一株以酪氨酸為底物合成柚皮素的基因工程菌及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株以酪氨酸為底物合成柚皮素的基因工程菌及其構(gòu)建方法，屬于合成生物學(xué)或代謝工程領(lǐng)域。本發(fā)明將編碼丙二酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因matB、丙二酸吸收途徑的基因matC、酪氨酸脫氨酶(TAL)的基因、4-香桂酸：輔酶A連接酶(4CL)基因、查爾酮合成酶(CHS)基因、查爾酮異構(gòu)酶(CHI)基因，共計(jì)六個(gè)基因組成的合成途徑引入大腸桿菌BL21，從而獲得了一株能以酪氨酸為底物合成柚皮素的重組菌，并通過(guò)模塊化改造理論優(yōu)化合成途徑，最終菌株在搖瓶中以酪氨酸為底物發(fā)酵72h后，柚皮素的產(chǎn)量達(dá)到90mg/L。本發(fā)明采用的策略為今后微生物法生產(chǎn)天然小分子物質(zhì)提供了一定的借鑒意義。
【專利說(shuō)明】一株以酪氨酸為底物合成柚皮素的基因工程菌及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株以酪氨酸為底物合成柚皮素的基因工程菌及其構(gòu)建方法，屬于合成生物學(xué)或代謝工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]黃酮類化合物(flavonoids)是一類存在于自然界的、具有2_苯基色原酮結(jié)構(gòu)的化合物，其羥基衍生物多具黃色，因而得名。黃酮類化合物具有多種生物活性，主要包括心血管系統(tǒng)、抗菌及抗病毒、抗腫瘤、抗氧化自由基、抗炎等，對(duì)鎮(zhèn)痛、保肝、抗突變、降血糖和止咳平喘等具有預(yù)防、治療或輔助治療效果，而且人體不能合成黃酮類化合物，只能從植物性食物中獲得，因此近年來(lái)，黃酮類化合物的市場(chǎng)每年增長(zhǎng)30%以上，在藥品和營(yíng)養(yǎng)化學(xué)品領(lǐng)域上具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0003]黃酮類化合物分布廣泛，種類繁多，黃酮類化合物主要包括黃酮類(如黃岑素、黃岑苷等)、黃酮醇類(如槲皮素、生松素等)、二氫黃酮類(如陳皮素、甘草苷等)、二氫黃酮醇類(如水飛薊素、異水飛薊素等)、異黃酮類(如大豆素、葛根素等)、二氫異黃酮類(如魚(yú)藤酮等)、查爾酮類(如異甘草素、補(bǔ)骨脂乙素等)、橙酮類(如金魚(yú)草素等)、黃烷類(如兒茶素等)、花色素類(如飛燕草素、矢車菊素等)和雙黃酮類(如銀杏素、異銀杏素等)。而其中柚皮素是一種很重要的黃酮骨架物質(zhì)，通過(guò)對(duì)柚皮素進(jìn)行羥基化、還原化、烷基化、氧化等修飾可以獲得八千多種其他黃酮類物質(zhì)，另外柚皮素本身作為一種黃酮物質(zhì)具有多種生物活性，主要包括緩解神經(jīng)痛，防止腦水腫的發(fā)生，減少腦缺血的發(fā)生幾率等。
[0004]目前，工業(yè)上生產(chǎn)柚皮素主要采用植物提取的方法，但是如何從植物復(fù)雜的提取液中得到所需要的高純度柚皮素仍然是人類無(wú)法解決的一個(gè)技術(shù)難題，而高污染、使用有毒和有害化學(xué)試劑、以及柚皮素的復(fù)雜結(jié)構(gòu)等因素限制了化學(xué)法的使用，正因如此，微生物發(fā)酵法以使用廉價(jià)無(wú)污染的原料、較低的污染的排放、較低的能源需求等優(yōu)點(diǎn)受到越來(lái)越多的關(guān)注。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于微生物發(fā)酵法生產(chǎn)柚皮素的研究都是在以香豆酸為底物，然而香豆酸價(jià)格昂貴，并且溶解度較低，難以存在于一般的培養(yǎng)基中；另外目前的發(fā)酵法都采用的是兩步法生產(chǎn)，即菌株首先在營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，在達(dá)到一定菌濃的時(shí)候，通過(guò)離心等方法收集所有的菌體置于基本培養(yǎng)基中發(fā)酵，顯然這些都抑制了微生物法在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明成是以較廉價(jià)的酪氨酸為底物，并通過(guò)模塊化改造策略優(yōu)化菌株使其在單一培養(yǎng)基中取得較高的柚皮素產(chǎn)量，為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一株以酪氨酸為底物合成柚皮素的基因工程菌及其構(gòu)建方法，是在Escherichia coli(BL21)中共表達(dá)3個(gè)質(zhì)粒:pCDF-RgTAL_Pc4CL、pET-PhCHS-MsCHI 和 pACYCD-matB-matC。