一種用于檢測豬流感病毒的試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于檢測豬流感病毒的試劑盒及其應(yīng)用。所述試劑盒可用于豬流感病毒H1N1、H3N2、H1N2亞型的檢測。該試劑盒可在60℃-65℃等溫條件下，能快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測到豬流感病毒，能較好滿足目前對豬流感病毒現(xiàn)場檢測的迫切需要，用于進(jìn)出口檢疫、食品衛(wèi)生部門、畜牧飼養(yǎng)場等的現(xiàn)場檢測，易于大范圍推廣應(yīng)用。
【專利說明】—種用于檢測豬流感病毒的試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動物衛(wèi)生檢驗【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是一種能夠檢測H1N1、H3N2、H1N2亞型豬流感病毒的LAMP引物組及制備的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]豬流感(SwineInfluenza，SI)是由豬流感病毒(Swine Influenza Virus , SIV)引起的一種急性、高度接觸傳染性的群發(fā)性呼吸道疾病，臨床上以突發(fā)、高熱、咳嗽、呼吸困難為特征。20世紀(jì)90年代中期,豬呼吸道疾病綜合征(Porcine respiratory diseasecomplex, PRDC)的發(fā)生和流行使得豬流感的危害更加突出。此外，由于豬是流感病毒基因重組或重配的“混合器”，是禽與人流感病毒基因重配的重要場所，因此該病還具有重要的公共衛(wèi)生意義。
[0003]目前國內(nèi)外報道的豬流感實驗室診斷方法很多，在病原學(xué)診斷方法中主要有病原分離鑒定和RT-PCR等方法。2000年Notomi等首次報道環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)。該技術(shù)是一種新穎的核酸擴(kuò)增方法,其特點是針對革巴基因的6個區(qū)域設(shè)計特異性引物，在等溫條件下(60~65°C)利用Bst鏈置換DNA聚合酶，高效、快速、特異性擴(kuò)增靶序列。LAMP方法I h左右即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，其擴(kuò)增效率可達(dá)到IO9~IOltl個數(shù)量級，與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，該方法具有操作簡單，快速靈敏，不需要特殊的儀器設(shè)備等優(yōu)點。
[0004]目前，該方法在食品安全檢測、流行性病毒檢測、臨床診斷，以及水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域的應(yīng)用及研究已有相關(guān)論文報道。Enomoto及Kaneko等分別采用LAMP和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)兩種方法對與偽狂犬病毒 同屬的7型人類皰疹病毒進(jìn)行DNA擴(kuò)增，測得LAMP反應(yīng)的靈敏性為每管250拷貝，較PCR的敏感性高10倍。wamodo等根據(jù)gyrB基因序列針對結(jié)核分枝桿菌、鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌的特異引物和16S核糖體RNA保守序列的分枝桿菌屬公共引物，用LAMP方法從痰標(biāo)本中鑒定結(jié)核分枝桿菌、鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌，可檢測到10個拷貝的細(xì)菌。在反應(yīng)試管中加入SYBR Green I進(jìn)行檢測。如果含有擴(kuò)增產(chǎn)物，反應(yīng)混合物變綠；反之，則保持SYBR Green I的橙色不變。本專利依據(jù)LAMP技術(shù)的原理，針對豬流感病毒NP基因保守序列，通過各種條件的優(yōu)化和篩選，設(shè)計出I組引物，可用于樣品中豬流感病毒的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個目的是提供一種用于檢測豬流感病毒的LAMP特異性引物組，其特征在于:
