利用不對(duì)稱雙鏈rna特異性抑制kras的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及通過使用具有不對(duì)稱末端結(jié)構(gòu)的Dicer底物siRNA(DsiRNA)試劑而用于降低KRAS靶RNA和蛋白質(zhì)水平的化合物、組合物和方法。
【專利說明】利用不對(duì)稱雙鏈RNA特異性抑制KRAS的方法和組合物
[0001]本發(fā)明為分案申請(qǐng)，原母案的申請(qǐng)?zhí)枮?01080024105.0，原案國際申請(qǐng)日為2010年4月5日，進(jìn)入中國國家階段日期為2011年11月30日，原案名稱為:利用不對(duì)稱雙鏈RNA特異性抑制KRAS的方法和組合物。
[0002]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0003]本申請(qǐng)依據(jù)美國法典第35篇第119條(e)款要求以下申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益:2009年4月3日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)N0.61/166，559 ;2009年4月3日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)N0.61/166，578 ;2009年4月30日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)N0.61/174，279 ;2009年4月30日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)N0.61/174，306 ;2009年11月3日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)N0.61/257，810 ;和2009年11月3日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)N0.61/257，820。本申請(qǐng)還要求以下申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán):2010年2月11日提交的美國專利申請(qǐng)N0.12/704,256 ;2009年12月18日提交的美國專利申請(qǐng)N0.12/642，371 ;2009年12月18日提交的美國專利申請(qǐng)N0.12/646, 404 ;2009年12月18日提交的美國專利申請(qǐng)N0.12/642，264 ;和2009年9月17日提交的PCT申請(qǐng)N0.PCT/US2009/005214。本申請(qǐng)依據(jù)美國法典第35篇第119條(e)款要求以下申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益:2009年6月3日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)N0.61/183,815 ；2009年6月3日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)N0.61/183,818 ;2009年6月5日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)N0.61/184，735 ;2009年12月11日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)N0.61/285，925 ；和2010年3月I日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)N0.61/309，266。上述申請(qǐng)完整教導(dǎo)以引用的方式并入本文。
發(fā)明領(lǐng)域
[0004]本發(fā)明涉及用于研究、診斷和治療響應(yīng)KRAS基因表達(dá)和/或活性調(diào)節(jié)的特征、疾病和病況的化合物、組合物和方法。本發(fā)明還涉及與某些特征、疾病和病況有關(guān)的化合物、組合物和方法，這些特征、疾病和`病況響應(yīng)KRAS基因表達(dá)通路或介導(dǎo)此類特征、疾病和病況的維持或發(fā)展的其它細(xì)胞過程中所涉及基因的表達(dá)和/或活性調(diào)節(jié)。具體而言，本發(fā)明涉及能夠由Dicer酶加工的小核酸分子，例如Dicer底物siRNA(DsiRNA)，其能夠介導(dǎo)針對(duì)KRAS基因表達(dá)的RNA干擾(RNAi)。這些抗KRAS DsiRNA可用于例如提供用于治療可響應(yīng)受試者體內(nèi)KRAS調(diào)節(jié)的特征、疾病和病況(例如癌癥和/或其它增生性疾病、病癥或病況)的組合物。
[0005]發(fā)明背景
[0006]Ras信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控異常會(huì)導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移(GoodsellDS.0ncologist4:263-4)。據(jù)估計(jì)，所有人腫瘤中有20%_25%含有Ras激活突變；而且在特定腫瘤類型中，這一數(shù)字高達(dá)90%(Downward J.Nat Rev Cancer, 3:11-22)。因此,Ras基因家族的成員是對(duì)于癌癥治療設(shè)計(jì)值得關(guān)注的分子靶。
[0007]三個(gè)人RAS基因編碼高度相關(guān)的188至189個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，命名為H-Ras、N-Ras以及K-Ras4A(KRAS同種型a)和K_Ras4B(KRAS同種型b ;這兩種Kras蛋白由替代性基因剪接產(chǎn)生)。Ras蛋白可充當(dāng)二元分子開關(guān)，用以控制細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。Ras調(diào)控的信號(hào)通路控制例如肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架完整性、増殖、分化、細(xì)胞粘附、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞遷移等過程。在癌癥中，Ras和Ras相關(guān)蛋白通常失調(diào)，導(dǎo)致侵襲和轉(zhuǎn)移增加以及細(xì)胞凋亡減少。Ras激活許多通路，但對(duì)于腫瘤發(fā)生來說特別重要的一條通路似乎是絲裂原激活蛋白(MAP)激酶，這些MAP激酶本身會(huì)將信號(hào)向下游傳導(dǎo)到其它蛋白激酶和基因調(diào)控蛋白(Lodish 等，Molecular Cell Biology (第 4 版)? San Francisco:ff.H.Freeman,第 25章，“Cancer”)。 [0008]具有鏈長(zhǎng)度為25至35個(gè)核苷酸的雙鏈RNA(dsRNA)試劑曾被描述為哺乳動(dòng)物細(xì)胞中靶基因表達(dá)的有效抑制劑(Rossi等，美國專利申請(qǐng)N0.2005/0244858和US2005/0277610)。認(rèn)為這種長(zhǎng)度的dsRNA試劑由RNA干擾(RNAi)通路的Dicer酶加工，使得此類試劑被稱為“Dicer底物siRNA” ( “DsiRNA”)試劑。先前也曾描述過DsiRNA試劑的其它修飾結(jié)構(gòu)(Rossi等，美國專利申請(qǐng)N0.2007/0265220)。
[0009]發(fā)明概述
[0010]本發(fā)明涉及含有雙鏈RNA( “dsRNA”)的組合物及其制備方法。本發(fā)明的dsRNA能夠在體外或哺乳動(dòng)物受試者體內(nèi)降低細(xì)胞中靶KRas基因的表達(dá)。更具體來說，本發(fā)明涉及優(yōu)選的Dicer底物siRNA ( “DsiRNA”)，其結(jié)構(gòu)和修飾模式經(jīng)過優(yōu)化以用作有效且高效的KRAS抑制劑，任選地具有延長(zhǎng)的抑制作用持續(xù)時(shí)間。此類DsiRNA中絕大多數(shù)的靶特異性抑制效カ和功效相對(duì)于針對(duì)相同靶RNA的21個(gè)核苷酸的siRNA都意外地增強(qiáng)。雖然不希望受理論束縛，但這一增強(qiáng)的活性可能反映了 DsiRNA試劑的固有益處，該DsiRNA試劑在RNAi通路中處于較短siRNA試劑參與RNAi通路的點(diǎn)的上游的點(diǎn)處參與該通路。
[0011]一方面，本發(fā)明提供一種分離的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其包含第一和第二核酸鏈以及具有至少25個(gè)堿基對(duì)的雙鏈體區(qū)，其中所述dsRNA的第二條鏈在其3’末端包含1-5個(gè)單鏈核苷酸，其中當(dāng)將所述雙鏈核酸引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中時(shí)，該第二寡核苷酸鏈沿第二寡核苷酸鏈長(zhǎng)度的至少19個(gè)核苷酸且最多35個(gè)核苷酸與選自由SEQ ID NO: 141-186組成的組的靶KRAS cDNA序列充分互補(bǔ)，以降低KRAS靶基因表達(dá)。
[0012]在一個(gè)實(shí)施方案中，從第一寡核苷酸鏈3’末端的第一個(gè)核苷酸(I位)開始，用經(jīng)過修飾的核苷酸取代I位、2位和/或3位。在某些實(shí)施方案中,第一條鏈3’末端的經(jīng)過修飾的核苷酸殘基是脫氧核糖核苷酸、無環(huán)核苷酸或熒光分子。在相關(guān)實(shí)施方案中，第一寡核苷酸鏈3’末端的I位是脫氧核糖核苷酸。
[0013]在另ー實(shí)施方案中，第一條鏈的3’末端與第二條鏈的5’末端形成平端。
[0014]在另ー實(shí)施方案中，第一條鏈的長(zhǎng)度為25個(gè)核苷酸，而第二條鏈的長(zhǎng)度為27個(gè)核苷酸。
[0015]在一個(gè)實(shí)施方案中，第二條鏈包括序列SEQ ID NO: 11-50和135-140。
[0016]在另一實(shí)施方案中，第一條鏈包括序列SEQ ID NO:5、8和91-134。