[0007]所述pCDF-RgTAL_Pc4CL是攜帶了編碼酪氨酸脫氨酶TAL和4_香桂酸:輔酶A連接酶4CL的基因的P⑶FDuet-1。所述pET-PhCHS-MsCHI是攜帶了編碼查爾酮合成酶CHS、查爾酮異構(gòu)酶CHI的基因的pETDuet-Ι。所述pACY⑶-matB_matC是攜帶了編碼丙二酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因matB、丙二酸吸收酶的基因matC的pACYCDuet-1。pCDF-RgTAL_Pc4CL采用啟動(dòng)子Trc，拷貝數(shù)為20 ；pET-PhCHS-MsCHI采用啟動(dòng)子T7，拷貝數(shù)為40 ;pACYCD-matB-matC采用啟動(dòng)子T7，質(zhì)粒拷貝數(shù)為10。
[0008]編碼所述丙二酸轉(zhuǎn)運(yùn)的基因matC核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，編碼所述丙二酸吸收酶的基因matB核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，編碼所述酪氨酸脫氨酶TAL的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，編碼所述4-香桂酸:輔酶A連接酶4CL的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，編碼所述查爾酮合成酶CHS的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，編碼所述查爾酮異構(gòu)酶CHI的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
[0009]構(gòu)建含有所述合成途徑的Escherichia coli (BL21)重組菌的方案主要包括以下內(nèi)容:
[0010](I)采用全基因合成方法獲得途徑所需要的六個(gè)基因；
[0011](2)通過(guò)酶切連接構(gòu)建得到三個(gè)共表達(dá)質(zhì)粒P⑶F-RgTAL-Pc4CL、pET-PhCHS-MsCHI，pACY⑶-matB_matC，測(cè)序驗(yàn)證后，將三個(gè)共表達(dá)質(zhì)粒以化學(xué)法轉(zhuǎn)化Escherichia coli (BL21)感受態(tài)細(xì)胞；
[0012](3)挑選能在含有100ug/mL的氨芐，35ug/mL的氯霉素，50ug/mL的鏈霉素等四種抗生素的LB平板上生長(zhǎng)的菌落，使其在含上述的四種抗生素的LB平板上連續(xù)轉(zhuǎn)接三代，得到遺傳穩(wěn)定的重組子，進(jìn)一步PCR驗(yàn)證六個(gè)途徑基因已成功轉(zhuǎn)入到Escherichiacoli(BL21)中。
[0013]利用含有所述合成途徑的E`scherichia coli (BL21)重組菌發(fā)酵生產(chǎn)柚皮素的方法:
[0014](I)MOPS培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖5，氯化銨4，磷酸氫二鉀0.3，丙二酸2，M0PS83.7，N-{三(羧甲基)甲基}甘氨酸7.1668，氯化銨5.1，硫酸鐵0.03，硫酸鉀0.5，氯化鎂1.1，氯化鈉29.2，微量元素(ATCC BAA-2326的配方)10ml，自來(lái)水定容；M0PS培養(yǎng)基的滅菌溫度為115-121 °C，15min，維生素等熱敏性材料配制后0.22 μ m膜過(guò)濾除菌，接種前加入。
[0015](2)將構(gòu)建得到的基因工程菌株接種到MOPS培養(yǎng)基中，500mL搖瓶裝液25mL，于37°C、250rpm條件下培養(yǎng)12_20h至菌株OD6tltl達(dá)到1.0-2.0 ;然后再加入25ml相同的MOPS培養(yǎng)基及終濃度ImM的IPTG，30 0C，250rpm條件下培養(yǎng)60h。
