傳染性皮下及造血組織壞死病毒的lamp檢測引物組、檢測試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了傳染性皮下及造血組織壞死病毒的LAMP檢測引物組、檢測試劑盒及檢測方法。LAMP檢測引物組包括一對外引物、一對內(nèi)引物和一對環(huán)引物：所述的外引物、內(nèi)引物和環(huán)引物，其核苷酸序列分別為：IHHNV-F3：GAGACAACCGACGACATC；IHHNV-B3：TCTCTGATGACGAAGGTGT；IHHNV-FIP：TTGTGTTCCGCTACTACAGCTCGATCATGGAAGCAATGGA；IHHNV-BIP：TGAAGGGACTCCCAACGGATCTCACTCTCTTCCAGTCG；IHHNV-LF：CATCGGTAGGTTCCAGTCG；IHHNV-LB：CGGACGAAATGGACGGAA。本發(fā)明具有快速高效、操作簡便、高特異性、高靈敏度、鑒定簡便、適合現(xiàn)場檢測等優(yōu)點。
【專利說明】傳染性皮下及造血組織壞死病毒的LAMP檢測引物組、檢測試劑盒及檢測方法
【技術領域】:
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學領域，具體涉及傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)的LAMP檢測引物組、試劑盒及檢測方法。
【背景技術】:
[0002]傳染性皮下及造血組織壞死病毒(Infectioushypodermal and hematopoieticnecrosis virus, IHHNV)是世界各地養(yǎng)殖和野生對蝦的重要病毒性病原之一。該病毒的感染宿主范圍廣、危害非常嚴重；對細角濱對奸(Litopenaeus stylirostris)有很高致病性，能造成其幼體和仔奸高達90%的死亡率；也會導致凡納濱對奸(Litopenaeus vannamei)慢性矮小殘缺綜合癥(Runt-deformity syndrome, RDS ),使養(yǎng)殖凡納濱對奸規(guī)格參差不齊,產(chǎn)量下降，造成高達50%的經(jīng)濟損失。因此，國際獸疫局(OIE)將IHHNV引起的疾病列為必須報告的重要的水生動物病毒性疫病之一。通過原位雜交方法顯示IHHNV普遍存在于我國的很多養(yǎng)殖對蝦中。但是目前對IHHNV引起的對蝦病害尚無有效的治療方法，只能預防，避免與病毒病原體的接觸是最有效的預防措施，而這又主要依賴于早期的快速診斷。因此，建立IHHNV快速、有效、準確的檢測和診斷技術是預防此類疫病的重要技術手段之一。
[0003]近年來基于臨床組織病理學、免疫學以及PCR技術等的各種診斷方法已被用于IHHNV的檢測。但是現(xiàn)有的這些方法都存在一定的不足，例如:基于組織病理學的方法不僅操作繁瑣、費時，而且靈敏度較低；基于免疫學的方法雖然具有敏感性高、檢測快速等特點，可用于大批標本的檢測，但對新鮮樣品進行檢測時出現(xiàn)的假陽性問題在一定程度上還限制著該方法的廣泛應用；而PCR方法敏感、準確、快速，可替代病原學檢測，但由于需要昂貴的儀器設備、較高檢測費用以及對檢測人員較高的技術要求而使其不適用于現(xiàn)場快速檢測及基層普及應用。
[0004]LAMP是由日本學者Notomi發(fā)明的一種新型核酸擴增技術，該技術針對靶基因的6或8個區(qū)域設計4或6條特異引物,利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒溫條件下即可完成核酸擴增反應，擴增出LAMP特征性梯狀條帶。LAMP技術在保持PCR技術優(yōu)點的基礎上，進一步增強了反應的特異性和縮短了檢測時間；特別是它不需使用昂貴的熱循環(huán)儀，凝膠電泳和紫外檢測等設備，降低了成本，已廣泛應用于病原微生物的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0005]本發(fā)明的第一個目的是提供一種對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的LAMP檢測引物組。
[0006]所述的對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的LAMP檢測引物組，包括一對外引物、一對內(nèi)引物和一對環(huán)引物:
[0007]所述的一對外引物,其核苷酸序列為:
[0008]IHHNV-F3:GAGACAACCGACGACATC (SEQ ID N0.1)；[0009]IHHNV-B3:TCTCTGATGACGAAGGTGT (SEQ ID N0.2)；
[0010]所述的一對內(nèi)引物，其核苷酸序列為:
[0011]IHHNV-FIP:TTGTGTTCCGCTACTACAGCTCGATCATGGAAGCAATGGA (SEQ ID N0.3)；