SIV-F3 GTCTCAAGGCACCAAACGSEQ ID NO: I
SIV-B3 AAAAGCAGAGAGCACCATSEQ ID NO:2
SIV-FIP ACAGATGCTCTGATTTCTGTGGCTTTTTATCGTATGAACAAATGGAGACT SEQ ID NO:3SIV-BIP GGTGGAATCGGAAGATTCTACATCTTTTTGCTATTTTGAATTAATCGTCCCT
SEQ ID NO:4
(I)它是針對豬流感病毒NP基因的保守區(qū)域設(shè)計的。
[0006](2 )可檢測出HlNl、H3N2、H1N2亞型的豬流感病毒。
[0007]本發(fā)明的另一個目的是提供含有上述引物組的試劑盒。所述的試劑盒包括:
(1)LAMP反應(yīng)液:
每 22 μ L LAMP 反應(yīng)液中含有:2 XBuffer(含 Mg2+) 2.5 μ L ；SIV-F3 0.5 μ L ； SIV-B3
0.5 μ L ；SIV-FIP 4 μ L ；SIV-BIP 4 μ L ；dNTPs 3.5μ L ；/jC 7μ L
(2)8U/y L Bst 酶
(3)用于檢測豬流感病毒的LAMP特異性引物組，其中的引物指的是:
SIV-F3 GTCTCAAGGCACCAAACG SEQ ID NO: I
SIV-B3 AAAAGCAGAGAGCACCATSEQ ID NO:2
SIV-FIP ACAGATGCTCTGATTTCTGTGGCTTTTTATCGTATGAACAAATGGAGACT
SEQ ID NO:3
SIV-BIP GGTGGAATCGGAAGATTCTACATCTTTTTGCTATTTTGAATTAATCGTCCCT
SEQ ID NO:4o
[0008]本發(fā)明所述用于檢測豬流感病毒的試劑盒的制備方法，其特征是包括下述步驟:
(1)擴(kuò)增反應(yīng)體系:在LAMP反應(yīng)體系中加入樣品CDNA模板2μ L，Bst酶I μ L
(2)擴(kuò)增反應(yīng)過程:在DNA循環(huán)儀上95°C條件下變性5min，在63 °C進(jìn)行60min，并且在80°C持續(xù)2min，4°C，保存；
(3)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，取擴(kuò)增產(chǎn)物5μ Li μ L進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果確定檢測樣品是否含有豬流感病毒；
(4)反應(yīng)會產(chǎn)生各種片斷長度的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的擴(kuò)增產(chǎn)物，因此在電泳圖譜中顯示為從點樣孔處開始的彌散和條帶現(xiàn)象，如果電泳后出現(xiàn)特征性“梯狀”條帶，則說明樣品中還有豬流感病毒。如果電泳結(jié)果未見特征性“梯狀”電泳帶，表明樣品中不含有豬流感病毒。
[0009]本發(fā)明公開的用于檢測豬流感病毒的試劑盒與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的積極效果在于:
(I)本發(fā)明在一定程度上提供了我國該病毒檢測能力提高的技術(shù)支撐和理論依據(jù)。此外，基于LAMP方法的特異性和敏感性高，成本低廉，易于操作等諸多優(yōu)勢，為豬流感病毒的實時快速檢測和出入境檢疫提供新技術(shù)來源，對于及時監(jiān)控該病的發(fā)生發(fā)展，制定行之有效的防制措施，對提高我國豬流感病毒免疫防制水平具有重要意義。
[0010](2)由于豬流感病毒有多個血清型，廣泛流行于豬群中的主要有H1N1、H1N2和H3N2型，單純檢測出一種血清型的豬流感病毒會導(dǎo)致誤診。本發(fā)明的用于檢測豬流感病毒的試劑盒可同時檢測出這些血清型的豬流感病毒，適用于臨床病例、病料、細(xì)胞培養(yǎng)物等樣品的檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為LAMP試驗電泳圖；自左向右，依次為1，豬流感病毒；2，空白對照；M，IOObpDNA marker ；圖2為試劑盒檢測臨床樣品電泳圖；自左向右，依次為1，空白對照；2至14臨床樣品；15,陽性對照;M, IOObp DNA marker ；