[0016]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明是以一株Escherichia coli (BL21)為出發(fā)菌株,利用合成生物學(xué)和代謝工程手段在菌株體內(nèi)構(gòu)建了一條從酪氨酸到柚皮素的由TAL、4CL、CHS、CH1、matB、matC等六個(gè)基因構(gòu)成的合成途徑，將總途徑分成了三個(gè)模塊，通過(guò)微調(diào)模塊的代謝通量，使代謝流最大程度的流向終產(chǎn)物。重組菌Escherichia coli(BL21)在直接以酪氨酸為底物，發(fā)酵72h后，柚皮素的產(chǎn)量達(dá)到90mg/L，無(wú)需添加貴重的前體物質(zhì)，只在單一培養(yǎng)基中便能合成柚皮素，成功實(shí)現(xiàn)了以酪氨酸為底物來(lái)合成柚皮素。其中采用的模塊化改造策略為今后微生物法生產(chǎn)其他天然小分子化合物提供了一定的借鑒意義。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】[0017]圖1模塊化改造優(yōu)化柚皮素產(chǎn)量。
[0018]圖2LC-MS分析重組工程菌產(chǎn)生的柚皮素；A1，發(fā)酵液中產(chǎn)物的LC/ES1-MS圖譜；A2，發(fā)酵液中產(chǎn)物的MS/MS圖譜；B1，標(biāo)準(zhǔn)品的LC/ES1-MS圖譜；B2，標(biāo)準(zhǔn)品的MS/MS圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0019]柚皮素濃度的測(cè)定:高效液相色譜(HPLC)
[0020]儀器:Agilentll00高效液相色譜儀(配紫外可見(jiàn)檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器和工作站)，色譜條件:
[0021]色譜柱:AminexHPX-87H ion exchange column
[0022]流動(dòng)相:5mMH2SO4
[0023]流速:0.6mL/min/
[0024]柱溫:35°C
[0025]進(jìn)樣量:5μ L
[0026]紫外檢測(cè)器波長(zhǎng):320nm
[0027]樣品制備:500 μ L發(fā)酵液在10，OOOrpm下離心lOmin，取上清液移入1.5mL離心管
中測(cè)柚皮素的含量。取100 μ L上清液移入5mL容量瓶中，超純水定容至刻度線，經(jīng)0.45 μ m濾膜過(guò)濾，濾液供液相色譜分析。
[0028]MOPS培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖5，氯化銨4，磷酸氫二鉀0.3，丙二酸2，M0PS83.7，N-{三(羧甲基)甲基}甘氨酸7.1668，氯化銨5.1，硫酸鐵0.03，硫酸鉀0.5，氯化鎂1.1，氯化鈉29.2，微量元素(ATCC BAA-2326的配方)IOml,自來(lái)水定容至1L。MOPS培養(yǎng)基的滅菌溫度為115-121°C，15min。維生素等熱敏性材料配制后0.22 μ m膜過(guò)濾除菌，接種前加入。
[0029]實(shí)施例1途徑基因的選擇
[0030]苯丙氨酸脫氨酶(TAL)廣泛存在于高等植物、真菌、酵母以及一種原核生物鏈霉菌，人類至今還沒(méi)在真細(xì)菌或者動(dòng)物組織中發(fā)現(xiàn)該酶。盡管TAL分布很廣，但是只有R.glutinis用來(lái)做商業(yè)用途，同時(shí)R.glutinis對(duì)酪氨酸的催化活性也比其他種類要高。在最近的研究中，在最近的研究中，已經(jīng)有人用P.crispum的4-香豆酸:輔酶A連接酶(4CL)、P.hybrida的查爾酮合成酶(CHS)、M.sativa的查爾酮異構(gòu)酶(CHI)的組合來(lái)獲得各種非天然的黃酮類骨架物質(zhì)。因此本發(fā)明選擇深紅酵母(Rhodotorula glutinis)的TAL、香療菜(Petroselinum crispum)的 4CL、矮牽牛(Petunia X hybrida)的 CHS、紫苜猜(Medicagosativa)的 CHI(M91079)。
