用于檢測h7n9病毒ha基因和na基因的rt-lamp引物組合及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測H7N9病毒HA基因和NA基因的RT-LAMP引物組合及試劑盒。使用本發(fā)明組合引物及試劑盒可以在等溫條件下，快速、方便、高效、高特異性、高靈敏度地檢測到H7N9病毒的HA基因和NA基因，不需要復(fù)雜儀器，能較好滿足對H7N9的臨床樣本檢測，為快速篩查H7N9病毒提供了新的技術(shù)平臺，能較好滿足目前對H7N9病毒檢測的迫切需要，用于基層衛(wèi)生醫(yī)療單位，各疾病預(yù)防控制中心的快速檢測，易于大范圍推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場前景和較高的經(jīng)濟、社會效益。
【專利說明】用于檢測H7N9病毒HA基因和NA基因的RT-LAMP引物組合及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)療衛(wèi)生檢驗領(lǐng)域，涉及一種用于檢測H7N9病毒HA基因和NA基因的引物組合及試劑盒，還涉及一種用于檢測H7N9病毒HA和NA基因的RT-LAMP試劑盒及檢測方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]2013年3月，在中國上海市和安徽省分別發(fā)現(xiàn)3例以嚴(yán)重的下呼吸道感染為特征的病人，中國疾病預(yù)防控制中心確定為新型禽流感病毒(H7N9)感染，截止到2013年4月20日，在全國范圍內(nèi)已經(jīng)確診96例H7N9感染病例，其中18例死亡，目前感染人數(shù)仍在增加。
[0003]環(huán)介導(dǎo)的等溫核酸擴增技術(shù)(LAMP)是由Τ.Notomi (Notomi T, OkayamaH, MasubuchiHj et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.NucleicAcids Res2000;28(12):63.)發(fā)明的一種新型核酸擴增技術(shù)，該技術(shù)依賴4條特異設(shè)計的引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下可以高效、快速、高特異地擴增革El序列。近年來，國外已將該技術(shù)廣泛應(yīng)用于病原體檢測。Masaki Imai等人(ImaiM, Ninomiya A, Minekawa H Rapid diagnosis of H5Nlavian influenza virus infectionby newly developed influenza H5hemagglutinin gene-specific loop-mediatedisothermal amplification method.[J]Virol Methods.2007May;141(2):173-80.)利用LAMP建立了禽流感病毒的實驗室確診體系。Nobuyuki Hayashi等人(Hayashi N, AraiR, Tada S，Taguchi H, Og awa Y Food Microbiol.20070ct_Dec;24 (7-8):778_85Detection and identification of Brettanomyces/Dekkera sp.yeasts with a loop-mediatedisothermal amplification method.)針對四種香酒酵母的ITS序列設(shè)計了 LAMP特異性引物，建立了高效的LAMP檢測體系?；贚AMP技術(shù)建立起來的RT-LAMP技術(shù)可以檢測其它與人類相關(guān)的病毒，如病毒性出血性敗血病(VHS)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、埃博拉病毒(EBOV)、慢性伯基特淋巴瘤病毒(EBV)、虹彩病毒、人類瘡疹病毒8型、造血組織壞死病毒(HHNV)、番茄斑萎病毒、番茄黃化曲葉病毒等。目前，國內(nèi)外均未見有用于檢測H7N9病毒的RT-LAMP試劑盒及其在H7N9病毒檢測中應(yīng)用的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的第一個目的是提供用于檢測H7N9病毒HA基因和NA基因的特異性RT-LAMP引物組合。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，首先從美國基因數(shù)據(jù)庫GenBank檢索獲得H7N9病毒HA基因(GenBank 號:KC885956.1)和 NA 基因(GenBank 號:KC885958.1)序列，通過 BLAST 軟件進行同源性分析，找到特異性的保守靶序列，HA基因特異性保守靶序列的核苷酸序列如序列表中序列13所示，NA基因特異性保守靶序列的核苷酸序列如序列表中序列14所示，再根據(jù)保守靶序列進行RT-LAMP引物設(shè)計。[0006]具體來講，本發(fā)明所提供的用于檢測H7N9病毒HA基因和NA基因的特異性RT-LAMP引物組合，包括6條用于檢測HA基因的引物和6條用于檢測NA基因的引物，具體
