上述實(shí)驗(yàn)方法，共獲得4個(gè)硬腳鐵皮石斛特有微衛(wèi)星標(biāo)記和3個(gè)軟腳鐵皮石斛特有微衛(wèi)星標(biāo)記。而且在不同時(shí)間、地點(diǎn)和操作人員的條件下，上述4個(gè)硬腳鐵皮石斛和.3個(gè)軟腳鐵皮石斛特有微衛(wèi)星標(biāo)記都能分別在硬腳和軟腳鐵皮石斛中的到特異性擴(kuò)增條帶。如圖1所示，硬腳鐵皮石斛特有的微衛(wèi)星標(biāo)記HZsOl，HZs02, HZs03和HZs04只在硬腳鐵皮石斛中可以得到特異性擴(kuò)增條帶，而在軟腳鐵皮石斛中沒有擴(kuò)增條帶；同樣，硬腳鐵皮石斛特有的微衛(wèi)星標(biāo)記HZs05，HZs06和HZs07只在軟腳鐵皮石斛中可以得到特異性擴(kuò)增條帶，而在硬腳鐵皮石斛中沒有擴(kuò)增條帶。
[0071]4個(gè)硬腳鐵皮石斛特有微衛(wèi)星標(biāo)記引物的核苷酸序列(5’ -3’ )如下:
[0072]HZsOl 引物對(duì):上游 5’ -CGAAGGTGGCGAAACAAGAC-3 ’ ；
[0073]下游5，-GAAAACTACAAATTACCAAAGAC-3，；
[0074]HZs02 引物對(duì):上游 5’ -AAGTGGATAACGGGGATAAG-3 ’ ；
[0075]下游5，-TTTTGGCAATGAACCTAATG-3，；
[0076]HZs03 引物對(duì):上游 5’ -GCAAAAGCTAGGGTAGAGTTC-3 ’ ；
[0077]下游5，-CTCCTTCCCAATGAGCTT-3，；
[0078]HZs04 引物對(duì):上游 5’ -GAGAGAAGGGGAGCAATG-3 ’ ；
[0079]下游5，-CTAAGTTCGCACTCATCTCTG-3，；
[0080]3個(gè)軟腳鐵皮石斛特有微衛(wèi)星標(biāo)記引物的核苷酸序列(5’ -3’ )如下:
[0081]HZs05 引物對(duì):上游 5’ -GGAGGAAGTAGGGAGTCAAC-3 ’ ；
[0082]下游5，-TAAACCTTATAGAAGCCAAA-3，；
[0083]HZs06 引物對(duì):上游 5’ -TGGGCTAACCATTGATTTAC-3 ’ ；
[0084]下游5，-CAGACTTTATTGTTTGCCTAATT-3，；
[0085]HZs07 引物對(duì):上游 5’ -CAAATTCTCCGATCTCCGTT-3 ’ ；
[0086]下游5，-AAGTCCCCAAACCTTATCAA-3，。
[0087]實(shí)施例2.[0088]為了進(jìn)一步表明本發(fā)明開發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記在區(qū)別硬腳鐵皮石斛和軟腳鐵皮石斛上的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，我們?cè)谡憬?nèi)分別選取了 3種硬腳鐵皮石斛和軟腳鐵皮石斛，材料清單如下:類別材料編號(hào)節(jié)環(huán)節(jié)間距植株高度莖稈質(zhì)地提供單位
"w ? ^ i i Wk浙大農(nóng)學(xué)院農(nóng)藝研究中心
[00891 2 窄短矮較軟杭州師范大學(xué)
3 窄短矮較軟森禾公司.....@?...............................1.....................................?............................1.......................................S......................................涵—樂蘇涵涵平忑.....2 寬長(zhǎng)高較硬杭州師范大學(xué)
[0090]利用本發(fā)明開發(fā)的4個(gè)硬腳鐵皮石斛特有微衛(wèi)星標(biāo)記HZsOl，HZs02, HZs03和HZs04, 3個(gè)軟腳鐵皮石斛特有微衛(wèi)星標(biāo)記HZs05，HZs06和HZs07，分別對(duì)供試材料進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖2所示:4個(gè)硬腳鐵皮石斛特有微衛(wèi)星標(biāo)記HZsOl，HZs02,HZs03和HZs04，均在硬腳石斛材料中得到特異性擴(kuò)增條帶；3個(gè)軟腳鐵皮石斛特有微衛(wèi)星標(biāo)記HZs05，HZs06和HZs07,同樣在軟腳石斛材料中都得到特異性擴(kuò)增條帶。表明本發(fā)明開發(fā)的硬腳和軟腳鐵皮石斛微衛(wèi)星標(biāo)記在區(qū)別硬腳鐵皮石斛和軟腳鐵皮石斛上的準(zhǔn)確性高，且重復(fù)性好。
[0091]【序列表】
[0092]本發(fā)明得到的硬腳鐵皮石斛和軟腳鐵皮石斛的SSR序列(去掉載體):
[0093]HZsOl:
[0094]CGAAGGTGGCGAAACAAGACAAGAAGAAGAAGCCTAGGGGGAGGGCCTACAAGCGGATGCAGT
[0095]ACAACCGCCGCTTCGTCACCGCCGTCGTTGGATTCGGGAAGAAGAGGGGACCCAACTCGTCCG·[0096]AGAAGTAAAGATCTGGATTGCAAAGTTCGTAGGAGTGGAATTCTGATTTTTGTATGTCTTTGG
[0097]TAATTTGTAGTTTTC
[0098]HZs02:
[0099]AAGTGGATAACGGGGATAAGCTTACTTTGGGCTCAGATGTCAATATATTGTGTCTTCACACTC
[0100]CCTGCCATACAAAAGGTCATATAAGTTATTATGTCACGAGTAAAGAAGAAGAAGATCCTTCTG