[0017]在另ー實(shí)施方案中，dsRNA包括第一條鏈/第二條鏈的序列對(duì)，該序列對(duì)是SEQID N0:5/SEQ ID NO:14、SEQ ID N0:8/SEQ ID NO:43、SEQ ID N0:132/SEQ ID NO:138、SEQID N0:91/SEQ ID NO: 11, SEQ ID N0:129/SEQ ID NO: 135, SEQ ID N0:92/SEQ ID NO: 12,SEQ ID N0:130/SEQ ID NO: 136、SEQ ID N0:93/SEQ ID NO: 13、SEQ ID N0:131/SEQ IDNO:137,SEQ ID NO: 94/SEQ ID NO:15,SEQ ID N0:133/SEQ ID NO:139,SEQ ID N0:95/SEQID NO:16、SEQ ID N0:96/SEQ ID NO:17、SEQ ID N0:97/SEQ ID NO:18、SEQ ID N0:98/SEQID NO: 19、SEQ ID N0:99/SEQ ID NO:20、SEQ ID N0:100/SEQ ID NO:21、SEQ ID NO: 101/SEQ ID NO:22, SEQ ID N0:102/SEQ ID NO:23, SEQ ID N0:103/SEQ ID NO:24, SEQ IDN0:104/SEQ ID NO:25、SEQ ID N0:105/SEQ ID NO:26、SEQ ID N0:106/SEQ ID NO:27、SEQID N0:107/SEQ ID NO:28、SEQ ID N0:108/SEQ ID NO:29、SEQ ID N0:109/SEQ ID NO:30、SEQ ID N0:110/SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:lll/SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:112/SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:113/SEQ ID NO:34、SEQ ID N0:114/SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:115/SEQID NO:36、SEQ ID NO:116/SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:117/SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:118/SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:119/SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:134/SEQ ID NO: 140, SEQ IDN0:120/SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:121/SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:122/SEQ ID NO:44,SEQID NO:123/SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:124/SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:125/SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:126/SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:127/SEQ ID N0:49 或 SEQ ID NO:128/SEQ IDN0:50。
[0018]在一個(gè)實(shí)施方案中，第一條鏈和第二條鏈各自的長(zhǎng)度是至少26個(gè)核苷酸。
[0019]在另ー實(shí)施方案中，3’突出的核苷酸包括經(jīng)過修飾的核苷酸。任選地，3’突出的經(jīng)過修飾的核苷酸為2’-0-甲基核糖核苷酸。在相關(guān)實(shí)施方案中，3’突出的所有核苷酸都是經(jīng)過修飾的核苷酸。
[0020]在另ー實(shí)施方案中，第一和第二寡核苷酸鏈中的一者或兩者包含5’磷酸。
[0021]在另ー實(shí)施方案中，dsRNA的經(jīng)過修飾的核苷酸殘基是2’ -0-甲基、2’ -甲氧基こ氧基、2’ -氣、2’ _稀丙基、2’ _0-[2_(甲基氛基)-2_氧代乙基]、4’ _硫代、4’ -CH2-0-2’ -橋、4’ - (CH2) 2-0-2’ -橋、2’ -LNA、2’ -氨基或 2’ -0- (N-甲基氨基甲酸酷)。
[0022]在一個(gè)實(shí)施方案中，dsRNA的3’突出的長(zhǎng)度為1_3個(gè)核苷酸。任選地，該3’突出的長(zhǎng)度為1-2個(gè)核苷酸。在相關(guān)實(shí)施方案中，3’突出的長(zhǎng)度是兩個(gè)核苷酸，并且3’突出的經(jīng)過修飾的核苷酸是2’ -0-甲基修飾的核糖核苷酸。
[0023]在另ー實(shí)施方案中，從第二條鏈的與第一寡核苷酸鏈5’末端核苷酸殘基互補(bǔ)的核苷酸殘基開始，第二寡核苷酸鏈包含交替的經(jīng)過修飾和未修飾的核苷酸殘基。在另ー實(shí)施方案中，從第二條鏈的與第一寡核苷酸鏈5’末端核苷酸殘基互補(bǔ)的核苷酸殘基開始，第二寡核苷酸鏈在從18位至第二寡核苷酸鏈5’末端的所有位置包含未修飾的核苷酸殘基。
[0024]在另ー實(shí)施方案中，第一條鏈和第二條鏈各自的長(zhǎng)度為至少26個(gè)且最多30個(gè)核苷酸。
[0025]在一個(gè)實(shí)施方案中，dsRNA在細(xì)胞中由Dicer內(nèi)源性裂解。
[0026]在另ー實(shí)施方案中，在細(xì)胞環(huán)境中，足以降低靶基因表達(dá)的分離的雙鏈核酸的量是I納摩爾或更低、200皮摩爾或更低、100皮摩爾或更低、50皮摩爾或更低、20皮摩爾或更低、10皮摩爾或更低、5皮摩爾或更低、2皮摩爾或更低或I皮摩爾或更低。
[0027]在另ー實(shí)施方案中，當(dāng)在體外于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中測(cè)定時(shí)，在細(xì)胞環(huán)境中有效濃度為I納摩爾或更低、200皮摩爾或更低、100皮摩爾或更低、50皮摩爾或更低、20皮摩爾或更低、10皮摩爾或更低、5皮摩爾或更低、2皮摩爾或更低或者I皮摩爾或更低時(shí)，分離的dsRNA在降低靶KRAS基因表達(dá)方面比針對(duì)靶KRAS cDNA的同樣至少19個(gè)核苷酸的分離的2Imer siRNA具有更強(qiáng)的效力。
[0028]在另ー實(shí)施方案中，當(dāng)將分離的dsRNA引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中時(shí)，該雙鏈核酸與靶KRAS cDNA序列充分互補(bǔ)，以使KRAS靶基因表達(dá)降低至少10%、至少50%、至少80_90%、至少95%、至少98%或至少99%。
[0029]在另ー實(shí)施方案中，第一條鏈與第二條鏈通過化學(xué)連接子連結(jié)。在相關(guān)實(shí)施方案中，第一條鏈的3’末端與第二條鏈的5’末端通過化學(xué)連接子連結(jié)。
[0030]在一個(gè)實(shí)施方案中，用引導(dǎo)Dicer裂解定向的經(jīng)過修飾的核苷酸取代第二條鏈或第一條鏈的核苷酸。
[0031]在另ー實(shí)施方案中，dsRNA具有的經(jīng)過修飾的核苷酸是脫氧核糖核苷酸、雙脫氧核糖核苷酸、無環(huán)核苷酸、3’ -脫氧腺苷(蟲草素(cordyc印in))、3’ -疊氮基-3’ -脫氧胸苷(AZT)、2’，3’ -雙脫氧肌苷(ddl)、2’，3’ -雙脫氧-3’ -硫代胞苷(3TC)、2’，3’ -雙脫氫_2，，3’ -雙脫氧胸苷(d4T)、3’ -疊氮基-3’ -脫氧胸苷(AZT)的單磷酸核苷酸、2’，3’ -雙脫氧_3’ -硫代胞苷(3TC)和2’，3’ -雙脫氫-2’，3’ -雙脫氧胸苷(d4T)的單磷酸核苷酸、4-硫尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5- (3-氨基烯丙基)-尿嘧啶、2’ -0-烷基核糖核苷酸、2’ -0-甲基核糖核苷酸、2’ -氨基核糖核苷酸、2’ -氟核糖核苷酸或鎖核酸。
[0032]在另ー實(shí)施方案中，dsRNA具有磷酸酷、硫代磷酸酯或磷酸三酯磷酸骨架修飾。
[0033]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于降低哺乳動(dòng)物細(xì)胞中靶KRAS基因表達(dá)的方法，該方法包括使哺乳動(dòng)物細(xì)胞在體外與足以降低細(xì)胞中靶KRAS基因表達(dá)的量的所述分離的dsRNA接觸。
[0034]在一個(gè)實(shí)施方案中，將靶KRAS基因表達(dá)降低至少10%、至少50%或至少80_90%。在另ー實(shí)施方案中，在細(xì)胞與dsRNA接觸后至少8天，將靶KRASmRNA水平降低至少90%。在另一實(shí)施方案中，在細(xì)胞與dsRNA接觸后至少10天，將KRAS mRNA水平降低至少70%。
[0035]在另ー實(shí)施方案中，本`發(fā)明提供ー種通過對(duì)哺乳動(dòng)物施用足以降低哺乳動(dòng)物體內(nèi)靶KRAS基因表達(dá)的量的所述分離的dsRNA來降低哺乳動(dòng)物體內(nèi)靶KRAS基因表達(dá)的方法。
[0036]在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的dsRNA以每天每公斤哺乳動(dòng)物I微克至5毫克、每公斤100微克至0.5毫克、每公斤0.001至0.25毫克、每公斤0.01至20微克、每公斤0.01至10微克、每公斤0.10至5微克或每公斤0.1至2.5微克的劑量施用。
[0037]在另ー實(shí)施方案中，當(dāng)在體外于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中測(cè)定時(shí)，在細(xì)胞環(huán)境中有效濃度為I納摩爾或更低時(shí)，分離的dsRNA在降低靶KRAS基因表達(dá)方面比針對(duì)靶KRAS cDNA的同樣至少19個(gè)核苷酸的分離的21mer siRNA的具有更強(qiáng)的效力。
[0038]在另ー實(shí)施方案中，施用步驟包括靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、輸注、皮下注射、透皮遞送、氣霧劑遞送、直腸遞送、陰道遞送、局部遞送、ロ服遞送或吸入遞送。
[0039]在另ー實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種通過使細(xì)胞與足以抑制所述細(xì)胞生長(zhǎng)的量的所述分離的dsRNA接觸來選擇性抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。
[0040]在一個(gè)實(shí)施方案中,所述細(xì)胞是受試者的腫瘤細(xì)胞。任選地,所述細(xì)胞為體外腫瘤細(xì)胞。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
[0041]在另ー實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種制劑，其包含所述分離的dsRNA，其中當(dāng)在體外將dsRNA引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中時(shí)，dsRNA的存在量可以將靶KRAS RNA水平有效降低至少10%、至少50%或至少80-90%，且其中當(dāng)在體外于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中測(cè)定時(shí)，在細(xì)胞環(huán)境中有效濃度為I納摩爾或更低時(shí)，dsRNA在降低靶KRAS RNA水平方面比針對(duì)靶KRAS cDNA的同樣至少19個(gè)核苷酸的分離的21mer siRNA具有更強(qiáng)的效力。[0042]在一個(gè)實(shí)施方案中，在細(xì)胞環(huán)境中，有效量是I納摩爾或更低、200皮摩爾或更低、100皮摩爾或更低、50皮摩爾或更低、20皮摩爾或更低、10皮摩爾或更低、5皮摩爾或更低、2皮摩爾或更低或者I皮摩爾或更低。
