家族性遺傳性鼻出血致病基因突變檢測試劑盒及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種家族性遺傳性鼻出血致病基因突變檢測試劑盒及應(yīng)用，其含有檢測ACVRL1基因、ENG基因和SMAD4基因編碼區(qū)突變的34對特異性引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1～68所示，本試劑盒檢測頑固性鼻出血致病基因ENG、ACVRL1、SMAD4上的相關(guān)位點是否發(fā)生突變，可應(yīng)用于臨床和實驗室篩查，實現(xiàn)HHT基因檢測的快速、準(zhǔn)確，本試劑盒靈敏性及特異性均較佳，具有良好的臨床前景。
【專利說明】家族性遺傳性鼻出血致病基因突變檢測試劑盒及應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及家族性遺傳性鼻出血致病基因突變檢測試劑盒及應(yīng)用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】?！颈尘凹夹g(shù)】[0002]鼻出血有多種病因,可分為局部原因和全身原因。局部原因有外傷、鼻中隔偏曲、 鼻腔鼻竇鼻咽的腫瘤、鼻腔特殊性傳染病、鼻腔異物；全身原因有急性發(fā)熱性傳染病、心臟及循環(huán)系統(tǒng)疾病、出血性疾病、肝腎疾病、遺傳性出血性毛細(xì)血管擴張癥(HHT)。其中唯一可家族遺傳的就是遺傳性出血性毛細(xì)血管擴張癥。[0003]遺傳性出血性毛細(xì)血管擴張癥是常染色體顯性遺傳的血管性疾病，在北美的發(fā)病率達1:5-8000，表現(xiàn)為皮膚黏膜毛細(xì)血管擴張和臟器動靜脈畸形。鼻出血和胃腸道出血是黏膜受累的常見并發(fā)癥。受累的臟器包括肺臟，肝臟和大腦。HHT是發(fā)育疾病，嚴(yán)重患病的嬰幼兒較少，大部分患者的癥狀隨年齡增長逐漸表現(xiàn)，因此直至其成年期才能做出正確診斷。最常見的臨床癥狀為自發(fā)性反復(fù)性鼻出血，平均發(fā)病年齡為12歲。肺臟、肝臟和大腦的血管畸形可引起突發(fā)出血或血流短路，危及生命。HHT的治療主要是對癥治療，對于頑固性出血患者尚無有效治療手段，突然發(fā)病患者唯有通過早期確診，定期監(jiān)測，早期干預(yù)以避免嚴(yán)重并發(fā)癥。HHT的臨床診斷主要依據(jù)臨床表現(xiàn):鼻出血，皮膚黏膜的毛細(xì)血管擴張，內(nèi)臟的動靜脈畸形和家族史。分子診斷根據(jù)ENG基因、ACVRLl基因和SMAD4基因的篩查結(jié)果， 臨床確診病人的突變檢出率為80%-87%，且基因檢測不受年齡及臨床表現(xiàn)的限制，可實現(xiàn)早期診斷。[0004]ENG基因位于9號染色體，編碼的Endoglin蛋白為血管內(nèi)皮的主要糖蛋白；其同型二聚體與TGFBRl (轉(zhuǎn)化生長因子β的I型受體)和/或TGFBR2 (轉(zhuǎn)化生長因子的β II 型受體)形成復(fù)合受體，與TGFBl和TGFB3有很強的親和性，參與TGF-β /BMP (骨生成蛋白) 信號通路。在內(nèi)皮細(xì)胞與整合蛋白和/或其他RGD受體的結(jié)合中可能起關(guān)鍵作用，調(diào)節(jié)血管發(fā)育生成?；蜃儺惪蓪?dǎo)致遺傳性出血性毛細(xì)血管擴張癥。[0005]ACVRLl基因位于12號染色體，編碼ALKl蛋白。ALKl蛋白屬于TGF-β家族的I 型受體，位于細(xì)胞表面，在絲氨酸-蘇氨酸激酶亞區(qū)、甘氨酸-絲氨酸富集區(qū)、多肽C尾部高度保守。TGF-β的I型受體與ΒΜΡ9/⑶F2和BMPlO結(jié)合，再形成1-1I型受體復(fù)合物，自動磷酸化后結(jié)合并激活SMAD，在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，主要是調(diào)節(jié)血管的生成。ALKl蛋白可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和胚胎發(fā)育。ACVRLl基因突變或缺陷，可導(dǎo)致多種疾病，有遺傳性出血性毛細(xì)血管擴張癥、動靜脈畸形、血管疾病等。[0006]SMAD4基因位于18號染色體，編碼蛋白屬于信號傳導(dǎo)蛋白Smad家族中一員。