[0012]IHHNV-BIP:TGAAGGGACTCCCAACGGATCTCACTCTCTTCCAGTCG (SEQ ID N0.4)；
[0013] 所述的一對環(huán)引物，其核苷酸序列為:
[0014]IHHNV-LF:CATCGGTAGGTTCCAGTCG (SEQ ID NO:5);
[0015]IHHNV-LB:CGGACGAAATGGACGGAA (SEQ ID NO:6)。
[0016]本發(fā)明的第二個目的是提供一種對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的檢測試劑盒，包括環(huán)介導等溫擴增反應液、DNA聚合酶、陽性對照質(zhì)控品、陰性對照質(zhì)控品和LAMP檢測引物組，其特征在于，所述的LAMP檢測引物組包括一對外引物、一對內(nèi)引物和一對環(huán)引物:
[0017]所述的一對外引物，其核苷酸序列為:
[0018]IHHNV-F3:GAGACAACCGACGACATC (SEQ ID N0.1)；
[0019]IHHNV-B3:TCTCTGATGACGAAGGTGT (SEQ ID N0.2)；
[0020]所述的一對內(nèi)引物，其核苷酸序列為:
[0021]IHHNV-FIP:TTGTGTTCCGCTACTACAGCTCGATCATGGAAGCAATGGA (SEQ ID N0.3)；
[0022]IHHNV-BIP:TGAAGGGACTCCCAACGGATCTCACTCTCTTCCAGTCG (SEQ ID N0.4)；
[0023]所述的一對環(huán)引物，其核苷酸序列為:
[0024]IHHNV-LF:CATCGGTAGGTTCCAGTCG (SEQ ID NO:5);
[0025]IHHNV-LB:CGGACGAAATGGACGGAA (SEQ ID NO:6)。
[0026]所述的環(huán)介導等溫擴增反應液是由IOmM dNTP、10XThermoPol反應緩沖液、150mMMgS04水溶液按照體積比8:5:2混合而成。
[0027]所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶。
[0028]所述陽性對照為含有對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)非結構蛋白基因(NSl)片段的T載體克隆，陰性對照為超純水。
[0029]所述的檢測試劑盒中還可含有顯色劑，所述顯色劑為熒光染料SYT0-9。
[0030]本發(fā)明的第三個目的是提供一種非疾病的診斷和治療目的的對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0031 ] (4)采用病毒DNA提取試劑盒提取樣品DNA ；
[0032](5)使用上述的對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的LAMP檢測引物組，與環(huán)介導等溫擴增反應液、DNA聚合酶和樣品DNA混合形成擴增反應體系，進行環(huán)介導等溫擴增反應，以陽性對照質(zhì)控品和陰性對照質(zhì)控品分別作為陽性對照和陰性對照；
[0033](6)擴增反應完成后，通過與陽性對照和陰性對照進行對比，判斷樣品擴增反應體系中是否擴增得到擴增產(chǎn)物，來判斷樣品中是否含有對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒。
[0034]所述的通過與陽性對照和陰性對照進行對比，判斷樣品擴增反應體系中是否擴增得到擴增產(chǎn)物，來判斷樣品中是否含有對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒，具體為通過濁度儀軟件自行分析反應管中的濁度變化來判斷反應擴增結果，濁度儀軟件界面出現(xiàn)“S”形擴增曲線為陽性，否則為陰性；或者當在檢測試劑盒中含有顯色劑的情況下，如含有熒光染料SYT0-9，在反應管中加入熒光染料SYT0-9，然后將反應管中置于ESE-Quant TubeScanner中，根據(jù)儀器實時讀取的熒光信號來判斷擴增結果。
[0035]所述步驟(2)的擴增反應體系為，25 μ I反應體系含有:IHHNV-F30.2 μ M，IHHNV-B30.2 μ Μ,IHHNV-FIP1.6 μ Μ,IHHNV-BIP1.6 μ Μ,IHHNV-LF0.8 μ Μ,IHHNV-LB0.8 μ Μ,環(huán)介導等溫擴增反應液12.5 μ 1，DNA聚合酶10U，樣品DNAl~lOOng，用超純水補齊到25 μ I。
[0036]所述步驟(2)的進行環(huán)介導等溫擴增反應，其反應參數(shù)為:63°C反應30~60min，并在80°C持續(xù)2min。