圖3為特異性試驗電泳圖；自左向右，依次為1，豬瘟病毒；2，豬偽狂犬病毒；3，豬藍(lán)耳病病毒；4，豬細(xì)小病毒；5，豬圓環(huán)病毒；6，豬流感病毒TJl株；7，豬流感病毒TJ3株；8，豬流感病毒TJlO株；9，類禽豬流感病毒抗原；10，空白對照；M，250bp DNA marker。
【具體實施方式】
[0012]為了更充分地解釋本發(fā)明的實施方法，提供了用于檢測豬流感病毒的LAMP引物組的實施實例。這些實施實例僅僅是解釋、而不是限制本發(fā)明的范圍。其中所用的試劑原料均有市售。本發(fā)明所述的豬流感病毒引物組序列見表1。
[0013]表1
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測豬流感病毒的LAMP特異性引物組，其特征在于: SIV-F3 GTCTCAAGGCACCAAACGSEQ ID NO:1 SIV-B3 AAAAGCAGAGAGCACCATSEQ ID NO:2
SIV-FIP ACAGATGCTCTGATTTCTGTGGCTTTTTATCGTATGAACAAATGGAGACT
SEQ ID NO:3
SIV-BIP GGTGGAATCGGAAGATTCTACATCTTTTTGCTATTTTGAATTAATCGTCCCT
SEQ ID NO:4o
2.一種用于檢測豬流感病毒的試劑盒，它是由下述成分組成: (1)LAMP反應(yīng)液:
每 22 μ L LAMP 反應(yīng)液中含有:2 XBuffer(含 Mg2+) 2.5 μ L ；SIV-F3 0.5 μ L ； SIV-B30.5 μ L ；SIV-FIP 4 μ L ；SIV-BIP 4 μ L ；dNTPs 3.5μ L ；/jC 7μ L
(2)8U/y L Bst 酶 (3)用于檢測豬流感病毒的LAMP特異性引物；其中的引物指的是: SIV-F3 GTCTCAAGGCACCAAACGSEQ ID NO: I SIV-B3 AAAAGCAGAGAGCACCATSEQ ID NO:2`
SIV-FIP ACAGATGCTCTGATTTCTGTGGCTTTTTATCGTATGAACAAATGGAGACT
SEQ ID NO:3
SIV-BIP GGTGGAATCGGAAGATTCTACATCTTTTTGCTATTTTGAATTAATCGTCCCT
SEQ ID NO:4o
3.一種用于檢測豬流感病毒HlNl、Η3Ν2、Η1Ν2亞型的LAMP方法，其特征在于:按如下的步驟進(jìn)行: (1)擴(kuò)增反應(yīng)體系:在LAMP反應(yīng)體系中加入樣品cDNA模板2μ L，Bst酶I μ L (2)擴(kuò)增反應(yīng)過程:在DNA循環(huán)儀上95°C條件下變性5min，在63 °C進(jìn)行60min，并且在80°C持續(xù)2min，4°C，保存； (3)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，取擴(kuò)增產(chǎn)物5μ L~7 μ L，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果確定檢測樣品是否含有豬流感病毒； (4)反應(yīng)會產(chǎn)生各種片斷長度的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的擴(kuò)增產(chǎn)物，因此在電泳圖譜中顯示為從點樣孔處開始的彌散和條帶現(xiàn)象，如果電泳后出現(xiàn)特征性“梯狀”條帶，則說明樣品中還有豬流感病毒。
4.權(quán)利要求1所述用于檢測豬流感病毒的LAMP特異性引物組在制備用于檢測H1N1、H3N2、H1N2亞型豬流感病毒的試劑盒中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/70GK103484572SQ201310481607
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月16日
【發(fā)明者】鄢明華, 張莉, 李秀麗, 孫英峰, 韓偉, 路超, 任衛(wèi)科, 王利麗, 池晶晶, 李富強(qiáng), 楊春蕾 申請人:天津市畜牧獸醫(yī)研究所