C0-SMAD是TGF-β信號通路的輔助激活物和調(diào)節(jié)劑，在細(xì)胞核中可形成SMAD2/ SMAD3-SMAD4復(fù)合物，有利于SMAD2/SMAD4/FAST-1與DNA結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄。該基因的突變或缺失可導(dǎo)致胰腺癌、幼年性息肉病合并ΗΗΤ、肺動脈高壓等。[0007]國外報道HHT患者中E NG基因、ACVRLl基因和SMAD4基因所占比例分別為39%-59%、25%-57%、1%_2%。對這3個致病基因聯(lián)合篩查，可提高HHT患者致病突變的檢出率，基因診斷的靈敏性大大提高，實現(xiàn)早期診斷，預(yù)防嚴(yán)重并發(fā)癥。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供家族性遺傳性鼻出血致病基因突變檢測試劑盒及應(yīng)用，本試劑盒檢測頑固性鼻出血致病基因ENG、ACVRL1和SMAD4上的相關(guān)位點是否發(fā)生突變，可應(yīng)用于臨床和實驗室篩查，實現(xiàn)HHT基因檢測的快速、準(zhǔn)確，本試劑盒靈敏性及特異性均較佳，有利于早期診斷。
[0009]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下:家族性遺傳性鼻出血致病基因突變檢測試劑盒，其含有檢測ACVRLl基因、ENG基因和SMAD4基因編碼區(qū)突變的34對特異性引物，所述引物如SEQ ID NO:1~68所示:
[0010]表134對引物序列表
[0011]
【權(quán)利要求】
1.一種家族性遺傳性鼻出血致病基因突變檢測試劑盒，其特征在于，其含有檢測 ACVRLl基因、ENG基因和SMAD4基因編碼區(qū)突變的34對特異性引物，所述引物如SEQ ID NO:1~68所示:SEQ ID NO:15, GAGTGGGAAAGAGACACAGAAC3,SEQ ID NO:25, CAGTCAAGCTCCTACATTCTCC3,SEQ ID NO:35, AAAGCCTGCTTTTCAGAGTGTC3,SEQ ID NO:45, AGTTCCTATCTGCCCCTCCTAC3,SEQ ID NO:55, GATCTAACTGGCAGAGTGGTCT3,SEQ ID NO:65, GTCCTGCAGAAAGAAGAACCTA3,SEQ ID NO:75, GAGTCCAGTCTCATCCTGAAAG3,SEQ ID NO:85, GTCCTGCAGAAAGAAGAACCTA3,SEQ ID NO:95, AGGCAGCGCAGCATCAAGAT3,SEQ ID NO:105, AAACTTGAGCCCTGAGTGCAG3,SEQ ID NO:115, CTAGCTTAGCAGTGACCCAGTC3,SEQ ID NO:125, CTGAAACAACATGCACCTCTAA3,SEQ ID NO:135, TTAGAGGTGCATGTTGTTTCAG3,SEQ ID NO:145, AATACCACTGCCTTGTCCATAC3,SEQ ID NO:155, GAGTCTTGCCTCTGCCATTA3,SEQ ID NO:165, CAGAGGCCTCAGACACAAGT3,SEQ ID NO:175, TGTCCGCCCTGTCTTTCTCC3,SEQ ID NO:185, GGCTTGGCACTCTGACTCTGG3,SEQ ID NO:195, ACTGGACACAGGATAAGGCCCAG3,SEQ ID NO:205, AATACTTGGGGCCTGGTCCGTG3,SEQ ID NO:215, CACCTTATTCTCACCTGGCCTCTT3,SEQ ID NO:225, CTGCCTTGGAGCTTCCTCTGAG3,SEQ ID NO:235, GGGTGGCACAACCTATACAAAT3,SEQ ID NO:245, CAGAGATGGACAGTAGGGACCT3,SEQ ID NO:255, TTCCTGACCTCCTACATGGG3,SEQ ID NO:265, TTCAGCTCAGCAGCAGAGG3,SEQ ID NO:275, TGAGGGAAGGGACTGAGGTG3,SEQ ID NO:285, GTGGGGACT`AGTGTCAGGGGC3,SEQ ID NO:295, GGCCTGTCCGCTTCAGTGTT3,SEQ ID NO:305, GTTTTGTGTCCCGGGAGCTG3,SEQ ID NO:315, CCCCCTGTTCTGCCTCTCTC3,SEQ ID NO:325, CTGATCCAAGGGAGGGGAAG3,SEQ ID NO:335, ACACATATCACAGTGACCAGC3,SEQ ID NO:345, CTAGGGGAGGAACCAGATGTC3,SEQ ID NO:355, CTCCTGATGGTGCCCCTCTCTT3,SEQ ID NO:365, TTGTCTTGTGTTCTGAGCCCCTG3,SEQ ID NO:375, ATTGGGTGGGATACCCTCTGGG3,