[0031]天然產(chǎn)物生產(chǎn)平臺(tái)的發(fā)展通常受到前體物質(zhì)或者輔助因子的限制，因?yàn)樗拗骶羞@些物質(zhì)的量通常都不能滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的要求。在形成黃酮類骨架物質(zhì)時(shí)，每生成一個(gè)分子的骨架物質(zhì)需要3mol的丙二酰輔酶A。而大腸桿菌在補(bǔ)充了葡萄糖的培養(yǎng)基指數(shù)生長(zhǎng)時(shí)，其中乙酰輔酶A是輔酶A代謝池中主要組分，丙二酰輔酶A只占其中很少的一部分。因此源于大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的丙二酰輔酶A分子成為限制性前體分子。丙二酰輔酶A的生成途徑有兩種，一種是乙酰輔酶A在乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的作用下轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶A，因此可以通過(guò)共表達(dá)ACC基因、生物素連接酶基因(birA)以及乙酰輔酶A合成酶(ACS)來(lái)提高產(chǎn)量；另一種是通過(guò)丙二酰輔酶A合成酶直接將丙二酰和輔酶A轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶A,這時(shí)可以通過(guò)過(guò)量表達(dá)三葉草根瘤菌(Rhizobium trifolii)的丙二酸轉(zhuǎn)運(yùn)的基因(matB)和丙二酸吸收途徑的基因(matC)基因來(lái)提高產(chǎn)量。但是前一種代謝途徑因?yàn)橐砑由锼?，?duì)大規(guī)模生產(chǎn)化不利，因此選用后種代謝途徑優(yōu)化。
[0032]編碼丙二酸轉(zhuǎn)運(yùn)的基因matC核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，編碼丙二酸吸收酶的基因matB核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，編碼酪氨酸脫氨酶TAL的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，編碼4-香桂酸:輔酶A連接酶4CL的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，編碼查爾酮合成酶CHS的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，編碼查爾酮異構(gòu)酶CHI的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
[0033]實(shí)施例2基于模塊化改造理論的合成途徑優(yōu)化
[0034]對(duì)于構(gòu)建好的合成途徑，本研究欲將其分為三個(gè)模塊，主要基于以下原則:i)4CL的產(chǎn)物香豆酰輔酶A/肉桂酰輔酶A會(huì)抑制途徑中的TAL基因，因此將TAL和4CL劃分為一個(gè)模塊，將CHS和CHI劃分為一個(gè)模塊，欲通過(guò)強(qiáng)化下游模塊，弱化上游模塊來(lái)減輕這種反饋抑制；ii)菌體異源合成黃酮類骨架物質(zhì)時(shí)，丙二酰輔酶A較低的含量通常限制了菌體內(nèi)的黃酮產(chǎn)量，因此將丙二酰輔酶A合成途徑(matB和matC)置于一個(gè)單獨(dú)模塊，通過(guò)改變此模塊的代謝通量來(lái)尋找最優(yōu)丙二酰輔酶A含量。由此將總個(gè)途徑分為三個(gè)模塊分別是:模塊一由TAL和4CL組成；模塊二為CHS和CHI組成；模塊三為matB和matC組成。每個(gè)模塊的代謝通量由質(zhì)粒拷貝數(shù)和啟動(dòng)子的力度來(lái)決定，本系統(tǒng)用到的四個(gè)質(zhì)粒分別為pACYCDuet-1(Novagen:71430),pCDFDuet-1(Novagen:71330),pETDuet-1(Novagen:71353)和pRSFDuet-1 (Novagen: 71363)，其中質(zhì)?？截悢?shù)分別為10，20，40和100 ;啟動(dòng)子選為T(mén)7和Trc，其中T7的力度為5，Trc的力度為I。通過(guò)系統(tǒng)改變每個(gè)模塊的質(zhì)?？截悢?shù)和啟動(dòng)子力度從而改變模塊的代謝通量，通過(guò)鑒定中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物的含量，來(lái)確定最優(yōu)的模塊組合。
