納米脂質(zhì)體在生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及納米脂質(zhì)體技術(shù)在生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，本發(fā)明采用卵磷脂為載體將疏水性底物制備成納米脂質(zhì)體，再進行微生物轉(zhuǎn)化。本發(fā)明特別適用于疏水性化合物的微生物轉(zhuǎn)化，或底物對微生物具有毒性、抑制微生物生長的微生物轉(zhuǎn)化。本發(fā)明能利用卵磷脂增加細胞膜通透性的特性，能發(fā)揮納米脂質(zhì)體生物相容性好、提高水溶性及巨大比表面積的優(yōu)勢，促進底物向細胞內(nèi)運輸，使其進入微生物細胞內(nèi)的量增加，從而提高轉(zhuǎn)化體系底物投料濃度和轉(zhuǎn)化率。本發(fā)明為疏水性化合物的生物轉(zhuǎn)化提供了新方法。
【專利說明】納米脂質(zhì)體在生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及納米脂質(zhì)體在生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有技術(shù)公開了利用微生物轉(zhuǎn)化疏水性化合物在實際應(yīng)用中需要突破的瓶頸是底物的水不溶性造成投料濃度低，轉(zhuǎn)化效率不高。微生物轉(zhuǎn)化屬于兩階段發(fā)酵，其包括:首先需要將微生物菌種在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)適當時間(生長的中期或后期)，積累轉(zhuǎn)化所需要的酶；然后投入需要轉(zhuǎn)化的底物啟動轉(zhuǎn)化。微生物菌種的液體培養(yǎng)通常在水相中進行，底物在水溶液中的溶解度直接關(guān)系到微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的效率，由于微生物轉(zhuǎn)化酶系一般屬于胞內(nèi)酶，只有溶解到液相的底物才能與微生物細胞充分接觸進入細胞。在留體微生物轉(zhuǎn)化過程中，存在一個普遍的現(xiàn)象是隨著投料濃度的提高，轉(zhuǎn)化率會明顯下降，這主要是因為過多的不溶性底物會對菌體生長和轉(zhuǎn)化產(chǎn)生抑制作用。目前解決這一問題的手段主要有機溶劑、表面活性劑、雙水相系統(tǒng)等。
[0003]納米脂質(zhì)體技術(shù)通常應(yīng)用于藥物制劑中，其中，可采用卵磷脂將難溶性藥物制備成納米脂質(zhì)體，能顯著地提高藥物水溶性和生物利用度。納米脂質(zhì)體作為藥物載體具有如下優(yōu)勢:由磷脂雙分子包覆水相囊泡構(gòu)成，生物相容性好；可將脂溶性藥物溶于脂膜內(nèi)；磷脂本身是細胞膜成分，因此對生物體無毒性。另外基于其小尺寸而獲得的巨大比表面積使反應(yīng)更容易進行。有研究顯示，在利用微生物降解留醇邊鏈中，作為納米藥物載體的卵磷脂能夠改變細胞膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)增加細胞膜的通透性，促進疏水性底物進入胞內(nèi)，從而提高甾醇邊鏈降解轉(zhuǎn)化率?；诩{米脂質(zhì)體的上述優(yōu)點，本發(fā)明擬提供基于疏水性底物制備的納米脂質(zhì)體在生物轉(zhuǎn)化中的新的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供納米脂質(zhì)體技術(shù)的新應(yīng)用，具體涉及納米脂質(zhì)體技術(shù)在生物轉(zhuǎn)化中的新應(yīng)用，尤其涉及基于疏水性底物制備的納米脂質(zhì)體在生物轉(zhuǎn)化中的新的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明中，采用卵磷脂為載體將疏水性底物制備成底物納米脂質(zhì)體，再進行投料轉(zhuǎn)化。
[0006]本發(fā)明將疏水性底物制備成納米脂質(zhì)體再進行生物轉(zhuǎn)化，能利用卵磷脂增加細胞膜通透性的特性，又能發(fā)揮納米脂質(zhì)體生物相容性好、提高水溶性及巨大比表面積的優(yōu)勢，促進底物向細胞內(nèi)運輸，使其進入微生物細胞內(nèi)的量增加，從而提高轉(zhuǎn)化體系底物投料濃度和轉(zhuǎn)化率。