SEQ ID NO:385, GGGTTAAGCACGTGACTGTCC3,
SEQ ID NO:395, ATTGACCAAGTCTCCCTCCC3,
SEQ ID NO:405, GAAAGGCGGAGAGGAAGTTC3,
SEQ ID NO:415, GGTGGGGTGAAGAGCAGCTG3,
SEQ ID NO:425, GACCTGGAAGCTCCCACTTGAA3,
SEQ ID NO:435, GAGTAAACCTGGAAGCCGC3,
SEQ ID NO:445, GCCACTAGAACAAACCCGAG3,
SEQ ID NO: 455, CTCCTGATGGTGCCCCTCTCTT3,
SEQ ID NO:465, CTCAGAGGCTTCACCTGGGCTCC3,
SEQ ID NO:475, AGGACCCTGACCTCCGCC3,
SEQ ID NO:485, CTCTCCTGCTGGGCGAGC3,
SEQ ID NO:495, TTCCTTGCAACGTTAGCTG3,
SEQ ID NO:505, TATCTGAAG`AGATGGAGCAC3,
SEQ ID NO:515, AGTTGGTAGGATTGTGAGGA3,
SEQ ID NO:525, TGCCGCTCACACAAACTAAT3,
SEQ ID NO:535, CGTTTATGCTACTTCTGAATTG3,
SEQ ID NO:545, CTGCCGCTCACACAAACTAA3,
SEQ ID NO:555, CTCATGCTGTTACCGCTGA3,
SEQ ID NO:565, CCAAGTGATTGTGCATACC3,
SEQ ID NO:575, TGATAGGCCATGGGTGAGTT3,
SEQ ID NO:585, TGAAACAAAATCACAGGATGAA3,
SEQ ID NO:595, TTGCATTATAAATTGTACTGTATTGGA3,
SEQ ID NO:605, TTCTTTTCTTTTGGGGACAGTT3,
SEQ ID NO:615, TGGAAATTCCTACCTTTTAATGC3,
SEQ ID NO:625, CACCGACAATTAAGATGGAGTG3,
SEQ ID NO:635, AGCATGCTATACAATCTGAAC3,
SEQ ID NO:645, TCCTTCCACCCAGATTTCAA3,
SEQ ID NO:655, AGTTTTAAATAAGTCAGGCATTG3,
SEQ ID NO:665, TTCAAAAATGTCATCATCCCAG3,
SEQ ID NO:675, CTTGGCACTTTAGCAGAGAAG3,
SEQ ID NO:685，GGCAGCAAACACATTTTCAAC3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ー種家族性遺傳性鼻出血致病基因突變檢測試劑盒，其特征在于，所述家族性遺傳性鼻出血致病基因突變檢測試劑盒還包括:dNTP混合液、TaqDNA聚合酶、PCR緩沖液、MgCL2溶液、去離子水的PCR反應(yīng)體系。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ー種家族性遺傳性鼻出血致病基因突變檢測試劑盒用于非診斷目的的檢測ACVRLl基因、ENG基因和SMAD4基因編碼區(qū)的突變。
【文檔編號】C12Q1/68GK103555833SQ201310484949
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月16日
【發(fā)明者】籍靈超, 王洪田, 賈婧杰, 張靜, 尤少華, 白銀 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院