[0101]TTTTTACTGGAGACACATTGTTTATTGCTGGTTGTGGAAAGTTCTTTGAAGGAACTGCTGAAG
[0102]ATATGTACCAATCATTATCTGTGACATTAGGTTCATTGCCAAAA
[0103]HZs03:
[0104]GCAAAAGCTAGGGTAGAGTTCGGCTGGACTAGAAGGCGGAAGAGGATGGGATTGAGGTAAGGA
[0105]GCTCTCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTT
[0106]TATCTCAGAGATCTGGATGTCGGGGAAAGGGGAAGCTCATTGGGAAGGAG
[0107]HZs04:
[0108]GAGAGAAGGGGAGCAATGGCGGAGAAGGAGAAGGAGAAGGCTGGTGGCGAGAGGTGGAAGGCA
[0109]GCTATTGTGAATCTGTCAGAGATGAGTGCGAACTTAG
[0110]HZs05:
[0111]GGAGGAAGTAGGGAGTCAACTTCGACTTAATGACAATGAAAATCCATTTGTGACTTCAAAACA
[0112]ACTGATGTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCACTTCTCCATCACCCCCCCCCCCCAAAAAAAAGCA
[0113]TGTAAAATGTATTATCTCCTTTTTTTGGCTTCTATAAGGTTTA
[0114]HZs06:
[0115]TGGGCTAACCATTGATTTACCGATCGTCGGGAATTTTACGATTCCTTTGTCCACCAAAGGGGA
[0116]GTTGAAGCTTCCTTCCTTCACTGATTTCTTCTCGAGGGAGAAGAGCCCAGAATCCTAATTTTC
[0117]ATTACTGTTTCTTTATCTGTGTGTGTGTGGAATAGGAGTTGCACATGTAATTAGGCAAACAAT
【權(quán)利要求】
1.一組用于鑒定硬腳和軟腳鐵皮石斛的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，其特征在于該微衛(wèi)星分子標(biāo)記包括HZsO 1、HZs02、HZs03、HZs04、HZs05、HZs06、HZs07，這些微衛(wèi)星標(biāo)記引物的核苷酸序列(5’ -3’)如下: HZsOl引物對(duì): 上游 5’ -CGAAGGTGGCGAAACAAGAC-3’，如 SEQ ID N0.1 所示；
下游 5’ -GAAAACTACAAATTACCAAAGAC-3’，如 SEQ ID N0.2 所示； HZs02引物對(duì): 上游 5’ -AAGTGGATAACGGGGATAAG _3’，如 SEQ ID N0.3 所示；
下游 5’ -TTTTGGCAATGAACCTAATG-3’，如 SEQ ID N0.4 所示； HZs03引物對(duì): 上游 5’ -GCAAAAGCTAGGGTAGAGTTC-3’，如 SEQ ID N0.5 所示；
下游 5’ -CTCCTTCCCAATGAGCTT-3，，如 SEQ ID N0.6 所示； HZs04引物對(duì): 上游 5’ -GAGAGAAGGGGAGCAATG-3’，如 SEQ ID N0.7 所示；
下游 5’ -CTAAGTTCGCACTCATCTCTG-3’，如 SEQ ID N0.8 所示； HZs05引物對(duì): 上游 5’ -GGAGGAAGTAGGGAGTCAAC-3’，如 SEQ ID N0.9 所示；
下游 5’ -TAAACCTTATAGAAGCCAAA-3’，如 SEQ ID N0.10 所示； HZs06引物對(duì): 上游 5，-TGGGCTAACCATTGATTTAC-3’，如 SEQ ID N0.11 所示；
下游 5，-CAGACTTTATTGTTTGCCTAATT-3’，如 SEQ ID N0.12 所示； HZs07引物對(duì): 上游 5，-CAAATTCTCCGATCTCCGTT-3’，如 SEQ ID N0.13 所示； 下游 5’ -AAGTCCCCAAACCTTATCAA-3’，如 SEQ ID N0.14 所示。
2.如權(quán)利要求1所述的一組用于鑒定硬腳和軟腳鐵皮石斛的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，其特征在于HZsOl、HZs02、HZs03、HZs04為硬腳鐵皮石斛特有序列。
3.如權(quán)利要求1所述的一組用于鑒定硬腳和軟腳鐵皮石斛的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，其特征在于HZs05、HZs06、HZs07為軟腳鐵皮石斛特有序列。
4.如權(quán)利要求1所述的一組用于鑒定硬腳和軟腳鐵皮石斛的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，其特征在于硬腳和軟腳鐵皮石斛的微衛(wèi)星分子標(biāo)記的引物的退火溫度分別是HZsOl:58°C；HZs02:55°C ；HZs03:55°C ；HZs04:55°C ；HZs05:50°C ；HZs06:53°C ；HZs07:56°C。
5.一種如權(quán)利要求1的一組用于鑒定硬腳和軟腳鐵皮石斛的微衛(wèi)星分子標(biāo)記在區(qū)分硬腳和軟腳鐵皮石斛上的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103571949SQ201310476400
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月12日
【發(fā)明者】王慧中, 盧江杰 申請(qǐng)人:杭州師范大學(xué)