[0007]本發(fā)明公開的納米脂質(zhì)體技術(shù)在生物轉(zhuǎn)化中應(yīng)用特別適合于疏水性化合物的微生物轉(zhuǎn)化，如留醇微生物邊鏈降解、留體微生物羥化反應(yīng)等。
[0008]本發(fā)明中，所述的微生物轉(zhuǎn)化是指疏水性化合物的微生物轉(zhuǎn)化，或底物對微生物具有毒性、抑制微生物生長的微生物轉(zhuǎn)化。
[0009]本發(fā)明進一步的提供納米脂質(zhì)體應(yīng)用于生物轉(zhuǎn)化的新方法，其中，以左旋乙基甾烯二酮的微生物11 α羥化反應(yīng)為模型。
[0010]本發(fā)明中，所述的羥化反應(yīng)是留體微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中最重要的反應(yīng)，能為留體藥物化學合成提供重要中間體，鑒于留體在水中極低的溶解度(低于0.1mM)，其微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)是生物轉(zhuǎn)化疏水性化合物的典型例。
[0011]左旋乙基留烯二酮的Ila羥基衍生物是制備強效孕激素去氧孕烯的關(guān)鍵中間體。去氧孕烯是口服避孕藥媽富隆的主要成分，由于媽富隆的副作用小，效果可靠，其應(yīng)用已越來越廣泛。美國專利(US2005/0234251A1)公開的去氧孕烯合成工藝采用左旋乙基甾烯二酮為起始原料，首先利用Aspergillus ochraceous經(jīng)生物轉(zhuǎn)化引入11 a羥基再進行一系列化學反應(yīng)合成去氧孕烯。該專利以有機溶劑DMF溶解底物左旋乙基留烯二酮投料，投料濃度2g/L-6g/L時，羥化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為35%-60%。
[0012]本發(fā)明的生物轉(zhuǎn)化模型系采用金龜子綠僵菌突變株(Metarhizium anisopliae)11490 (CCTCC M2011240)，在左旋乙基留烯二酮上引入Ila羥基，所述菌株已申請專利，專利申請?zhí)?201110199550.7。[0013]更具體的，本發(fā)明的納米脂質(zhì)體用于生物轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于，該轉(zhuǎn)化方法包括下述步驟:
[0014](I)制備底物納米脂質(zhì)體
[0015]以卵磷脂為載體，將底物左旋乙基甾烯二酮(DESl)制成納米脂質(zhì)體；優(yōu)化處方和制備工藝后；考察納米脂質(zhì)體的粒徑和結(jié)構(gòu)、底物包封率及釋放情況。
[0016](2)微生物轉(zhuǎn)化
[0017]微生物菌種:Metarhiziumanisopliaell490(菌種保藏號 CCTCC M2011240),該菌種能在左旋乙基留烯二酮上引入Ila羥基；
[0018]斜面培養(yǎng):將菌種接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，其中添加質(zhì)量百分比為0.25%的蠶蛹粉，26~30°C培養(yǎng)5~10天；
[0019]發(fā)酵培養(yǎng):將上述斜面菌種在無菌條件下用接種環(huán)接I環(huán)于裝有40mL液體培養(yǎng)基(10g/L葡萄糖、10g/L黃豆粉、5g/L蠶蛹粉，pH6.5)的250mL搖瓶中，28 °C條件下，旋轉(zhuǎn)式搖床220r/min培養(yǎng)24小時，得種子液；
[0020]生物轉(zhuǎn)化:將制得的底物納米脂質(zhì)體投入上述制得的種子液中，相同條件下轉(zhuǎn)化60~72h，取轉(zhuǎn)化液分析。
[0021]本發(fā)明中，所述的分析方法包括:
[0022]1.HPLC
[0023]流動相:A水，B乙腈
[0024]波長:215nm/254nm
[0025]流速:L2mL/min
[0026]梯度洗脫:
[0027]0-5min A:B=70:30 保持 5min
[0028]5-15min 梯度 A:B=70:30 — A:B=40:60 保持 IOmin
[0029]15-25min A:B=40:60 保持 IOmin
[0030]樣品用甲醇溶解，底物DESl及其羥化產(chǎn)物DES2結(jié)果如圖1所示；