[0043]在另ー實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種制劑，其包含所述分離的dsRNA，其中當(dāng)將dsRNA引入哺乳動(dòng)物受試者的細(xì)胞中吋，dsRNA的存在量將靶RNA水平有效降低至少10%、至少50%或至少80-90%，且其中當(dāng)在體外于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中測(cè)定時(shí)，在細(xì)胞環(huán)境中有效濃度為I納摩爾或更低時(shí)，dsRNA在降低靶KRAS RNA水平方面比針對(duì)靶KRAS cDNA的同樣至少19個(gè)核苷酸的分離的21mer siRNA具有更強(qiáng)的效力。
[0044]在一個(gè)實(shí)施方案中，有效量是每天每公斤受試者I微克至5毫克、每公斤100微克至0.5毫克、每公斤0.001至0.25毫克、每公斤0.01至20微克、每公斤0.01至10微克、每公斤0.10至5微克或每公斤0.1至2.5微克的劑量。
[0045]在另ー實(shí)施方案中，本發(fā)明提供ー種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其含有所述分離的dsRNA。
[0046]本發(fā)明的另ー實(shí)施方案提供ー種藥物組合物，其包含所述分離的dsRNA和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明另一實(shí)施方案提供ー種試劑盒，該試劑盒具有所述分離的dsRNA和其使用說明。
[0047]另ー方面，本發(fā)明提供ー種具有KRAS抑制活性的組合物，該組合物實(shí)質(zhì)上由分離的雙鏈核糖核酸(dsRNA)組成，該分離的dsRNA包含第一和第二核酸鏈以及至少25個(gè)堿基對(duì)的雙鏈體區(qū)，其中所述dsRNA的第二條鏈在其3’末端包含1-5個(gè)單鏈核苷酸，其中當(dāng)將所述雙鏈核酸引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中時(shí)，第二寡核苷酸鏈沿第二寡核苷酸鏈長(zhǎng)度的至少19個(gè)核苷酸且最多35個(gè)核苷酸與選自由SEQ ID NO: 141-186組成的組的靶KRAS cDNA序列充分互補(bǔ)，以降低KRAS靶基因表達(dá)。
[0048]在另一方面中，本發(fā)明提供一種分離的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，該dsRNA包含第一和第二核酸鏈以及具有至少25個(gè)堿`基對(duì)的雙鏈體區(qū)，其中所述dsRNA的第二條鏈在其3’末端包含1-5個(gè)單鏈核苷酸，其中當(dāng)將雙鏈核酸引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中時(shí)，第二寡核苷酸鏈沿第二寡核苷酸鏈長(zhǎng)度的至少19個(gè)核苷酸且最多35個(gè)核苷酸與選自由SEQ IDNO: 1595-2297和3704-4406組成的組的靶KRAS cDNA序列充分互補(bǔ)，以降低KRAS靶基因表達(dá)。
[0049]在一個(gè)實(shí)施方案中，第二條鏈包括序列SEQ ID NO: 189-891和2298-3000。
[0050]在另ー實(shí)施方案中，第一條鏈包括序列SEQ ID N0:892-1594和3001-3703。
[0051]在另ー實(shí)施方案中，dsRNA包括選自由表4-5中所示的DsiRNA試劑組成的組的DsiRNA 試劑。
[0052]另ー方面，本發(fā)明提供ー種具有KRAS抑制活性的組合物，該組合物實(shí)質(zhì)上由分離的雙鏈核糖核酸(dsRNA)組成，該分離的dsRNA包含第一和第二核酸鏈以及具有至少25個(gè)堿基對(duì)的雙鏈體區(qū)，其中dsRNA的第二條鏈在其3’末端包含1-5個(gè)單鏈核苷酸，其中當(dāng)將所述雙鏈核酸引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中時(shí)，第二寡核苷酸鏈沿第二寡核苷酸鏈長(zhǎng)度的至少19個(gè)核苷酸且最多35個(gè)核苷酸與選自由SEQ ID NO: 1595-2297和3704-4406組成的組的靶KRAS cDNA序列充分互補(bǔ)，由此降低KRAS靶基因表達(dá)。
[0053]附圖簡(jiǎn)述
[0054]圖1示出靶向KRAS RNA中的本文稱為“KRAS-355”祀位點(diǎn)的位點(diǎn)的示例性DsiRNA試劑的結(jié)構(gòu)。與所示的21mer siRNA構(gòu)建體相比較測(cè)試25/27mer和27/27mer DsiRNA試劑(任選地，具有平端/斷裂(fray)設(shè)計(jì))的KRas抑制功效。大寫字母=未修飾的RNA，小寫字母=DNA,粗體=錯(cuò)配堿基對(duì)核苷酸；箭頭表示預(yù)計(jì)的Dicer酶裂解位點(diǎn)；虛線表示對(duì)應(yīng)于祀KRas序列內(nèi)預(yù)計(jì)的Argonaute2(Ago2)裂解位點(diǎn)的有義鏈(上鏈)序列。
[0055]圖2示出圖1所示試劑當(dāng)以I納摩爾的濃度轉(zhuǎn)化到培養(yǎng)的細(xì)胞中時(shí)的抗KRAS抑制功效。“優(yōu)化的”=圖1中的25/27mer DsiRNA和21mer siRNA ;平端/平端和平端/斷裂試劑如圖1所示；“Veh” =媒介物處理的對(duì)照物；“Un”=未處理的對(duì)照物。
[0056]圖3示出圖1所示試劑當(dāng)以100皮摩爾的濃度轉(zhuǎn)化到培養(yǎng)的細(xì)胞中時(shí)的抗KRAS抑制功效?！皟?yōu)化的”=圖1中的25/27mer DsiRNA和21mer siRNA ;平端/平端和平端/斷裂試劑如圖1所示；“Veh” =媒介物處理的對(duì)照物；“Un” =未處理的對(duì)照物。
[0057]圖4示出靶向KRAS RNA中的本文稱為“KRAS-940”祀位點(diǎn)的位點(diǎn)的示例性DsiRNA試劑的結(jié)構(gòu)。測(cè)試25/27mer和27/27mer DsiRNA試劑(任選地，具有平端/斷裂設(shè)計(jì))的KRAS抑制功效，并與所示的21mer siRNA構(gòu)建體相比較。大寫字母=未修飾的RNA，小寫字母=DNA,粗體=錯(cuò)配堿基對(duì)核苷酸；箭頭表示預(yù)計(jì)的Dicer酶裂解位點(diǎn)；虛線表示對(duì)應(yīng)于革巴KRAS序列內(nèi)預(yù)計(jì)的Argonaute2(Ago2)裂解位點(diǎn)的有義鏈(上鏈)序列。
[0058]圖5示出圖4所示試劑當(dāng)以I納摩爾的濃度轉(zhuǎn)化到培養(yǎng)的細(xì)胞中時(shí)的抗KRAS抑制功效。“優(yōu)化的”=圖4中的25/27mer DsiRNA和21mer siRNA ;平端/平端和平端/斷裂試劑如圖4所示；“Veh” =媒介物處理的對(duì)照物；“Un” =未處理的對(duì)照物。
[0059]圖6示出圖4所示試劑當(dāng)以100皮摩爾的濃度轉(zhuǎn)化到培養(yǎng)的細(xì)胞中時(shí)的抗KRAS抑制功效?！皟?yōu)化的”=圖4中的25/27mer DsiRNA和21mer siRNA ;平端/平端和平端/斷裂試劑如圖4所示；“Veh” =媒介物處理的對(duì)照物；“Un” =未處理的對(duì)照物。
[0060]圖7示出測(cè)試的DsiRNA和其Dicer加工產(chǎn)物與針對(duì)相同的確切KRAS靶序列的同源21mer siRNA的示意性比較。2’ -0-甲基修飾以空心圓指示；實(shí)心圓指示脫氧核糖核苷酸；實(shí)心三角形指示25/27mer試劑內(nèi)的Dicer酶裂解位點(diǎn)；空心三角形指示反義鏈上對(duì)應(yīng)于革巴RNA內(nèi)的Argonaute2 (Ago2)裂解位點(diǎn)的位置。當(dāng)與其同源siRNA試劑相比較時(shí),40種測(cè)試的DsiRNA試劑的這些位點(diǎn)相同。
[0061]圖8示出抗KRAS DsiRNA25/27mer與其同源21mer siRNA之間抑制功效的比較圖。該圖是按25/27mer DsiRNA試劑針對(duì)KRAS靶基因的抑制％的等級(jí)次序布置。箭頭指示觀察的DsiRNA試劑與相應(yīng)siRNA試劑之間功效差異。正方形指示siRNA抑制結(jié)果；圓圈指示DsiRNA抑制結(jié)果。
[0062]圖9示出按DsiRNA試劑與其同源siRNA之間抑制作用差異量的等級(jí)次序布置的抑制結(jié)果的圖。以5nM (實(shí)心方形)和InM (實(shí)心三角形)施用后24小時(shí)時(shí)以及以5nM (空心方形)和InM (空心三角形)施用后48小時(shí)時(shí)測(cè)試DsiRNA和siRNA。實(shí)心區(qū)指示觀察到DsiRNA與同源siRNA之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的試劑。對(duì)于40種測(cè)試的抗KRAS DsiRNA試劑中的26種，與40種siRNA試劑中僅6種優(yōu)于DsiRNA試劑形成相比，觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的DsiRNA優(yōu)越性。
[0063]圖10和圖11示出所觀察的所述人KRAS靶向的DsiRNA的IC-50曲線。
[0064]圖12-21示出所觀察的所述DsiRNA的人KRAS抑制功效的柱形圖?！癙1”指示第I階段，而“P2”指示第2階段。在第I階段中，在HeLa細(xì)胞環(huán)境中以InM測(cè)試DsiRNA。在第2階段中，在HeLa細(xì)胞環(huán)境中以InM和0.1nM(以0.1nM進(jìn)行兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn))測(cè)試DsiRNA。單獨(dú)條形表示三次重復(fù)中觀察到的平均人KRAS水平，同時(shí)示出了標(biāo)準(zhǔn)誤差。將人KRAS水平針對(duì)HPRT和SFRS9水平歸ー化。
[0065]圖22-31示出所觀察的所述DsiRNA的小鼠KRAS抑制功效的柱形圖。P1”指示第I階段，而“P2”指示第2階段。在第I階段中，在小鼠H印al-6細(xì)胞中以InM測(cè)試DsiRNA。在第2階段中，在小鼠H印al-6細(xì)胞中以InM和0.1nM(以0.1nM進(jìn)行兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn))測(cè)試DsiRNA。單獨(dú)條形表示三次重復(fù)中觀察到的平均小鼠KRAS水平，同時(shí)顯示了標(biāo)準(zhǔn)誤差。將小鼠KRAS水平針對(duì)HPRT和Rpl23水平歸ー化。
[0066]詳細(xì)說明
[0067]本發(fā)明涉及含有雙鏈RNA( “dsRNA”)的組合物及其制備方法，所述組合物能夠在體內(nèi)或體外降低KRAS基因的水平和/或表達(dá)。dsRNA的一條鏈含有長(zhǎng)度為19至35個(gè)核苷酸的核苷酸序列區(qū)，該核苷酸序列區(qū)可以引導(dǎo)靶KRAS轉(zhuǎn)錄物破壞和/或翻譯抑制。
[0068]定義
