一種用于鵝性別鑒定的引物、試劑盒及方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種鵝性別鑒定的引物對(duì)、試劑盒及方法。本發(fā)明提供的用于檢測(cè)性別鑒定的引物對(duì)序列如SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示；通過(guò)引物對(duì)鵝血液基因組DNA上CHD基因在Z、W染色體上不同拷貝內(nèi)含子，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)帶型對(duì)鵝性進(jìn)行鑒定：一條帶為公鵝；兩條帶為母鵝。本發(fā)明僅需普通PCR和瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)就可以對(duì)鵝性別進(jìn)行簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的鑒定。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種用于鵝性別鑒定的引物、試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種鵝性別鑒定的引物、試劑盒及方法。
【背景技術(shù)】
[0002]由于公母?jìng)€(gè)體間生長(zhǎng)速度，生長(zhǎng)性能等種質(zhì)特性的不同，在現(xiàn)代養(yǎng)禽業(yè)中大多進(jìn)行早期性別鑒定。目前傳統(tǒng)的性別鑒定除了金銀色羽、快慢羽等方法外，主要通過(guò)翻肛鑒另O。但翻肛鑒別由于需要在雛禽出生24h內(nèi)進(jìn)行鑒定，且勞動(dòng)強(qiáng)度大、需要專(zhuān)業(yè)人員才能進(jìn)行鑒定，此外還存在一定的誤鑒率。公母鵝外形外貌差異較小，根據(jù)外形對(duì)鵝進(jìn)行公母鑒定難度較大，對(duì)實(shí)驗(yàn)采樣和生產(chǎn)都有一定的影響，因此通過(guò)采取鵝羽毛、血液等，通過(guò)分子生物學(xué)手段進(jìn)行性別鑒定具有重要意義。
[0003]雄性禽類(lèi)性染色體為ZZ型，雌性染色體為ZW型，這樣就能通過(guò)擴(kuò)增W染色體上特異性序列而進(jìn)行雌雄鑒別。目前位于性染色體上的性連鎖基因主要有CHD1、ATP5A1及假基因序列EE0.6、Xho I等。禽類(lèi)CHD基因，即染色體螺旋蛋白基因，在大多數(shù)非平胸鳥(niǎo)類(lèi)中具有兩個(gè)同源拷貝CHD-Z和CHD-W，CHD-Z為Z染色體連鎖，CHD-W為W染色體連鎖。CHD基因內(nèi)含子在雌雄個(gè)體之間差異較大，通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增之后，再對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，在母鵝個(gè)體上可見(jiàn)兩條長(zhǎng)度不同的條帶，而在公鵝上僅有一條帶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一是提供一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速的鵝性別鑒定的引物對(duì)。該引物對(duì)為:
[0005]上游引物CHD-F:5，-ggtggcttaatgaggtagca-3，, SEQ ID N0.1 ；
[0006]下游引物CHD-R:5，-aggatggaaatgagtgca-3，, SEQ ID N0.2。
[0007]本發(fā)明的目的之二是一種鵝性別鑒定的PCR試劑盒。
[0008]本發(fā)明提供的鵝性別鑒定的PCR試劑盒，由所述引物對(duì)、雙蒸水、PCR緩沖液、Mg2+、dNTP、DNA聚合酶組成。
[0009]本發(fā)明的目的之三是一種鵝性別鑒定的方法。
[0010]本發(fā)明提供一種利用上述引物鑒別鵝性別的方法，其特征在:以CHD-F/CHD-R為引物，以鵝血液基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。當(dāng)產(chǎn)物條帶產(chǎn)物出現(xiàn)485bp和330bp兩個(gè)條帶時(shí)為母鵝，當(dāng)產(chǎn)物條帶產(chǎn)物出現(xiàn)485bp —個(gè)條帶時(shí)為公鵝。
[0011 ] 上述方法所述PCR擴(kuò)增體系具體組成如下:
[0012]20 μ I 反應(yīng)體系:10 X PCR Buffer2.0 μ L，Mg2+2.2 μ L, dNTP Mixture0.8 μ L, TaqDNA 聚合酶(5υ/μ L)0.2μ L，上、下游引物各 1.0 μ L，鵝 DNA 模板 l.0yL, ddH2011.8μ L。
[0013]上述方法所述PCR擴(kuò)增程序具體組成如下:
[0014]反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性5min ;95°C變性 30s，55.9°C退火 30s，72°C延伸 30s，33 個(gè)循環(huán)；72°C延伸8min ;4°C保存。
[0015]本發(fā)明根據(jù)CHD基因在Z、W染色體上不同拷貝內(nèi)含子差異，設(shè)計(jì)特異性引物，根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳根據(jù)帶型對(duì)鵝性別進(jìn)行簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的鑒定。本發(fā)明只需普通PCR儀及瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備即能完成鵝性別鑒定工作，避免采用傳統(tǒng)方法耗時(shí)、耗力等缺點(diǎn)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為本發(fā)明實(shí)施例2的已知性別鵝的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的部分電泳圖(一條帶為雄性，兩條帶為雌性)；