[0031]2.TLC 及 TLC Scanner[0032]取發(fā)酵液2mL加入2mL乙酸乙酯浸泡過夜,取5uL點樣于GF254硅膠板，同時取底物和產(chǎn)物標準品(lmg/mL) IuL 點樣對照，展開劑 CH2C12:CH30H (20:1), CAMAG Scanner-3掃描分析；
[0033]3.底物納米脂質(zhì)體表征
[0034]采用薄膜分散法制備卵磷脂-底物復(fù)合物混懸液，高壓均質(zhì)機制備納米脂質(zhì)體，以激光粒度電位儀測定粒徑和粒度分布，采用透析法測定包封率。PBS緩沖液透析純化后，透射電鏡觀察形態(tài)；
[0035]結(jié)果顯示，
[0036]( I)制備底物納米脂質(zhì)體，
[0037]采用薄膜分散法將左旋乙基留烯二酮以卵磷脂為載體經(jīng)高壓均質(zhì)機制成納米脂質(zhì)體，經(jīng)測定平均粒徑131.6nm(如圖2所示)，包封率大于93%，透射電鏡分析結(jié)果如圖3所示；
[0038](2)底物吸收試驗
[0039]分析菌絲對納米脂質(zhì)體中底物和游離底物的吸收率，將不同濃度的游離底物或底物納米脂質(zhì)體與懸浮于緩沖液中的菌絲在28°C孵育6h (羥化酶為誘導(dǎo)酶，誘導(dǎo)時間為6_8h)，收獲菌絲，經(jīng)洗滌、高壓均質(zhì)機破碎細胞，離心過濾后，HPLC測定菌絲內(nèi)底物含量，其中，游離底物在菌絲中的吸收率僅為13%左右，而納米脂質(zhì)體的吸收率高達75%左右(如表I所示)，表明納米脂質(zhì)體對底物向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運有很強的促進作用； [0040]表1不同濃度底物及其納米脂質(zhì)體在菌絲中的吸收率
[0041]
【權(quán)利要求】
1.納米脂質(zhì)體在生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，所述的納米脂質(zhì)體采用卵磷脂為載體將疏水性底物制備成底物納米脂質(zhì)體。
2.按權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的生物轉(zhuǎn)化是疏水性化合物的微生物轉(zhuǎn)化，或底物對微生物具有毒性、抑制微生物生長的微生物轉(zhuǎn)化。
3.按權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的微生物轉(zhuǎn)化為留醇微生物邊鏈降解或甾體微生物羥化反應(yīng)。
4.一種納米脂質(zhì)體用于生物轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于，該轉(zhuǎn)化方法包括下述步驟: (1)制備底物納米脂質(zhì)體 以卵磷脂為載體，將底物制成納米脂質(zhì)體；優(yōu)化處方和制備工藝后；考察納米脂質(zhì)體的粒徑和結(jié)構(gòu)、底物包封率及釋放情況； (2)微生物轉(zhuǎn)化 微生物菌種:Metarhizium anisopliaell490,菌種保藏號CCTCC M2011240,該菌種在左旋乙基留烯二酮上引入 Ila羥基； (3)斜面培養(yǎng):將菌種接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，其中添加質(zhì)量百分比為.0.25%的蠶蛹粉，26~30°C培養(yǎng)5~10天； (4)發(fā)酵培養(yǎng):將上述斜面菌種接于裝有液體培養(yǎng)基10g/L葡萄糖、10g/L黃豆粉、5g/L蠶蛹粉，pH6.5的搖瓶中，28°C條件下，旋轉(zhuǎn)式搖床220r/min培養(yǎng)48小時，得種子液； (5)生物轉(zhuǎn)化:將制得的底物納米脂質(zhì)體投入上述制得的種子液中，相同條件下轉(zhuǎn)化60~90h,取轉(zhuǎn)化液分析。
【文檔編號】C12N1/38GK103834609SQ201310485034
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2013年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月26日
【發(fā)明者】葉麗, 馮美卿 申請人:復(fù)旦大學