[0069]除非另外定義，否則本文所述所有科技術(shù)語都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常了解的含義。以下參考文獻(xiàn)將向技術(shù)人員提供本發(fā)明所用許多術(shù)語的一般定義:Singleton等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (第2版，1994) ；TheCambridge Dictionary of Science and 1'echnology (Walker 編輯，1988) ；The Glossaryof Genetics,第 5 版，R.Rieger 等(編輯)，Springer Verlag (1991)；以及 Hale 和Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。除非另外詳細(xì)說明，本文中所用的以下術(shù)語具有下文所述定義。
[0070]本發(fā)明的特征是ー個(gè)或多個(gè)可調(diào)節(jié)(例如，抑制)KRAS表達(dá)的DsiRNA分子。本發(fā)明的DsiRNA可任選地結(jié)合與KRAS錯(cuò)誤調(diào)控相關(guān)疾病或病癥的保持或發(fā)展(例如，腫瘤形成和/或生長(zhǎng)等)有關(guān)的其它基因和/或基因產(chǎn)物調(diào)節(jié)劑來使用。本發(fā)明的DsiRNA試劑調(diào)節(jié)KRAS RNA,例如對(duì)應(yīng)于GenBank登錄號(hào)NM_033360和NM_004985所提到的cDNA序列的那些，這些序列將于下文敘述且在本文中一般稱為“KRAS”。
[0071]參考示例性的KRAS RNA而提供本發(fā)明各個(gè)方面和實(shí)施方案的以下說明，該示例性的KRAS RNA在本文中一般稱為KRAS。然而，這樣的參考只是意在示例性的，并且本發(fā)明各個(gè)方面和實(shí)施方案也針對(duì)替代性的KRASRNA，例如突變KRAS RNA或其它KRAS剪接變體。某些方面和實(shí)施方案還針對(duì)KRAS通路中所涉及的其它基因，包括其錯(cuò)誤調(diào)控與KRAS的錯(cuò)誤調(diào)控聯(lián)合而起作用(或者受KRAS調(diào)控影響或影響KRAS調(diào)控)以產(chǎn)生可作為治療靶的表型效應(yīng)(例如，腫瘤形成和/或生長(zhǎng)等)的基因?？梢允褂肈siRNA和本文所述的使用KRAS靶向性DsiRNA的方法靶向這些另外的基因。因此，所述另外的基因的抑制和這種抑制的效應(yīng)可如本文所述進(jìn)行。
[0072]術(shù)語“KRAS”是指編碼KRas蛋白質(zhì)、肽或多肽(例如，KRAS轉(zhuǎn)錄物，例如KRASGenbank登錄號(hào)NM_033360.2和NM_004985.3的序列)的核酸序列。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語“KRAS”也意在包括其它KRAS編碼序列，例如其它KRAS同種型、突變KRAS基因、KRAS基因的剪接變體和KRAS基因多態(tài)性。術(shù)語“Kras”用于指KRAS基因/轉(zhuǎn)錄物的多肽基因產(chǎn)物,例如Kras蛋白質(zhì)、肽或多肽，例如KRAS Genbank登錄號(hào)NM_033360.2和NM_004985.3所編碼者。[0073] 本文中使用的“KRAS相關(guān)疾病或病癥”是指本領(lǐng)域中已知與改變的KRAS表達(dá)、水平和/或活性相關(guān)的疾病或病癥。值得注意的是，“KRAS相關(guān)疾病或病癥”包括癌癥和/或增生性疾病、病況或病癥。
[0074]如本領(lǐng)域已知，本文中使用的“增生性疾病”或“癌癥”是指以不受調(diào)控的細(xì)胞生長(zhǎng)或復(fù)制為特征的疾病、病況、特征、基因型或表型；包括白血病，例如急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)和慢性淋巴細(xì)胞性白血?。籄IDS相關(guān)癌癥,例如卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma);乳腺癌；骨癌,例如骨肉瘤、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)、纖維肉瘤、巨細(xì)胞瘤、釉質(zhì)瘤和脊索瘤；腦瘤，例如腦膜瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、低級(jí)別星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、垂體瘤、神經(jīng)鞘瘤和轉(zhuǎn)移性腦瘤；頭頸癌癥，包括各種淋巴瘤，例如套細(xì)胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkinslymphoma)、腺瘤、鱗狀細(xì)胞癌、喉癌、膽囊和膽管癌、視網(wǎng)膜癌(例如視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤)、食道癌、胃癌、多發(fā)性骨髄瘤、卵巣癌、子宮癌、甲狀腺癌、睪丸癌、子宮內(nèi)膜癌、黑色素瘤、結(jié)腸直腸癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌(包括非小細(xì)胞肺癌)、胰腺癌、肉瘤、威爾姆氏腫瘤(Wilms’ tumor)、宮頸癌、頭頸癌、皮膚癌、鼻咽癌、脂肪肉瘤、上皮腫瘤、腎細(xì)胞癌、膽囊腺癌、腮腺腺癌、子宮內(nèi)膜肉瘤、多重耐藥性癌；以及增生性疾病和病況，例如與腫瘤血管生成有關(guān)的新血管形成、黃斑變性(例如,濕性/干性AMD)、角膜新血管形成、糖尿病視網(wǎng)膜病變、新血管性青光眼、近視性變性，以及其它增生性疾病和病況，例如再狹窄和多囊性腎病，和可單獨(dú)或與其它療法組合響應(yīng)細(xì)胞或組織中疾病相關(guān)基因表達(dá)調(diào)節(jié)的其它癌癥或者增生性疾病、病況、特征、基因型或表型。
[0075]在某些實(shí)施方案中，評(píng)估DsiRNA介導(dǎo)的KRAS靶序列抑制。在這些實(shí)施方案中，通過本領(lǐng)域公認(rèn)的方法(例如，RT-PCR> RNA印跡(Northern blot)、表達(dá)陣列等)，任選經(jīng)由比較在本發(fā)明抗KRAS DsiRNA存在下與不存在這ー抗KRAS DsiRNA情況下的KRAS水平，來評(píng)估KRAS RNA水平。在某些實(shí)施方案中，將在抗KRAS DsiRNA存在下的KRAS水平與在単獨(dú)媒介物存在下、在針對(duì)不相關(guān)靶RNA的DsiRNA存在下或在不存在任何處理的情況下所觀察到的KRAS水平相比較。同樣公認(rèn)的是，可以評(píng)估Kras蛋白質(zhì)的水平以用于指示KRASRNA水平和/或DsiRNA抑制KRAS表達(dá)的程度，因此也可以采用本領(lǐng)域公認(rèn)的評(píng)估KRAS蛋白質(zhì)水平的方法(例如，蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)、免疫沉淀法、其它基于抗體的方法等)來檢查本發(fā)明DsiRNA的抑制作用。如果當(dāng)將本發(fā)明的抗KRAS DsiRNA施用于體系(例如，無細(xì)胞體外體系)、細(xì)胞、組織或生物體時(shí)，觀察到KRAS RNA或蛋白質(zhì)水平與適當(dāng)?shù)膶?duì)照物相比存在統(tǒng)計(jì)顯著降低，那么本發(fā)明的抗KRAS DsiRNA被認(rèn)為具有“KRAS抑制活性”。實(shí)驗(yàn)值和所進(jìn)行的重復(fù)試驗(yàn)次數(shù)的分布將易于決定被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著(如通過本領(lǐng)域中已知的確定統(tǒng)計(jì)顯著性的標(biāo)準(zhǔn)方法所評(píng)估)的KRAS RNA或蛋白質(zhì)降低水平(以％或以絕對(duì)項(xiàng)表示)的參數(shù)。然而，在某些實(shí)施方案中，“ KRAS抑制活性”是根據(jù)體系、細(xì)胞、組織或生物體中KRAS水平降低的百分?jǐn)?shù)或絕對(duì)水平來定義。例如，在某些實(shí)施方案中，如果觀察到在本發(fā)明的DsiRNA存在下KRAS RNA相對(duì)于在適合對(duì)照物所觀察到的KRAS水平存在至少5%降低或至少10%降低，那么認(rèn)為本發(fā)明的DsiRNA具有KRAS抑制活性。(例如，在某些實(shí)施方案中，如果觀察到KRAS水平相對(duì)于對(duì)照物存在例如5%或10%降低，那么可認(rèn)為組織和/或受試者的體內(nèi)KRAS水平受本發(fā)明的DsiRNA試劑抑制。)在某些其它實(shí)施方案中，如果觀察到KRAS RNA水平相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照物降低至少15%、相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照物降低至少20%、相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照物降低至少25%、相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照物降低至少30%、相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照物降低至少35%、相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照物降低至少40%、相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照物降低至少45%、相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照物降低至少50%、相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照物降低至少55%、相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照物降低至少60%、相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照物降低至少65%、相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照物降低至少70%、相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照物降低至少75%、相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照物降低至少80%、相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照物降低至少85%、相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照物降低至少90%、相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照物降低至少95%、相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照物降低至少96%、相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照物降低至少97%、相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照物降低至少98%或相對(duì)于適當(dāng)?shù)膶?duì)照物降低至少99%，那么認(rèn)為本發(fā)明的DsiRNA具有KRAS抑制活性。在一些實(shí)施方案中，對(duì)于被認(rèn)為具有KRAS抑制活性的DsiRNA，KRAS的完全抑制是必需的。在某些模型(例如，細(xì)胞培養(yǎng)物)中，如果觀察到KRAS水平相對(duì)于合適的對(duì)照物降低至少50%，那么認(rèn)為DsiRNA具有KRAS抑制活性。在某些其它實(shí)施方案中，如果觀察到KRAS水平相對(duì)于合適的對(duì)照物降低至少80%，那么認(rèn)為DsiRNA具有KRAS抑制活性。