[0035]如圖1所示,最終找到最優(yōu)的模塊組合:模塊一表達(dá)質(zhì)粒為P⑶FDuet-1,啟動(dòng)子為T(mén)rc ;模塊二表達(dá)質(zhì)粒為pETDuet-Ι，啟動(dòng)子為T(mén)7 ;模塊三表達(dá)質(zhì)粒為pACYCDuet-Ι，啟動(dòng)子為T(mén)7。
[0036]實(shí)施例3含優(yōu)化模塊工程菌的構(gòu)建
[0037]采用全基因合成方法獲得途徑所需要的六個(gè)基因，大小分別為2.1KbU.7Kb,1.5Kb,0.9Kb、1.5Kb、1.3Kb。分別利用酶切連接技術(shù)將TAL，4CL基因與經(jīng)NcoI和Hindlll，NdeI和BlnI酶切后的質(zhì)粒連接，將CHSjCHI基因與經(jīng)NcoI和HindIILNdeI和BlnI酶切后的質(zhì)粒連接，將matB和matC基因與經(jīng)過(guò)EcoRI和Hindlll，NdeI和KpnI酶切后的質(zhì)粒連接，由此得到三個(gè)共表達(dá)質(zhì)粒 pCDF-RgTAL-Pc4CL、pET-PhCHS-MsCHI，pACYCD-matB-matC。構(gòu)建好的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切分析，并進(jìn)行DNA測(cè)序?；驕y(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。將三個(gè)共表達(dá)質(zhì)粒以化學(xué)法轉(zhuǎn)化Escherichia coli(BL21)感受態(tài)細(xì)胞。挑選能在含有100ug/mL的氨芐，35ug/mL的氯霉素，50ug/mL的鏈霉素等三種抗生素LB平板上生長(zhǎng)的菌落，使其在含上述的三種抗生素的LB平板上連續(xù)轉(zhuǎn)接三代，得到遺傳穩(wěn)定的重組子。挑取陽(yáng)性重組子，測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果，表明六個(gè)途徑基因已成功轉(zhuǎn)入到Escherichiacoli(BL21)中。其中:
[0038]LB 培養(yǎng)基(g/L)
[0039]氯化鈉10g, TryptonelOg, Yeast extract5g,固體培養(yǎng)基添加 20g 瓊脂。
[0040]LB+氨芐、氯霉素、鏈霉素的抗性平板(g/L)[0041]LB+1OOmg氨芐、35mg氯霉素、50mg鏈霉素，固體培養(yǎng)基添加20g瓊脂。
[0042]實(shí)施例4發(fā)酵生產(chǎn)柚皮素的方法
[0043]采用實(shí)施例3得到的基因工程菌為出發(fā)菌株，接種到MOPS培養(yǎng)基中，500mL搖瓶裝液25mL，于37°C、250rpm條件下培養(yǎng)12_20h至菌株OD600達(dá)到1.0-2.0 ;然后再加入25ml相同的MOPS培養(yǎng)基和終濃度為ImM的IPTG，，30°C，250rpm條件下培養(yǎng)60h。
[0044]重組菌與轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒的對(duì)照菌相比較，對(duì)照菌中沒(méi)有檢測(cè)出柚皮素的產(chǎn)量，而重組菌中柚皮素的產(chǎn)量達(dá)到90mg/L。
[0045]雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一株以酪氨酸為底物合成柚皮素的基因工程菌，其特征在于，是在Escherichiacoli (BL21)中表達(dá)了柚皮素合成途徑需要的關(guān)鍵酶系:酪氨酸脫氨酶TAL、4-香桂酸:輔酶A連接酶4CL、查爾酮合成酶CHS、查爾酮異構(gòu)酶CH1、丙二酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶matC以及丙二酸吸收酶matBo
