一種豬圓環(huán)病毒2型高敏感細(xì)胞系的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種對豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）高敏感的細(xì)胞系，同時(shí)還公開了該細(xì)胞系的制備方法，采用PCV2感染PK-15細(xì)胞后3-羥-3-甲戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMG-CoAreductase，HMGCR）的表達(dá)有顯著變化，且沉默HMGCR基因后，PCV2的TCID50達(dá)108.5/mL。用RNA干擾技術(shù)獲得HMGCR基因沉默細(xì)胞系，并經(jīng)過篩選，最終可獲得對PCV2高度敏感的細(xì)胞系。用本發(fā)明制備的HMGCR基因沉默細(xì)胞培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒2型，可獲得較高滴度的病毒，有利于豬圓環(huán)病毒2型致病機(jī)理研究、病毒培養(yǎng)、全病毒滅活苗開發(fā)及工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種豬圓環(huán)病毒2型高敏感細(xì)胞系的制備方法
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】:
本發(fā)明提供了一種對豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)高敏感的細(xì)胞系，同時(shí)還公開了該細(xì)胞系的制備方法，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
[0002]【背景技術(shù)】:
豬圓環(huán)病毒2型引起的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，本病無有效的治療方法。另外，雖然利用常規(guī)PK-15細(xì)胞可以培養(yǎng)PCV2，但PCV2難培養(yǎng)、生長慢，全病毒培養(yǎng)物在滅活前的病毒含量也只能達(dá)到105 5_6_° TCID50/mL，嚴(yán)重制約了 PCV2全病毒滅活疫苗的生產(chǎn)，因此，研究獲取足量PCV2的有效方法十分必要。目前，提高PCV2滴度的方法主要有:
(I)在細(xì)胞培養(yǎng)液中填加免疫激活劑、氨基葡聚糖等化學(xué)物質(zhì)。但這些方法操作復(fù)雜、花費(fèi)較高，不利于在工業(yè)化生產(chǎn)PCV2全病毒滅活疫苗中使用。
[0003](2)篩選對PCV2高度易感且穩(wěn)定的細(xì)胞系。
[0004]但國內(nèi)外相關(guān)研究均是用常規(guī)PK-15細(xì)胞經(jīng)過有限稀釋后獲得對PCV2敏感的細(xì)胞系，尚未見用轉(zhuǎn)基因或基因沉默的方法制備PCV2高易感細(xì)胞系的報(bào)道。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明公開了一種對豬圓環(huán)病毒2型高敏感的細(xì)胞系，利用此細(xì)胞系培養(yǎng)PCV2病毒，可使病毒TCID50達(dá)到l(T9/mL。
[0006]本發(fā)明還提供了豬圓環(huán)病毒2型高敏感的基因沉默細(xì)胞系的制備方法，適用于人工制備豬圓環(huán)病毒2型高敏感的細(xì)胞系。
[0007]本發(fā)明提供的豬圓環(huán)病毒2型高敏感細(xì)胞系，其特征在于:
用RNA干擾技術(shù)沉默PK-15細(xì)胞中與PCV2感染密切相關(guān)的HMGCR基因，并獲得穩(wěn)定細(xì)胞系，利用此細(xì)胞系培養(yǎng)PCV2病毒，可使病毒TCID50達(dá)到108_7mL。
[0008]本發(fā)明公開了一種真核表達(dá)載體pGPHl/GFP/Neo siRNA-HMGCR,用于構(gòu)建HMGCR基因沉默的細(xì)胞系:
本發(fā)明構(gòu)建的真核表達(dá)載體pGPHl/GFP/Neo siRNA-HMGCR是在pGPHl/GFP/Neo siRNA表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，插入人工合成的shRNA片段而成。
[0009]本發(fā)明還提供了用于沉默PK-15細(xì)胞的HMGCR基因的shRNA，其序列為:
Sense:
5’-caccgcagaaactgacacctcaagcttcaagagagcttgaggtgtcagtttctgcttttttg-3J ；
Antisense:
5’ -gatccaaaaaagcagaaactgacacctcaagctctcttgaagcttgaggtgtcagtttctgd ；
同時(shí)設(shè)有陰性對照shRNA，其序列為:
Control Sense:
5’-caccgttctccgaacgtgtcacgtcaa`gagattacgtgacacgttcggagaattttttg-3J ；
Control Antisense:
5’ -gatccaaaaaattctccgaacgtgtcacgtaatctcttgacgtgacacgttcggagaad。[0010]本發(fā)明所述豬圓環(huán)病毒2型高敏感細(xì)胞系的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
1)HMGCR基因沉默載體的制備
1.0用于HMGCR基因沉默的shRNA序列:根據(jù)豬PK-15細(xì)胞的HMGCR基因序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)用于HMGCR基因沉默的shRNA，
其序列為:
Sense:
5’-caccgcagaaactgacacctcaagcttcaagagagcttgaggtgtcagtttctgcttttttg-3J ；
Antisense:
5’ -gatccaaaaaagcagaaactgacacctcaagctctcttgaagcttgaggtgtcagtttctgd ；
同時(shí)設(shè)有陰性對照shRNA，其序列為:
Control Sense:
5' -caccgttctccgaacgtgtcacgtcaagagattacgtgacacgttcggagaattttttg-3'；
Control Antisense:
5' -gatccaaaaaattctccgaacgtgtcacgtaatctcttgacgtgacacgttcggagaac-3'。
[0011]1.2) HMGCR基因沉默載體:將設(shè)計(jì)的shRNA序列合成并連接到pGPHl/GFP/NeosiRNA (GenePharma, China)表達(dá)載體上；
2)HMGCR基因沉默細(xì)胞的制備
2.1)載體線性化:提取HMGCR基因沉默質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamHI酶切，然后乙醇沉淀回收線性DNA片段，用無菌ddH20溶解；
2.2)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染:將線性化的載體按照脂質(zhì)體Fugene HD說明書的方法轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)液，5 % CO2，37 °C培養(yǎng)；
2.3)HMGCR基因沉默細(xì)胞的獲得及鑒定:上述經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用G418篩選8-10天后，獲得抗性細(xì)胞；米用 Western blotting 方法和 Relative quantitative real-timePCR對所獲得的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，得到HMGCR基因沉默的細(xì)胞；
3)HMGCR基因沉默細(xì)胞活力的測定
按照 CellTiter 96? AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega)的方法測定上述HMGCR基因沉默細(xì)胞的活力；
4)對豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)高敏感的基因沉默細(xì)胞的篩選
選取上述HMGCR基因沉默且活力較強(qiáng)的細(xì)胞，接種PCV2病毒，用IFA法測定病毒滴度、用Relative quantitative real-time PCR測定病毒基因組拷貝數(shù)。
[0012]本發(fā)明米用Western blotting 和 Relative quantitative real-time PCR 方法對所獲得的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
[0013]目前已經(jīng)成功獲得了 I株HMGCR基因沉默細(xì)胞，鑒定結(jié)果證明該細(xì)胞具有HMGCR基因沉默的特性；
本發(fā)明還提供HMGCR基因沉默細(xì)胞的Relative quantitative real-time PCR鑒定方法，用于HMGCR基因沉默細(xì)胞的鑒定，其特征在于引物序列如下:
HMG3:5' -tatccgtttccagtccaggt-3'；
HMG4:5'-ttacagcagcaggtttcttg-3'。
[0014]本發(fā)明的積極效果在于:采用PCV2感染PK-15細(xì)胞后3_羥_3_甲戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMG-CoA reductase，HMGCR)的表達(dá)有顯著變化，且沉默HMGCR基因后，PCV2的TCID50達(dá)108 5/mL。因此，用RNA干擾技術(shù)獲得HMGCR基因沉默細(xì)胞系，并經(jīng)過篩選，最終可獲得對PCV2高度敏感的細(xì)胞系。用本發(fā)明制備的HMGCR基因沉默細(xì)胞培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒2型，可獲得較高滴度的病毒，有利于豬圓環(huán)病毒2型致病機(jī)理研究、病毒培養(yǎng)、全病毒滅活苗開發(fā)及工業(yè)化生產(chǎn)。