[0037]本研究采用新型的恒溫反應及檢測儀器ESE-Quant tube scanner開發(fā)IHHNV的LAMP檢測方法，該儀器通過吸收熒光來實時判斷反應的進行。比傳統(tǒng)LAMP終點判斷產(chǎn)物的濁度或顏色變化更客觀可靠。由于過程的數(shù)據(jù)化和自動化，可用于科研，開發(fā)新的檢測方法。由于其便攜、易操作，比起定量PCR儀，節(jié)約了大量成本，適合基層推廣檢測，符合疾病檢測的快速、準確的診斷需要。
[0038]本研究將以IHHNV非結構蛋白基因(NSl)為靶位點設計LAMP引物，以ESE-Quanttube scanner為恒溫反應及檢測平臺，建立檢測方法。并在此平臺上與OIE (2012)PCR檢測結果進行比較。
[0039]相比于現(xiàn)有技術，本發(fā)明具有以下有益效果:
[0040](I)快速高效:整個擴增只用30~60min即可完成，擴增產(chǎn)量可達IO9~101°個拷貝；
[0041](2)操作簡便:不需要復雜的儀器，不需要特殊試劑，不需要預先進行雙鏈DNA的變性等繁瑣步驟，只需要一部 恒定溫度儀就能反應和檢測，條件比較溫和；
[0042](3)高特異性:對健康對蝦、耶爾森式菌、李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、綠膿桿菌、霍亂弧菌、金黃色葡萄球菌DNA不發(fā)生擴增，只特異性的對對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒發(fā)生擴增，這是由于本發(fā)明根據(jù)對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)的非結構蛋白基因(GenBank登錄號為AF218266.2)設計了六條特異性引物，應用上述六條引物，擴增靶序列的6個區(qū)域，6個區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進行核酸擴增，故其特異性極高，且非常穩(wěn)定，形成引物二聚體概率低，保證了反應的順利進行；。
[0043](4)聞靈敏度:最低檢測極限可達到Ifg/反應；
[0044](5)鑒定簡便:可通過是否存在焦磷酸鎂沉淀，或者加入SYT0-9，根據(jù)儀器實時讀取的熒光信號來判斷擴增結果。無需電泳等其他任何分析步驟，適合現(xiàn)場檢測。
[0045]因此本發(fā)明具有快速高效、操作簡便、高特異性、高靈敏度、鑒定簡便、適合現(xiàn)場檢測等優(yōu)點。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0046]圖1是實施例1的IHHNV實時熒光LAMP特異性檢測結果圖；
[0047]圖2是實施例2的IHHNV實時熒光LAMP DNA靈敏度檢測結果圖，能檢測到IO5倍稀釋的DNA ；
[0048]圖3是實施例3的IHHNV實時熒光LAMP質(zhì)粒靈敏度檢測圖，能檢測到濃度為Ifg/μ I的陽性質(zhì)粒?！揪唧w實施方式】:
[0049]以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0050]實施例1:
[0051 ] 一、對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的檢測試劑盒
[0052]1、對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的的檢測引物組設計:以對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)的非結構蛋白基因(GenBank登錄號為AF218266.2)為靶位點，利用在線設計軟件 Primer Explorer version4 (http: //primerexplorer.jp/e)進行LAMP引物的設計。引物序列見表1。
[0053]表1:引物序列表
[0054]
【權利要求】
1.對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的LAMP檢測引物組，其特征在于，包括一對外引物、一對內(nèi)引物和一對環(huán)引物: 所述的一對外引物，其核苷酸序列為:
IHHNV-F3:GAGACAACCGACGACATC ；
IHHNV-B3:TCTCTGATGACGAAGGTGT ； 所述的一對內(nèi)引物，其核苷酸序列為:
ihhnv-fip:ttgtgttccgctactacagctcgatcatggaagcaatgga ；
ihhnv-bip:tgaagggactcccaacggatctcactctcttccagtcg ； 所述的一對環(huán)引物，其核苷酸序列為:
IHHNV-LF: CATCGGTAGGTTCCAGTCG ；
IHHNV-LB: CGGACGAAATGGACGGAA?