[0076]也可以隨時(shí)間(持續(xù)時(shí)間)以及隨濃度范圍(效カ)來評(píng)估KRAS抑制活性，同時(shí)評(píng)估具有KRAS抑制活性的DsiRNA的構(gòu)成，所述KRAS抑制活性根據(jù)施用濃度和施用后持續(xù)時(shí)間來調(diào)整。因此，在某些實(shí)施方案中，如果施用后在2小時(shí)、5小時(shí)、10小時(shí)、I天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或更長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間觀察到KRAS活性降低至少50%,那么認(rèn)為本發(fā)明的DsiRNA具有KRAS抑制活性。在其它實(shí)施方案中，如果在細(xì)胞環(huán)境中，在InM或更低、500pM或更低、200pM或更低、IOOpM或更低、50pM或更低、20pM或更低、IOpM或更低、5pM或更低、2pM或更低或者甚至IpM或更低的濃度下觀察到KRAS抑制活性(例如，在某些實(shí)施方案中，KRAS的至少50%抑制)，那么認(rèn)為本發(fā)明的DsiRNA是有效的KRAS抑制劑。
[0077]在某些實(shí)施方案中，在提到本發(fā)明的抗KRAS DsiRNA時(shí)使用了短語“實(shí)質(zhì)上由……組成”。在一些此類實(shí)施方案中，“實(shí)質(zhì)上由……組成”是指包含具有至少一定水平的KRAS抑制活性(例如，至少50%KRAS抑制活性)的本發(fā)明的DsiRNA，并且也包含一種或多種不顯著影響該DsiRNA的KRAS抑制活性的其它`組分和/或修飾的組合物。例如，在某些實(shí)施方案中，組合物“實(shí)質(zhì)上由本發(fā)明的DsiRNA組成”，其中該組合物中本發(fā)明DsiRNA的修飾和/或DsiRNA相關(guān)組分不會(huì)使KRAS抑制活性(任選地包括KRAS抑制活性的效カ或持續(xù)時(shí)間)相對(duì)于分離的本發(fā)明DsiRNA改變超過3%、超過5%、超過10%、超過15%、超過20%、超過25%、超過30%、超過35%、超過40%、超過45%或超過50%。在某些實(shí)施方案中，即使在其它組分或修飾存在下KRAS抑制活性發(fā)生較顯著的降低(例如，功效、持續(xù)時(shí)間和/或效カ降低80%、降低90%等)，而其中在其它組分或修飾存在下KRAS抑制活性未顯著升高(例如，觀察到的KRAS抑制活性水平小于所觀察的本發(fā)明分離的DsiRNA的抑制活性水平的10%)，那么認(rèn)為組合物實(shí)質(zhì)上由本發(fā)明的DsiRNA組成。
[0078]本文中使用的的術(shù)語“核酸”是指呈單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或經(jīng)過修飾的核苷酸和其聚合物。該術(shù)語涵蓋含有已知核苷酸類似物或經(jīng)過修飾的骨架殘基或鍵聯(lián)的核酸，這些核酸是合成的、天然的且非天然的，具有與參考核酸類似的結(jié)合性質(zhì)，而且按照與參考核苷酸類似的方式代謝。這些類似物的實(shí)例包括但不限干，硫代磷酸酷、氨基磷酸酷、甲基磷酸酯、手性甲基磷酸酷、2-0-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。[0079]如本領(lǐng)域中公認(rèn)的，本文中使用的“核苷酸”用于包括本領(lǐng)域眾所周知的天然堿基(標(biāo)準(zhǔn))和經(jīng)過修飾的堿基的核苷酸。這些堿基一般位于核苷酸糖部分的I’位。核苷酸一般包含堿基、糖和磷酸基。核苷酸的糖、磷酸和/或堿基部分可以是未修飾的或經(jīng)過修飾的，(也可互換稱為核苷酸類似物、經(jīng)過修飾的核苷酸、非天然核苷酸、非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸等；參見例如 Usman 和 McSwiggen,同上文；Eckstein 等，國際 PCT 公開 N0.W092/07065 ； Usman等，國際PCT公開N0.W093/15187 ;Uhlman和Peyman,同上文，全部在此以引用的方式并入本文)。本領(lǐng)域中已知若干經(jīng)過修飾的核酸堿基的實(shí)例，如Limbach等，Nucleic AcidsRes.22:2183, 1994中所概述。可以引入核酸分子中的堿基修飾的ー些非限制性實(shí)例包括次黃嘌呤、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2，4，6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氫尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如，核糖胸腺嘧啶)、5_鹵代尿苷(例如，5-溴尿苷)或者6-氮雜嘧啶或6-烷基嘧啶(例如，6-甲基尿苷)、丙塊等(Burgin,等，Biochemistry35:14090，1996 ; Uh Iman 和 Peyman,同上文)。在這一方面中，“經(jīng)過修飾的堿基”是指在I’位除腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶外的核苷酸堿基或其等效物。
[0080]本文中使用的“經(jīng)過修飾的核苷酸”是指在核苷、核堿基、戊糖環(huán)或磷酸基中具有一種或多種修飾的核苷酸。例如，經(jīng)過修飾的核苷酸不包括含有單磷酸腺苷、單磷酸鳥苷、單磷酸尿苷和單磷酸胞苷的核糖核苷酸，以及含有單磷酸脫氧腺苷、單磷酸脫氧鳥苷、單磷酸脫氧胸苷和單磷酸脫氧胞苷的脫氧核糖核苷酸。修飾包括由修飾核苷酸的酶(例如甲基轉(zhuǎn)移酶)修飾產(chǎn)生的天然修飾。經(jīng)過修飾的核苷酸還包括合成或非天然的核苷酸。核苷酸中合成或非天然修飾包括具有2’修飾(例如2’ -甲氧基こ氧基、2’ -氟、2’ -烯丙基、2’ _0-[2_ (甲基氛基)_2_ 氧代乙基]、4’ -硫代、4’ -CH2-0_2’ _ 橋、4’ - (CH2) 2-0_2’ _ 橋、2’-LNA和2’-0-(N-甲基氨基甲酸酷))的修飾或包含堿基類似物的修飾。與本公開所述的2’ -修飾的核苷酸相關(guān)，“氨基”是指2’ -NH2或2’ -O-NH2,其可以是經(jīng)過修飾的或未修飾的。這些經(jīng)過修飾的基團(tuán)描述于例如Eckstein等，美國專利N0.5，672，695，以及Matulic-Adamic 等,美國專利 N0.6, 248, 878 中。
[0081]關(guān)于本公開的核酸分`子，修飾可根據(jù)這些試劑的模式而存在于雙鏈核糖核酸(dsRNA)的一條或兩條鏈上。本文中使用的“交替位置”是指每隔ー個(gè)核苷酸是經(jīng)過修飾的核苷酸或在指定長(zhǎng)度的鏈dsRNA上每ー經(jīng)過修飾的核苷酸之間有ー個(gè)未修飾的核苷酸(例如，未修飾的核糖核苷酸)的模式(例如，5’ -MNMNMN-3' ;3’ -MNMNMN-5';其中M是經(jīng)過修飾的核苷酸，且N是未修飾的核苷酸)。根據(jù)位置編號(hào)的慣例，修飾模式是從5’或3’末端的第一核苷酸位置開始，例如，如本文所述(在某些實(shí)施方案中，I位是在本發(fā)明DsiRNA試劑的預(yù)計(jì)Dicer裂解事件之后根據(jù)鏈的末端殘基而指定；因此，I位并不總是構(gòu)成加工前本發(fā)明試劑的3’末端或5’末端殘基)。在交替位置處經(jīng)過修飾的核苷酸的模式可出現(xiàn)在整個(gè)鏈長(zhǎng)度上，但在某些實(shí)施方案中分別包括含有至少2、3、4、5、6或7個(gè)經(jīng)過修飾的核苷酸的至少4、6、8、10、12、14個(gè)核苷酸。本文中使用的“交替位置對(duì)”是指在指定長(zhǎng)度的鏈dsRNA上兩個(gè)連續(xù)的經(jīng)過修飾的核苷酸由兩個(gè)連續(xù)的未修飾的核苷酸分隔開的模式(例如，5’-MMNNMMNNMMNN-3’ ；3' -MMNNMMNNMMNN-5';其中M是經(jīng)過修飾的核苷酸且N是未修飾的核苷酸)。根據(jù)位置編號(hào)的慣例，修飾模式是從5’或3’末端的第一核苷酸位置開始，例如本文所述者。在交替位置處經(jīng)過修飾的核苷酸的模式可出現(xiàn)在整個(gè)鏈長(zhǎng)度上，但在某些實(shí)施方案中分別優(yōu)選地包括含有至少4、6、8、10、12或14個(gè)經(jīng)過修飾的核苷酸的至少8、12、16、20、24、28個(gè)核苷酸。應(yīng)強(qiáng)調(diào)的是，上述修飾模式是示例性的，且不g在限制本發(fā)明的范圍。
[0082]本文中使用的“堿基類似物”是指位于可并入核酸雙鏈體中的經(jīng)過修飾的核苷酸中核苷酸糖部分的I’位(或可并入核酸雙鏈體中的核苷酸糖部分取代物的等效位置)的雜環(huán)部分。在本發(fā)明dsRNA中，堿基類似物一般為嘌呤或嘧啶堿基，不包括常見堿基:鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶⑴和尿嘧啶(U)。堿基類似物可與dsRNA中的其它堿基或堿基類似物形成雙鏈體。堿基類似物包括可用于本發(fā)明化合物和方法中的堿基類似物，例如，Benner的美國專利N0.5，432，272和N0.6，001，983以及Manoharan的美國專利公開N0.20080213891中所公開的那些，這些專利以引用的方式并入本文。堿基的非限制性實(shí)例包括次黃嘌呤(I)、黃嘌呤(X)、3 P-D-呋喃核糖基-(2，6-二氨基嘧啶)(K)、3-P-D-呋喃核糖基-(1-甲基-吡唑并[4，3-d]嘧啶-5，7(4H，6H)_ 二酮)(P)、異胞嘧啶(iS0-C)、異鳥嘌呤(iS0-G)、1- P -D-呋喃核糖基-(5-硝基吲哚)、1-^-D-呋喃核糖基-(3-硝基吡咯)、5_溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤、4-硫代-dT、7-(2-噻吩基)-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)和吡咯-2-甲醛(Pa)、2-氨基-6- (2-噻吩基)嘌呤(S)、2_氧代吡啶(Y)、二氟甲苯基、4-氟-6-甲基苯并咪唑、4-甲基苯并咪唑、3-甲基羥基異喹啉基、5-甲基羥基異喹啉基和3-甲基-7-丙炔基羥基異喹啉基、7-氮雜吲哚基、6-甲基-7-氮雜吲哚基、咪唑并吡啶基、9-甲基-咪唑并吡啶基、吡咯并吡嗪基、羥基異喹啉基、7-丙炔基羥基異喹啉基、丙炔基-7-氮雜吲哚基、2，4，5-三甲基苯基、4-甲基吲哚基、4，6-二甲基吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基、芪基(stilbenzyl)、并四苯基、并五苯基和其結(jié)構(gòu)衍生物(Schweitzer等，J.0rg.Chem.，59:7238-7242(1994)；Berger 等，Nucleic Acids Research, 28(15):2911-2914(2000) ； Moran 等，J.Am.Chem.Soc.,119:2056-2057(1997) !Morales 等,J.Am.Chem.S oc.,121:2323-2324 (1999)；Guckian 等，J.Am.Chem.Soc.，118: 8182-8183 (1996) ；Morales 等，J.Am.Chem.Soc.,122 (6):1001-1007 (2000) ；McMinn 等，J.Am.Chem.Soc .，121:11585-11586(1999)；Guckian 等，J.0rg.Chem.，63: 9652-9656 (1998) ；Moran 等，Proc.Nat I ? Acad.Sc1.,94:10506-10511(1997) ；Das 等,J.Chem.Soc., Perkin Trans., 1:197-206(2002)；Shibata 等，J.Chem.Soc.，Perkin Trans., 1:1605-1611 (2001) ；ffu 等，J.Am.Chem.Soc., 122 (32):7621-7632 (2000) ;0，Neill 等,J.0rg.Chem., 67: 5869-5875 (2002)；Chaudhuri 等，J.Am.Chem.Soc.，117:10434-10442 (1995);和美國專利 N0.6，218，108.)。堿基類似物還可以是通用堿基。