[0015]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1為HMGCR基因沉默載體框架圖；
圖 2 為 Relative quantitative real-time PCR 法檢測 HMGCR 基因沉默細(xì)胞的 HMGCR基因mRNA表達(dá)量；
圖3為Western blotting法檢測HMGCR基因沉默細(xì)胞的HMGCR蛋白含量；
圖4為MTS法測定HMGCR基因沉默細(xì)胞活力；
圖 5.Relative quantitative real-time PCR 法檢測 HMGCR 基因沉默細(xì)胞感染 PCV2后，PCV2的基因組拷貝數(shù)；
圖6.Western blotting法檢測HMGCR基因沉默細(xì)胞感染PCV2后，PCV2的產(chǎn)量。
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下實(shí)施例證明本發(fā)明的效果，下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明。在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動(dòng)或改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
[0017]實(shí)施例1
HMGCR基因沉默載體的制備
I質(zhì)粒pGPHl/GFP/Neo siRNA表達(dá)載體購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。
[0018]2實(shí)驗(yàn)過程
1)用于HMGCR基因沉默的shRNA序列:
根據(jù)豬PK-15細(xì)胞的HMGCR基因序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成用于HMGCR基因沉默的shRNA，其序列為:
Sense:
5’-caccgcagaaactgacacctcaagcttcaagagagcttgaggtgtcagtttctgcttttttg-3J ；
Antisense:
5’ -gatccaaaaaagcagaaactgacacctcaagctctcttgaagcttgaggtgtcagtttctgd ；
同時(shí)設(shè)有陰性對照shRNA，其序列為:
Control Sense:
5’-caccgttctccgaacgtgtcacgtcaagagattacgtgacacgttcggagaattttttg-3J ；
Control Antisense:
5’ -gatccaaaaaattctccgaacgtgtcacgtaatctcttgacgtgacacgttcggagaad ；
2)HMGCR基因沉默載體構(gòu)建:用BbsI和BamHI雙酶切pGPHl/GFP/Neo siRNA載體，回收載體片段，按照上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司pGPHl-Neo siRNA expression vector kit說明書操作步驟將上述設(shè)計(jì)的shRNA序列(Sense和Antisense，Control Sense和ControlAntisense)分別連接到pGPHl/GFP/Neo siRNA表達(dá)載體的BbsI和BamHI位點(diǎn)之間。[0019]3)轉(zhuǎn)化將上述連接后的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，獲得陽性菌株。
[0020]3結(jié)果測序鑒定，成功構(gòu)建了 HMGCR基因沉默載體pGPHl/GFP/NeosiRNA-HMGCR 和對照載體 pGPHl/GFP/Neo siRNA-control。
[0021]4結(jié)論成功構(gòu)建了 HMGCR基因沉默載體pGPHl/GFP/Neo siRNA-HMGCR和對照載體 pGPHl/GFP/Neo siRNA-control。參見圖1 所示。
[0022]實(shí)施例2
HMGCR基因沉默細(xì)胞的制備
I 質(zhì)粒 pGPHl/GFP/Neo siRNA-HMGCR和pGPHl/GFP/Neo siRNA-control，其中pGPHl/GFP/Neo siRNA-control 作為對照質(zhì)粒。
[0023]2細(xì)胞PK-15細(xì)胞 3實(shí)驗(yàn)過程
1)載體線性化:提取pGPHl/GFP/Neo siRNA-HMGCR和 pGPHl/GFP/Neo siRNA- control質(zhì)粒，分別用限制性內(nèi)切酶 BamHI 酶切 pGPHl/GFP/Neo siRNA-HMGCR 和 pGPHl/GFP/NeosiRNA-control載體，用無菌ddH20溶解；