2.—種對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的檢測試劑盒，包括環(huán)介導等溫擴增反應液、DNA聚合酶、陽性對照質(zhì)控品、陰性對照質(zhì)控品和LAMP檢測引物組，其特征在于，所述的LAMP檢測引物組包括一對外引物、一對內(nèi)引物和一對環(huán)引物: 所述的一對外引物，其核苷酸序列為:
IHHNV-F3:GAGACAACCGACGACATC ；
IHHNV-B3:TCTCTGATGACGAAGGTGT ； 所述的一對內(nèi)引物，其核苷酸序列為:
ihhnv-fip:ttgtgttccgctactacagctcgatcatggaagcaatgga ；
ihhnv-bip:tgaagggactcccaacggatctcactctcttccagtcg ； 所述的一對環(huán)引物，其核苷酸序列為:
IHHNV-LF: CATCGGTAGGTTCCAGTCG ；
IHHNV-LB:CGGACGAAATGGACGGAA。
3.根據(jù)權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述的環(huán)介導等溫擴增反應液是由IOmM dNTPUO X ThermoPol反應緩沖液、150mM MgS04水溶液按照體積比8:5:2混合而成。
4.根據(jù)權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述的DNA聚合酶為BstDNA聚合酶。
5.根據(jù)權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述的陽性對照質(zhì)控品為含有對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒非結構蛋白基因NSl片段的T載體克隆，陰性對照質(zhì)控品為超純水。
6.根據(jù)權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述的檢測試劑盒中還含有顯色劑，所述顯色劑為熒光染料SYT0-9。
7.一種非疾病的診斷和治療目的的對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)采用病毒DNA提取試劑盒提取樣品DNA； (2)使用權利要求1所述的對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒的LAMP檢測引物組，與環(huán)介導等溫擴增反應液、DNA聚合酶和樣品DNA混合形成擴增反應體系，進行環(huán)介導等溫擴增反應，以陽性對照質(zhì)控品和陰性對照質(zhì)控品分別作為陽性對照和陰性對照；(3)擴增反應完成后，通過與陽性對照和陰性對照進行對比，判斷樣品擴增反應體系中是否擴增得到擴增產(chǎn)物，來判斷樣品中是否含有對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒。
8.根據(jù)權利要求7所述的檢測方法，其特征在于，所述的通過與陽性對照和陰性對照進行對比，判斷樣品擴增反應體系中是否擴增得到擴增產(chǎn)物，來判斷樣品中是否含有對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒，具體為通過濁度儀軟件自行分析反應管中的濁度變化來判斷反應擴增結果，濁度儀軟件界面出現(xiàn)“S”形擴增曲線為陽性，否則為陰性；或者當含有顯色劑熒光染料SYT0-9的情況下，在反應管中加入熒光染料SYT0-9，然后將反應管中置于ESE-Quant Tube Scanner中，根據(jù)儀器實時讀取的熒光信號來判斷擴增結果。
9. 根據(jù)權利要求7所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)的擴增反應體系為，25μ1 反應體系含有:IHHNV-F30.2μΜ，IHHNV-B30.2 μ Μ, IHHNV-FIP 1.6 μ Μ,IHHNV-BIP1.6 μ Μ, IHHNV-LF0.8 μ Μ, IHHNV-LB0.8 μ Μ，環(huán)介導等溫擴增反應液 12.5 μ I,DNA聚合酶10U，樣品DNAl~lOOng，用超純水補齊到25 μ I。
10.根據(jù)權利要求7所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)的進行環(huán)介導等溫擴增反應，其反應參數(shù)為:63°C反應30~60min，并在80°C持續(xù)2min。
【文檔編號】C12Q1/68GK103484571SQ201310477057
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年10月12日 優(yōu)先權日:2013年10月12日
【發(fā)明者】趙哲, 李紅梅, 劉助紅, 江曉, 任春華, 胡超群 申請人:中國科學院南海海洋研究所