[0083]本文中使用的“通用堿基”是指位于經(jīng)過修飾的核苷酸中核苷酸糖部分的I’位或核苷酸糖部分取代物中等效位置的雜環(huán)部分，該雜環(huán)部分當(dāng)存在于核酸雙鏈體中吋，可與ー種以上堿基相對(duì)定位，同時(shí)不改變雙螺旋結(jié)構(gòu)(例如，磷酸骨架的結(jié)構(gòu))。此外，通用堿基不會(huì)破壞其所駐留的單鏈核酸與靶核酸形成雙鏈體的能力。含有通用堿基的單鏈核酸與靶核酸形成雙鏈體的能力可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的方法測(cè)定(例如，UV吸光度、圓二色性、凝膠遷移法、單鏈核酸酶敏感性等)。另外，可以改變能觀察到雙鏈體形成的條件，以確定雙鏈體穩(wěn)定性或形成，例如，溫度，如解鏈溫度(Tm)，與核酸雙鏈體穩(wěn)定性相關(guān)。相較于與靶核酸精確互補(bǔ)的參考單鏈核酸，含有通用堿基的單鏈核酸與靶核酸形成的雙鏈體的Tm低干與互補(bǔ)核酸形成的雙鏈體。然而，與其中通用堿基被堿基置換而產(chǎn)生單ー錯(cuò)配的參考單鏈核酸相比較，含有通用堿基的單鏈核酸與靶核酸形成的雙鏈體的Tm高于用具有錯(cuò)配堿基的核酸形成的雙鏈體。
[0084]ー些通用堿基能夠通過在通用堿基與所有堿基鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)在堿基配對(duì)條件下形成氫鍵，來實(shí)現(xiàn)堿基配對(duì)。通用堿基不是只與単一互補(bǔ)堿基形成堿基對(duì)的堿基。在雙鏈體中，通用堿基可與雙鏈體相對(duì)鏈上與之相対的G、C、A、T和U中每ー者不形成氫鍵、形成一個(gè)氫鍵或形成ー個(gè)以上氫鍵。優(yōu)選地，通用堿基不與雙鏈體相對(duì)鏈上與之相對(duì)的堿基相互作用。在雙鏈體中，與通用堿基之間發(fā)生的堿基配對(duì)不會(huì)改變磷酸骨架的雙螺旋結(jié)構(gòu)。通用堿基也可以借助堆疊相互作用與相同核酸鏈上的相鄰核苷酸中的堿基相互作用。這種堆疊相互作用可使雙鏈體穩(wěn)定，尤其是在通用堿基不與雙鏈體相對(duì)鏈上與之相對(duì)定位的堿基形成任何氫鍵的情形中。通用結(jié)合核苷酸的非限制性實(shí)例包括肌苷、1-0 -D-呋喃核糖基-5-硝基吲哚和/或1-0 -D-呋喃核糖基_3_硝基吡咯(Quay等的美國專利申請(qǐng)公開N0.20070254362 ；Van Aerschot等，Anacyclic5_nitroindazole nucleoside analogue as ambiguous nucleoside.NucleicAcids Res.1995年 11 月;23 (21):4363-70 ;Loakes等，3-Nitropyrrole and5-nitroindoIeas universal bases in primers for DNA sequencing and PCR.Nucleic Acids Res.1995年 7 月 11 日；23(13):2361-6 ;Loakes 和 Brown, 5-Nitroindole as an universal baseanalogue.Nucleic Acids Res.1994 年 10 月 11 日；22(20):4039-43)。
[0085]本文中使用的“環(huán)”是指由核酸的單ー鏈形成的結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中，側(cè)接特定單鏈核苷酸區(qū)的互補(bǔ)區(qū)按使互補(bǔ)區(qū)之間的單鏈核苷酸區(qū)被排除在雙鏈體形成或Watson-Crick堿基配對(duì)外的方式雜交。環(huán)是任何長(zhǎng)度的單鏈核苷酸區(qū)。環(huán)的實(shí)例包括例如發(fā)夾(hairpin)、莖環(huán)或延伸環(huán)等結(jié)構(gòu)中存在的未配對(duì)核苷酸。
[0086]在有關(guān)dsRNA的上下文中，本文中使用的“延伸環(huán)”是指單鏈環(huán)以及側(cè)接該環(huán)的另外1、2、3、4、5、6或多達(dá)20個(gè)堿基對(duì)或雙鏈體。在延伸環(huán)中，在5’側(cè)側(cè)接該環(huán)的核苷酸與在3’側(cè)側(cè)接該環(huán)的核苷酸形成雙鏈體。延伸環(huán)可形成發(fā)夾或莖環(huán)。
[0087]在有關(guān)dsRNA的上下文中，本文中使用的“四核苷酸環(huán)”是指由四個(gè)核苷酸組成的環(huán)(單鏈區(qū))，該環(huán)形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于使相鄰Watson-Crick雜交的核苷酸穩(wěn)定。在不受理論限制的情況下，四核苷酸環(huán)可通過堆疊相互作用使相鄰Watson-Crick堿基對(duì)穩(wěn)定。此外，四核苷酸環(huán)中四個(gè)核苷酸間的相互作用包括但不限于，非Watson-Crick堿基配對(duì)、堆疊相互作用、氫鍵和接觸相互作用(Cheong等，Nature 1990年8月16日;346(6285):680-2 ;Heus 和 Pardi, Sciencel991 年 7 月 12 日；253 (5016):191-4)。四核苷酸環(huán)使相鄰雙鏈體的解鏈溫度(Tm)升高，其高于所預(yù)期的由四個(gè)隨機(jī)堿基組成的簡(jiǎn)易模型環(huán)序列的Tm。例如，在IOmM NaHPO4中，四核苷酸環(huán)可使包含長(zhǎng)度為至少2個(gè)堿基對(duì)的雙鏈體的發(fā)夾的解鏈溫度為至少55°C。四核苷酸環(huán)可以含有核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、經(jīng)過修飾的核苷酸和其組合。RNA四核苷酸環(huán)的實(shí)例包括UNCG家族四核苷酸環(huán)(例如，UUCG)、GNRA家族四核苷酸環(huán)(例如，GAAA)和CUUG四核苷酸環(huán)。(Woese等，Proc NatlAcad Sci U S A.1990 年 11 月；87 (21): 8467-71 ;Antao 等，Nucleic Acids Res.1991 年11月11日；19 (21):5901-5)。DNA四核苷酸環(huán)的實(shí)例包括d (GNNA)家族四核苷酸環(huán)(例tU, d (GTTA) ),d (GNRA)家族四核苷酸環(huán)、d (GNAB)家族四核苷酸環(huán)、d (CNNG)家族四核苷酸環(huán)、d(TNCG)家族四核苷酸環(huán)(例如，d(TTCG))。(Nakano 等,Biochemistry, 41 (48)，14281-14292，2002.；SHINJI 等，Nippon Kagakkai Koen Yokoshu 第 78 卷；第 2 期；第 731 頁(2000)。)
[0088]本文中使用的術(shù)語“ siRNA”是指其中每條鏈都包含RNA、RNA類似物或RNA和DNA的雙鏈核酸。siRNA包含介于19個(gè)與23個(gè)之間核苷酸，或包含21核苷酸。siRNA通常在每條鏈的3’端具有2bp突出，以致siRNA中的雙鏈體區(qū)包含17-21個(gè)核苷酸或19個(gè)核苷酸。通常，siRNA的反義鏈與KRAS基因/RNA的靶序列充分互補(bǔ)。
[0089]本發(fā)明的抗KRAS DsiRNA的鏈長(zhǎng)度為至少25個(gè)核苷酸。因此，抗KRASDsiRNA含有ー個(gè)寡核苷酸序列，即第一序列，其長(zhǎng)度為至少25個(gè)核苷酸且不超過35個(gè)或多至50個(gè)核苷酸。這ー RNA序列的長(zhǎng)度可介于26與35個(gè)、26與34個(gè)、26與33個(gè)、26與32個(gè)、26與31個(gè)、26與30個(gè)以及26與29個(gè)核苷酸之間。這ー序列的長(zhǎng)度可以是27或28個(gè)核苷酸或27個(gè)核苷酸。DsiRNA試劑的第二序列可以是在生物條件下(例如在真核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi))與第一序列退火的序列。一般說來，第二寡核苷酸序列中至少有19個(gè)堿基對(duì)與第一寡核苷酸序列互補(bǔ)，更通常第二寡核苷酸序列中有21或更多個(gè)堿基對(duì)或者25或更多個(gè)堿基對(duì)與第一寡核苷酸序列互補(bǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二序列的長(zhǎng)度與第一序列相同，且DsiRNA試劑為平端。在另ー實(shí)施方案中，DsiRNA試劑末端具有ー個(gè)或多個(gè)突出。
[0090]在某些實(shí)施方案中，DsiRNA試劑的第一和第二寡核苷酸序列存在于單獨(dú)的寡核苷酸鏈上，這些寡核苷酸鏈可以是且通常是化學(xué)合成的。在一些實(shí)施方案中，兩條鏈的長(zhǎng)度在26與35個(gè)核苷酸之間。在其它實(shí)施方案中，兩條鏈的長(zhǎng)度在25與30個(gè)或26與30個(gè)核苷酸之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩條鏈的長(zhǎng)度為27個(gè)核苷酸，完全互補(bǔ)并且具有平端。在本發(fā)明某些實(shí)施方案中，抗KRAS DsiRNA的第一和第二序列存在于單獨(dú)RNA寡核苷酸(鏈)上。在一個(gè)實(shí)施方案中，一條或兩條寡核苷酸鏈能夠用作Dicer的底物。在其它實(shí)施方案中，存在至少ー種修飾，用以促進(jìn)Dicer按照使雙鏈RNA結(jié)構(gòu)抑制基因表達(dá)的功效最大的定向結(jié)合于雙鏈RNA結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明某些實(shí)施方案中，抗KRAS DsiRNA試劑包含長(zhǎng)度不同的兩條寡核苷酸鏈，其中抗KRAS DsiRNA在`第一條鏈(有義鏈)的3’末端具有平端且在第二條鏈(反義鏈)的3’末端具有3’突出。DsiRNA也可含有一個(gè)或多個(gè)脫氧核糖核酸(DNA)喊基取代。