2)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染:將上述線性化的載體按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑FugeneHD說明書的方法轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)液，5 % CO2, 37 °C培養(yǎng)；
3)HMGCR基因沉默細(xì)胞的獲得及鑒定:上述經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用G418篩選8-10天后，獲得抗性細(xì)胞；采用常規(guī)Western blotting方法和Relative quantitativereal-time PCR對所獲得的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，得到HMGCR基因沉默的細(xì)胞，命名為PK-shHMG ;由對照質(zhì)粒pGPHl/GFP/Neo `siRNA-control轉(zhuǎn)染而獲得的對照細(xì)胞命名為PK-shNC-controlο
[0024]其中，本發(fā)明所述HMGCR基因沉默細(xì)胞的Relativequantitative real-time PCR鑒定方法所用引物序列為:
HMG3:5' -tatccgtttccagtccaggt-3',
HMG4:5' -ttacagcagcaggtttcttg-3'。
[0025]4結(jié)果沉默細(xì)胞PK-shHMG中HMGCR基因表達(dá)量顯著低于其在對照細(xì)胞PK-shNC- control及正常PK-15細(xì)胞中的表達(dá)量；而對照細(xì)胞PK-shNC-control中HMGCR基因表達(dá)量與正常PK-15細(xì)胞中的無差異(圖2，圖3)。
[0026]5結(jié)論獲得HMGCR基因沉默的細(xì)胞PK-shHMG和對照細(xì)胞PK-shNC-control。
[0027]實(shí)施例3
HMGCR基因沉默細(xì)胞活力的測定
I細(xì)胞HMGCR基因沉默的細(xì)胞PK-shHMG和對照細(xì)胞PK-shNC-control。
[0028]2 MTS檢測試劑盒 CellTiter 96? AQueous One Solution Cell ProliferationAssay試劑盒購自Promega公司。
[0029]2 實(shí)驗(yàn)過程按照 CellTiter 96? AQueous One Solution Cell ProliferationAssay (Promega)的方法測定上述細(xì)胞的活力。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphPad Prism v5.0(GraphPad)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。
[0030]3結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，PK-shHMG與PK-shNC-control細(xì)胞之間的活力無差異(圖4)。[0031]4結(jié)論HMGCR基因沉默細(xì)胞PK-shHMG、以及對照細(xì)胞PK-shNC-control的活力與正常細(xì)胞基本一致，可用于病毒感染相關(guān)研究。
[0032]實(shí)施例4
對豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)高敏感的細(xì)胞的篩選
I細(xì)胞 HMGCR基因沉默的細(xì)胞PK-shHMG，和兩個(gè)對照細(xì)胞PK-shNC-control和PK-Cl-controlο
[0033]2實(shí)驗(yàn)過程選取上述HMGCR基因沉默且活力較強(qiáng)的細(xì)胞及對照細(xì)胞，接種PCV2病毒，用Relative quantitative real-time PCR測定病毒基因組拷貝數(shù)、IFA法測定病毒滴度。
[0034]3結(jié)果接種PCV2后，PK-shHMG細(xì)胞中檢測到的PCV2病毒基因組拷貝數(shù)達(dá)1.0X109和病毒滴度TCID50達(dá)108_5/mL，顯著高于對照細(xì)胞。
[0035]4結(jié)論獲得了對豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)高敏感的細(xì)胞，用該細(xì)胞培養(yǎng)PCV2，病毒基因組拷貝數(shù)達(dá)1.0X IO9 (圖5)和病`毒滴度TCID50達(dá)108_7mL左右(圖6)。
【權(quán)利要求】