序列如下:
【權(quán)利要求】
1.用于檢測H7N9病毒HA基因和NA基因的特異性RT-LAMP引物組合，是根據(jù)保守靶序列進行設(shè)計的，保守靶序列的獲得方法為:首先從美國基因數(shù)據(jù)庫GenBank檢索獲得H7N9病毒 HA 基因(GenBank 號:KC885956.1)和 NA 基因(GenBank 號:KC885958.1)序列，再通過BLAST軟件進行同源性分析，找到特異性的保守靶序列，HA基因特異性保守靶序列的核苷酸序列如序列表中序列13所示，NA基因特異性保守靶序列的核苷酸序列如序列表中序列14所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測H7N9病毒HA基因和NA基因的特異性RT-LAMP引物組合，其特征在于:包括6條用于檢測HA基因的引物和6條用于檢測NA基因的引物，各引物具體序列如下:

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測H7N9病毒HA基因和NA基因的特異性RT-LAMP引物組合，其特征在于:其中，用于檢測HA基因的引物組合，包括兩條外引物H7-11F3和H7-11B3、兩條內(nèi)引物H7-11FIP和H7-11BIP及兩條環(huán)引物H7-11LF和H7-11LB ;外引物:內(nèi)引物:環(huán)引物按摩爾比5:40:20混合。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測H7N9病毒HA基因和NA基因的特異性RT-LAMP引物組合，其特征在于:其中，用于檢測NA基因的引物組合，包括兩條外引物N9-37F3和N9-37B3、兩條內(nèi)引物 N9-37F3FIP 和 N9-37F3BIP 及兩條環(huán)引物 N9-37F3LF 和 N9-37F3LB ；外引物:內(nèi)引物:環(huán)引物按摩爾比5:40:20混合。
5.一種用于檢測H7N9病毒HA基因和/或NA基因的RT-LAMP檢測試劑盒，包含有權(quán)利要求2或3或4所述由6條用于檢測HA基因的引物和/或6條用于檢測NA基因的引物組成的RT-LAMP引物組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包含RT-LAMP反應(yīng)液，與RT-LAMP引物共同構(gòu)成LAMP檢測體系。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒檢的測體系包含:20mMTris-HCl (pH8.8), IOmM KCl, IOmM(NH4)2SO4,0.1 % Tween20，0.8M 甜菜堿(betaine)，8mMMgSO4,1.4mM dNTPs，8U Bst DNA 聚合酶，8U AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶，40pmol 引物 FIP 和 BIP，20pmol引物L(fēng)F和LB, 5pmol引物F3和B3。
8.一種用權(quán)利要求5或6或7所述RT-LAMP試劑盒檢測H7N9病毒HA和NA基因的方法，包括以下步驟: 1)配制23ii L RT-LAMP反應(yīng)液，檢測HA基因時用外引物H7-11F3&H7-11B3、內(nèi)引物H7-11FIP&H7-11BIP和環(huán)引物H7-11LF&H7-11LB,檢測NA基因時用外引物N9-37F3&N9-37B3、內(nèi)引物 N9-37FIP&N9-37BIP 和環(huán)引物 N9-37LF&N9-37LB ； 2)按常規(guī)方法提取待測樣品中的核酸； 3)取2ii L核酸提取液加入步驟I)配制的RT-LAMP反應(yīng)液中，使終反應(yīng)體積為25 u L，混勻反應(yīng)液； 4)置60-65°C恒溫 45min 進行 RT-LAMP 擴增； 5)進行結(jié)果判讀。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述方法，所述步驟5)結(jié)果判讀過程為:擴增前往反應(yīng)液中添加I U L鈣黃綠素，根據(jù)反應(yīng)液的顏色變化判斷結(jié)果:緑色，表明待測樣品中存在H7N9病毒的HA基因或NA基因(結(jié)果陽性);橘黃色，表示待測樣品中不存在H7N9病毒的HA基因或NA基因(結(jié)果陰性)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述方法，所述步驟5)結(jié)果判讀過程為:不添加鈣黃綠素直接用濁度儀根據(jù)濁度變化判斷結(jié)果:濁度(比濁度> 0.3)上升，表明待測樣品中存在H7N9病毒的HA基因或NA基因(結(jié)果陽性);濁度無變化，表明待測樣品中不存在H7N9病毒的HA基因或NA基因(結(jié)果陰性)。
【文檔編號】C12Q1/70GK103525949SQ201310481406
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月15日
【發(fā)明者】袁靜, 黃留玉, 劉威, 楊展, 崔茜 申請人:中國人民解放軍疾病預(yù)防控制所