[0017]圖2為本發(fā)明實(shí)施例2的未知性別鵝的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的部分電泳圖(一條帶為雄性，兩條帶為雌性)。
【具體實(shí)施方式】
[0018]以下對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0019]實(shí)施例1
[0020]利用CHD基因在Z、W染色體上不同拷貝內(nèi)含子差異，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物CHD-F和CHD-R ;所述引物序列為:
[0021]上游引物CHD-F:5’ -ggtggcttaatgaggtagca-3'；
[0022]下游引物CHD-R:5，-aggatggaaatgagtgca-3'。
[0023]本發(fā)明的鵝性別鑒定方法通過(guò)以下實(shí)施例2進(jìn)行描述:
[0024]實(shí)施例2
[0025]采用酚-氯仿萃取法提取鵝血液基因組:
[0026]取10 μ L鵝血液加500 μ L細(xì)胞裂解液，加入10 μ L10%SDS和10 μ L10%蛋白酶K，55°C水浴過(guò)夜；加入500 μ L Tris飽和酚，上下顛倒混勻20min ；12000r/minl0min,小心吸取上層水相于新Ep管中；加入等體積酚、氯仿、異戊醇(25:24:1)混合液，上下顛倒混勻20min ; 12000r/minl0min,小心吸取上層水相于新1.5mL指形管中；加入等體積氯仿、異戍醇(24:1)混合液,上下顛倒混勻20min ;加入2倍體積無(wú)水乙醇,橫向震蕩3min ；12000r/min10min,管底可見(jiàn)白色DNA沉淀；加lmL70%乙醇，洗漆DNA沉淀；8000r/min5min,倒掉乙醇，待乙醇完全蒸發(fā)后，加入100 μ L雙蒸水，室溫溶解，測(cè)定核酸濃度，稀釋為100ng/yL，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0027]鵝CHD基因PCR擴(kuò)增:
[0028]鵝CHD基因PCR擴(kuò)增體系和程序具體組成如下:
[0029]反應(yīng)體系為20 μ L: 10 X PCR Buffer2.0 μ L，Mg2+2.2 μ L, dNT P Mixture0.8 μ L,Taq DNA 聚合酶(5U/μ L) 0.2 μ L，上、下游引物各 1.0 μ L，DNA 模板 1.0 μ L，ddH2011.8 μ L。反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，55.9°C退火30s，72°C延伸30s，33個(gè)循環(huán)；72°C延伸8min ;4°C保存。
[0030]瓊脂糖檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物:
[0031 ] 取5 μ LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1.5%(質(zhì)量百分含量)瓊脂糖凝膠110V電壓電泳25min，用凝膠成像系統(tǒng)拍照對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。根據(jù)帶型就判斷性別:一條帶為公鵝；兩條帶為母鵝。圖1為已知性別鵝的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的部分電泳圖，其中一條帶為雄性個(gè)體，兩條帶為雌性個(gè)體，共檢測(cè)30只，雌雄個(gè)體各半，最終結(jié)果顯示鑒定準(zhǔn)確率為100% ;圖2為未知性別鵝的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的部分電泳圖，共檢測(cè)30個(gè)個(gè)體，根據(jù)本發(fā)明專(zhuān)利方法鑒定結(jié)果與解剖鑒定或?qū)I(yè)人員翻肛鑒別結(jié)果 一致。
【權(quán)利要求】
1.一種用于鵝性別鑒定的引物對(duì)，其序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示。
2.一種鵝性別鑒定的PCR試劑盒，其特征在于該試劑盒包括權(quán)利要求1所述的引物對(duì)、雙蒸水、PCR緩沖液、Mg2+、dNTP、DNA聚合酶。
3. 一種鑒定鵝性別鑒定的方法，其特征在于:用權(quán)利要求1所述的引物對(duì)，以鵝血液基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶出現(xiàn)485bp和330bp兩個(gè)條帶時(shí)為母鵝，當(dāng)產(chǎn)物條帶產(chǎn)物出現(xiàn)485bp —個(gè)條帶時(shí)為公鵝。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103468825SQ201310479378
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年10月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月14日
【發(fā)明者】龔道清, 張宜輝, 張蕊, 張軍, 宋政, 朱振鵬 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)