1.一種對豬圓環(huán)病毒2型高敏感的細(xì)胞系，其特征在于: 用RNA干擾技術(shù)沉默PK-15細(xì)胞中與PCV2感染密切相關(guān)的HMGCR基因，并獲得穩(wěn)定細(xì)胞系，利用此細(xì)胞系培養(yǎng)PCV2病毒，可使病毒TCID50達(dá)到108_7mL。
2.權(quán)利要求1所述的對豬圓環(huán)病毒2型高敏感的基因沉默細(xì)胞系的制備方法，包括以下步驟: 1)HMGCR基因沉默載體的制備 1.1)用于HMGCR基因沉默的shRNA序列: 根據(jù)豬PK-15細(xì)胞的HMGCR基因序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)用于HMGCR基因沉默的shRNA，其序列為
5' -caccgcagaaactgacacctcaag cttcaagagagcttgaggtgtcagtttctgcttttttg-3'；
同時(shí)設(shè)有陰性對照shRNA，其序列為:
5’-caccgttc tccgaacgtgtcacgtcaagagattacgtgacacgttcggagaattttttg-3J ； 1.2) HMGCR基因沉默載體: 將設(shè)計(jì)的shRNA序列合成并連接到pGPHl/GFP/Neo siRNA (GenePharma, China)表達(dá)載體上； 2)HMGCR基因沉默細(xì)胞的制備` 2.1)載體線性化:提取HMGCR基因沉默質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamHI酶切，然后乙醇沉淀回收線性DNA片段，用無菌ddH20溶解； 2.2)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染:將線性化的載體按照脂質(zhì)體Fugene HD說明書的方法轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)液，5 % C02，37 °C培養(yǎng)； 2.3)HMGCR基因沉默細(xì)胞的獲得及鑒定:上述經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用G418篩選8-10天后，獲得抗性細(xì)胞；米用 Western blotting 方法和 Relative quantitative real-timePCR對所獲得的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，得到HMGCR基因沉默的細(xì)胞； 3)HMGCR基因沉默細(xì)胞活力的測定
按照 CellTiter 96? AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega)的方法測定上述HMGCR基因沉默細(xì)胞的活力； 4)對豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)高敏感的基因沉默細(xì)胞的篩選 選取上述HMGCR基因沉默且活力較強(qiáng)的細(xì)胞，接種PCV2病毒，用IFA法測定病毒滴度、用Relative quantitative real-time PCR測定病毒基因組拷貝數(shù)。
3.一種真核表達(dá)載體pGPHl/GFP/Neo siRNA-HMGCR，其特征在于:是在pGPHl/GFP/NeosiRNA表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，插入人工合成的shRNA片段而成。
4.用于沉默PK-15細(xì)胞的HMGCR基因的shRNA，其特征在于其序列為:
Sense:
5’-caccgcagaaactgacacctcaagcttcaagagagcttgaggtgtcagtttctgcttttttg-3J ；
Antisense:
5’ -gatccaaaaaagcagaaactgacacctcaagctctcttgaagcttgaggtgtcagtttctgd ； 陰性對照shRNA，其序列為:
Control Sense:
5’-caccgttctccgaacgtgtcacgtcaagagattacgtgacacgttcggagaattttttg-3J ；Control Antisense: 5’-gatccaaaaaattctccgaacgtgtcacgtaatctcttgacgtgacacgttcggagaad。
5.HMGCR 基因沉默細(xì)胞的 Relative quantitative real-time PCR 鑒定方法，用于HMGCR基因沉默細(xì)胞的鑒定，其特征在于引物序列如下:
HMG3:5’-tatccgtttccagtccaggt-3’ ；
HMG4:5’-ttacagcagcaggtttcttg-3’ 。
【文檔編號】C12R1/91GK103497932SQ201310481480
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月16日
【發(fā)明者】任林柱, 陳福旺, 楊鑫, 歐陽紅生, 逄大欣, 曹宇航, 張明軍, 董美辰 申請人:吉林大學(xué)