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，編碼所述丙二酸轉(zhuǎn)運(yùn)的基因matC核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，編碼所述丙二酸吸收酶的基因matB核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示，編碼所述酪氨酸脫氨酶TAL的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，編碼所述4-香桂酸:輔酶A連接酶4CL的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，編碼所述查爾酮合成酶CHS的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，編碼所述查爾酮異構(gòu)酶CHI的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述6個(gè)基因通過(guò)3個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行共表達(dá)，所述3個(gè)質(zhì)粒為:(I) P⑶FDuet-1攜帶編碼酪氨酸脫氨酶TAL和4-香桂酸:輔酶A連接酶4CL的基因，得到質(zhì)粒pCDF-RgTAL-Pc4CL，(2)pETDuet_l攜帶編碼查爾酮合成酶CHS、查爾酮異構(gòu)酶CHI的基因，得到質(zhì)粒pET-PhCHS-MsCHI，(3) pACYCDuet_l攜帶編碼丙二酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因matC、丙二酸吸收酶的基因matB,得到質(zhì)粒pACY⑶-matB-matC。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述PCDF-RgTAL-Pc4CL采用啟動(dòng)子Trc，拷貝數(shù)為20 ;所述pET-PhCHS-MsCHI采用啟動(dòng)子T7，拷貝數(shù)為40 ;所述pACYCDuet_l采用啟動(dòng)子T7，質(zhì)?？截悢?shù)為10。
5.構(gòu)建權(quán)利要求4所述基因工程菌的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)采用全基因合成方法獲得途徑所需要的六個(gè)基因； (2)通過(guò)酶切連接構(gòu)建得到三個(gè)共表達(dá)質(zhì)粒pCDF-RgTAL-Pc4CL、pET-PhCHS-MsCHI，pACY⑶-matB-matC，測(cè)序驗(yàn)證后`，將三個(gè)共表達(dá)質(zhì)粒以化學(xué)法轉(zhuǎn)化E.coli(BL21)感受態(tài)細(xì)胞； (3)挑選能在含有100ug/mL的氨節(jié)，35ug/mL的氯霉素，50ug/mL的鏈霉素四種抗生素的LB平板上生長(zhǎng)的菌落，使其在含上述的四種抗生素的LB平板上連續(xù)轉(zhuǎn)接三代，得到遺傳穩(wěn)定的重組子，進(jìn)一步PCR驗(yàn)證六個(gè)途徑基因已成功轉(zhuǎn)入到E.coli (BL21)中。
6.利用權(quán)利要求3所述基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)柚皮素的方法，其特征在于，是將構(gòu)建得到的基因工程菌株接種到MOPS培養(yǎng)基中，500mL搖瓶裝液25mL，于37°C、250rpm條件下培養(yǎng)12-20h至菌株0D_達(dá)到1.0-2.0 ;然后再加入25ml相同的MOPS培養(yǎng)基及終濃度ImM的IPTG,30°C,250rpm 條件下培養(yǎng) 60h。
7.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)6所述的方法，其特征在于，MOPS培養(yǎng)基組成為(g/L):葡萄糖5，氯化銨4，磷酸氫二鉀0.3，丙二酸2，M0PS83.7，N-{三(羧甲基)甲基}甘氨酸7.1668，氯化銨5.1,硫酸鐵0.03,硫酸鉀0.5，氯化鎂1.1,氯化鈉29.2，微量元素IOml,自來(lái)水定容。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述微量元素采用ATCCBAA-2326的配方。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103484420SQ201310482140
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月15日
【發(fā)明者】陳堅(jiān), 周景文, 吳俊俊, 堵國(guó)成 申請(qǐng)人:江南大學(xué)