[0091 ] 含有兩個(gè)單獨(dú)寡核苷酸的適合DsiRNA組合物可通過化學(xué)連接基團(tuán)以化學(xué)方式在其退火區(qū)外部連接。本領(lǐng)域中已知并可使用許多適合的化學(xué)連接基團(tuán)。適合的基團(tuán)不會(huì)阻斷Dicer對(duì)DsiRNA的活性，并且不會(huì)干擾由靶基因轉(zhuǎn)錄的RNA的定向破壞。或者，兩個(gè)單獨(dú)寡核苷酸可以通過第三寡核苷酸連接，以致在構(gòu)成DsiRNA組合物的兩個(gè)寡核苷酸退火后產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)不會(huì)阻斷Dicer對(duì)DsiRNA的活性，并且不會(huì)干擾靶RNA的定向破壞。
[0092]本文中使用的具有與靶RNA或cDNA序列(例如，KRAS mRNA)“充分互ネト”的序列的dsRNA(例如，DsiRNA或siRNA)是指dsRNA具有的序列足以觸發(fā)由RNAi機(jī)構(gòu)(例如，RISC復(fù)合物)或過程引起的靶RNA破壞(在敘述cDNA序列情況下，RNA序列對(duì)應(yīng)于所述的cDNA序列)?？蓪sRNA分子設(shè)計(jì)成使反義鏈的每ー殘基都與靶分子中的殘基互補(bǔ)?；蛘?，可在該分子內(nèi)進(jìn)行取代，以增加所述分子的穩(wěn)定性和/或增強(qiáng)其加工活性。取代可以在鏈內(nèi)進(jìn)行，或者可以對(duì)鏈末端的殘基進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，取代和/或修飾是在DsiRNA試劑內(nèi)的特定殘基處進(jìn)行。所述取代和/或修飾可以包括例如，當(dāng)從DsiRNA試劑有義鏈的3’末端位置開始編號(hào)時(shí)，在1、2和3位的ー個(gè)或多個(gè)殘基處的脫氧修飾；以及在DsiRNA試劑反義鏈的3’末端殘基處引入2’ -O-烷基(例如，2’ -0-甲基)修飾，其中這樣的修飾也在反義鏈3’部分的突出位置進(jìn)行和在DsiRNA試劑的加工形成活性siRNA試劑的區(qū)域內(nèi)包括的DsiRNA反義鏈替代殘基處進(jìn)行。前述修飾都是作為示例提供，并且不g在以任何方式進(jìn)行限制。有關(guān)優(yōu)選DsiRNA試劑結(jié)構(gòu)的其它考慮，包括可對(duì)本發(fā)明抗KRAS DsiRNA試劑進(jìn)行的修飾和取代的其它說明，可見于下文中。
[0093]短語“雙鏈體區(qū)”是指兩個(gè)互補(bǔ)或基本上互補(bǔ)的寡核苷酸中的區(qū)域，所述兩個(gè)互補(bǔ)或基本上互補(bǔ)的寡核苷酸通過Watson-Crick堿基配對(duì)或使互補(bǔ)或基本上互補(bǔ)的寡核苷酸鏈之間形成雙鏈體的其它方式相互間形成堿基對(duì)。例如，具有21個(gè)核苷酸単位的寡核苷酸鏈可與另一具有21個(gè)核苷酸単位的寡核苷酸堿基配對(duì)，而每條鏈上只有19個(gè)堿基互補(bǔ)或基本上互補(bǔ)，以致“雙鏈體區(qū)”由19個(gè)堿基對(duì)組成。其余堿基對(duì)可例如作為5’和3’突出存在。此外，在雙鏈體區(qū)內(nèi)，不需要100%互補(bǔ)；在雙鏈體區(qū)內(nèi)允許出現(xiàn)基本上互補(bǔ)?；旧匣パa(bǔ)是指各鏈之間的互補(bǔ)性使其能夠在生物條件下退火。本領(lǐng)域眾所周知憑經(jīng)驗(yàn)確定兩條鏈?zhǔn)欠衲軌蛟谏飾l件下退火的技木?；蛘撸梢院铣蓛蓷l鏈，并在生物條件下加在一起，以確定其是否相互退火。
[0094]單鏈核酸在多個(gè)堿基內(nèi)堿基配對(duì)稱為“雜交”。雜交通常在生理或生物相關(guān)條件(例如，分子內(nèi):pH7.2,140mM鉀離子；細(xì)胞外:pH7.4,145mM鈉離子)下確定。雜交條件一般含有單價(jià)陽離子和生物學(xué)上可接受的緩沖液，并且可以含有或可不含有二價(jià)陽離子、復(fù)合陰離子(例如葡糖酸鉀中的葡糖酸根)、不帶電荷物質(zhì)(例如蔗糖)和用以降低樣品中水的活性的惰性聚合物(例如PEG)。這樣的條件包括可形成堿基對(duì)的條件。
[0095]雜交是通過解離形 成雙鏈體的單鏈核酸所需的溫度(即，解鏈溫度；Tm)而度量。雜交條件也是可以形成堿基對(duì)的條件。可以使用各種嚴(yán)格度條件來測(cè)定雜交(參見例如，Wahl, G.M.和 S.L.Berger (1987) Methods Enzymol.152:399 ； Kimmel, A.R.(1987) MethodsEnzymo1.152:507)。嚴(yán)格的溫度條件將通常包括至少約30°C，更優(yōu)選至少約37°C且最優(yōu)選至少約42°C的溫度。預(yù)期長(zhǎng)度小于50個(gè)堿基對(duì)的雜交物的雜交溫度應(yīng)比該雜交物的解鏈溫度(Tm)低5-10°C，其中Tm是根據(jù)以下等式確定。對(duì)于長(zhǎng)度小于18個(gè)堿基對(duì)的雜交物，Tm(°C ) =2 (A+T堿基的數(shù)量)+4 (G+C堿基的數(shù)量)。對(duì)于長(zhǎng)度介于18與49個(gè)堿基對(duì)之間的雜交物，Tm(°C ) =81.5+16.6 (1glO[Na+]) +0.41 (%G+C)-(600/N)，其中 N 是雜交物中堿基的數(shù)目，且[Na+]是雜交緩沖液中鈉離子的濃度(對(duì)于1XSSC，[Na+]=0.165M)。例如，雜交測(cè)定緩沖液示出在表1中。
[0096]表1.[0097]
【權(quán)利要求】
1.一種分離的雙鏈核糖核酸(dsNA)，其包含第一和第二核酸鏈以及具有至少25個(gè)堿基對(duì)的雙鏈體區(qū)，其中當(dāng)將所述雙鏈核酸引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中時(shí)，所述第二寡核苷酸鏈沿所述第二寡核苷酸鏈長(zhǎng)度的至少19個(gè)核苷酸與SEQ ID NO: 164或SEQ ID N0:4938序列充分互補(bǔ)，以降低KRAS靶基因表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsNA，其中從所述第一寡核苷酸鏈3’末端的第一個(gè)核苷酸(I位)開始，用經(jīng)過修飾的核苷酸取代I位、2位和/或3位。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsNA，其中所述第一條鏈的所述3’末端和所述第二條鏈的所述5’末端形成平端。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsNA，其中所述第一條鏈的長(zhǎng)度是25個(gè)核苷酸且所述第二條鏈的長(zhǎng)度是27個(gè)核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsNA，其中所述第二條鏈包含選自由SEQID NO: 29和SEQ ID NO:4452組成的組的序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsNA，其中所述第一條鏈包含選自由SEQID NO: 108和SEQ ID NO:4695組成的組的序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsNA，其中所述第一條鏈包含SEQID NO: 108并且第二條鏈的序列包含SEQ ID N0:29o
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsNA，其中所述第一條鏈包含SEQID NO:4695并且第二條鏈的序列包含SEQ ID NO:4452o
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的dsNA，其中所述第一條鏈的所述3’末端的所述經(jīng)過修飾的核苷酸殘基選自由脫氧核糖核苷酸、無`環(huán)核苷酸和熒光分子組成的組。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的dsNA,其中在第一寡核苷酸鏈3’末端的I位和2位是脫氧核苷酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsNA，其中所述dsNA的第二鏈在其3’末端包含在1-5個(gè)單鏈核苷酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的分離的dsNA，其所述的第二鏈的3’末端包含在1-2個(gè)單鏈核苷酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的分離的dsNA，其中所述的第二鏈的3’末端包含的1-5個(gè)單鏈核苷酸的核苷酸包含經(jīng)過修飾的核苷酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的dsNA，其中所述修飾的核苷酸殘基選自由以下組成的組:2’ -O-甲基，2’ -甲氧こ氧基，，2’ -氟，2’ -烯丙基，2’ -0-[2-(甲氨基)-2_氧代こ基]，4’ -硫代，4’ -CH2-0_2’ _ 橋，4’ - (CH2) 2-0-2’ -橋，2’ -LNA, 2’ -氛基和 2’ -0- (N-甲基氨基甲酸酷)。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的分離的dsNA，其包含在所述的第二鏈的3’末端的兩個(gè)單鏈核苷酸，其中所述的兩個(gè)單鏈核苷酸含有2’ -0-甲基修飾的核糖核苷酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的雙鏈核酸，其中當(dāng)將所述雙鏈核酸引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中時(shí)，所述第二寡核苷酸鏈沿所述第二寡核苷酸鏈長(zhǎng)度的至少19個(gè)核苷酸與SEQ IDNOs:6866序列充分互補(bǔ)，以降低KRAS靶基因表達(dá)。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的雙鏈核酸，其中所述第二寡核苷酸鏈含有與SEQIDNOs:6866序列充分互補(bǔ)的序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的雙鏈核酸，其中所述當(dāng)將所述雙鏈核酸引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中時(shí)，所述第二寡核苷酸鏈沿所述第二寡核苷酸鏈長(zhǎng)度的至少19個(gè)核苷酸與SEQ IDNOs:8340充分互補(bǔ)，以降低KRAS靶基因表達(dá)。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的雙鏈核酸，其中所述第二寡核苷酸鏈含有與SEQIDNOs:8340充分互補(bǔ)的序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsNA，其中從所述第二鏈的與所述第一寡核苷酸鏈5’末端核苷酸殘基互補(bǔ)的核苷酸殘基開始，所述第二寡核苷酸鏈包含交替的經(jīng)過修飾和未修飾的核苷酸殘基。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsNA，其中所述第二寡核苷酸鏈包含與SEQIDNO: 164錯(cuò)配形成的核苷酸殘基。
22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsNA，其中所述第二寡核苷酸鏈包含與SEQIDNO:4938錯(cuò)配形成的核苷酸殘基。
23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsNA，其中所述dsNA在所述細(xì)胞中由Dicer內(nèi)源性裂解。
24.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsNA，其中在所述細(xì)胞的環(huán)境中，足以降低所述靶基因表達(dá)的所述分離的雙鏈核酸的量選自由以下組成的組:1納摩爾或更低、200皮摩爾或更低、100皮摩爾或更低、50皮摩爾或更低、20皮摩爾或更低、10皮摩爾或更低、5皮摩爾或更低、2皮摩爾或更低以及I皮摩爾或更低。
25.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsNA，其中當(dāng)在體外于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中測(cè)定時(shí)，在所述細(xì)胞環(huán)境中有效濃度為選自由I納摩爾或更低、200皮摩爾或更低、100皮摩爾或更低、50皮摩爾或更低、20皮摩爾`或更低、10皮摩爾或更低、5皮摩爾或更低、2皮摩爾或更低以及I皮摩爾或更低組成的組時(shí)，所述分離的dsNA在降低靶KRAS基因表達(dá)方面比針對(duì)SEQ IDNO: 164或SEQ ID NO:4938的同樣至少19個(gè)核苷酸的分離的21mer siRNA具有更強(qiáng)的效力。
26.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsNA，其中當(dāng)將所述雙鏈核酸引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中時(shí)，所述分離的dsNA與SEQ ID NO: 164或SEQ ID NO:4938序列充分互補(bǔ)，以使KRAS靶基因表達(dá)降低選自由以下組成的組的量(以％表示):至少10%、至少50%、至少80-90%、至少95%、至少98%以及至少99%。
27.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsNA，其中所述第一條鏈與第二條鏈通過化學(xué)連接子連結(jié)。
28.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的雙鏈核酸，其包含選自由以下組成的組的經(jīng)過修飾的核苷酸:脫氧核糖核苷酸、雙脫氧核糖核苷酸、無環(huán)核苷酸、3’ -脫氧腺苷(蟲草素)、3’-疊氮基-3’-脫氧胸苷(AZT)、2’，3’-雙脫氧肌苷(ddl)、2’，3’_雙脫氧_3’-硫代胞苷(3TC)、2’，3’ -雙脫氫-2’，3’ -雙脫氧胸苷(d4T)、3’ -疊氮基-3’ -脫氧胸苷(AZT)的單磷酸核苷酸、2’，3’ -雙脫氧-3’ -硫代胞苷(3TC)和2’，3’ -雙脫氫-2’，3’ -雙脫氧胸苷(d4T)的單磷酸核苷酸、4-硫代尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5- (3-氨基烯丙基)-尿嘧啶、2’ -0-烷基核糖核苷酸、2’ -0-甲基核糖核苷酸、2’ -氨基核糖核苷酸、2’ -氟核糖核苷酸和鎖核酸。
29.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的雙鏈核酸，其包含選自由磷酸酷、硫代磷酸酯和磷酸三酯組成的組的磷酸骨架修飾。
30.ー種具有KRAS抑制活性的組合物，其實(shí)質(zhì)上由分離的雙鏈核糖核酸(dsNA)組成，所述分離的dsNA包含第一和第二核酸鏈以及具有至少25個(gè)堿基對(duì)的雙鏈體區(qū)，其中當(dāng)將所述雙鏈核酸引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中時(shí)，所述第二寡核苷酸鏈沿所述第二寡核苷酸鏈長(zhǎng)度的至少19個(gè)核苷酸與SEQ ID NO: 164或SEQ ID NO:4938序列充分互補(bǔ)，以降低KRAS靶基因表達(dá)。
31.一種分離的雙鏈核糖核酸(dsNA)，其包含第一和第二核酸鏈，其中每個(gè)第一和第二核酸鏈含有RNA，其中所述的第二寡核苷酸鏈?zhǔn)情L(zhǎng)度19到35個(gè)核苷酸并且含有與SEQ IDNO:6866充分互補(bǔ)的序列，并 且當(dāng)將所述雙鏈核酸引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中時(shí)，其中所述的雙鏈核糖核酸降低KRAS靶基因表達(dá)。
32.—種分離的雙鏈核糖核酸(dsNA)，其包含第一和第二核酸鏈，其中每個(gè)第一和第二核酸鏈含有RNA，其中所述的第二寡核苷酸鏈?zhǔn)情L(zhǎng)度19到35個(gè)核苷酸并且含有與SEQ IDNO:8340充分互補(bǔ)的序列，并且當(dāng)將所述雙鏈核酸引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中時(shí)，其中所述的雙鏈核糖核酸降低KRAS靶基因表達(dá)。
33.一種用于降低哺乳動(dòng)物細(xì)胞中靶KRAS基因表達(dá)的方法，所述方法包括使哺乳動(dòng)物細(xì)胞在體外與足以降低所述細(xì)胞中靶KRAS基因表達(dá)的量的根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsNA接觸。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中靶KRAS基因表達(dá)降低選自由至少10%、至少50%和至少80-90%組成的組的量(以％表示)。
35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中在所述細(xì)胞與所述dsNA接觸后至少8天，KRASmRNA水平降低的量(以％表示)為至少90%。
36.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中在所述細(xì)胞與所述dsNA接觸后至少10天，KRASmRNA水平降低的量(以％表示)為至少70%。
37.一種用于降低哺乳動(dòng)物中靶KRAS基因表達(dá)的方法，所述方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用足以降低所述哺乳動(dòng)物中靶KRAS基因表達(dá)的量的根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsNA。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述分離的dsNA以選自由以下組成的組的劑量施用:每天每公斤所述哺乳動(dòng)物I微克至5毫克、每公斤100微克至0.5毫克、每公斤0.001至0.25毫克、每公斤0.01至20微克、每公斤0.01至10微克、每公斤0.10至5微克和每公斤0.1至2.5微克。
39.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中當(dāng)在體外于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中測(cè)定時(shí)，在細(xì)胞環(huán)境中有效濃度為I納摩爾或更低時(shí)，所述分離的dsNA在降低靶KRAS基因表達(dá)方面比針對(duì)SEQ ID NO: 164或SEQ ID NO:4938的同樣至少19個(gè)核苷酸的分離的21mer siRNA具有更強(qiáng)的效力。
40.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述施用步驟包括選自由以下組成的組的模式:靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、輸注、皮下注射、透皮遞送、氣霧劑遞送、直腸遞送、陰道遞送、局部遞送、ロ服遞送和吸入遞送。
41.一種用于選擇性抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，所述方法包括使細(xì)胞與足以抑制所述細(xì)胞生長(zhǎng)的量的根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsNA接觸。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述細(xì)胞是受試者的腫瘤細(xì)胞。
43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述細(xì)胞是體外腫瘤細(xì)胞。
44.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
45.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述細(xì)胞是胰腺癌細(xì)胞。
46.一種制劑，其包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsNA，其中當(dāng)在體外將所述dsNA引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中時(shí)，所述dsNA的存在量將靶KRAS RNA水平有效降低選自由至少10%、至少50%和至少80-90%組成的組的量(以％表示)，且其中當(dāng)在體外于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中測(cè)定時(shí)，在細(xì)胞環(huán)境中有效濃度為I納摩爾或更低時(shí)，所述dsNA在降低靶KRAS RNA水平方面比針對(duì)SEQ ID NO: 164或SEQ ID NO:4938的同樣至少19個(gè)核苷酸的分離的21mer siRNA具有更強(qiáng)的效力。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的制劑，其中在所述細(xì)胞的環(huán)境中，所述有效量選自由以下組成的組:1納摩爾或更低、200皮摩爾或更低、100皮摩爾或更低、50皮摩爾或更低、20皮摩爾或更低、10皮摩爾或更低、5皮摩爾或更低、2皮摩爾或更低和I皮摩爾或更低。
48.一種制劑，其包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsNA，其中當(dāng)將所述dsNA引入哺乳動(dòng)物受試者細(xì)胞中時(shí)，所述dsNA的存在量將靶KRAS RNA水平有效降低選自由至少10%、至少50%和至少80-90%組成的組的量(以％表示)，且其中當(dāng)在體外于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中測(cè)定時(shí)，在細(xì)胞環(huán)境中有效濃度為I納摩爾或更低時(shí)，所述dsNA在降低靶KRAS RNA水平方面比針對(duì)SEQ ID NO: 164或SEQ ID NO:4938的同樣至少19個(gè)核苷酸的分離的21mer siRNA具有更強(qiáng)的效力。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的制劑，其中所述有效量是選自由以下組成的組的劑量:每天每公斤所述受試者I微克至5毫克、每公斤100微克至0.5毫克、每公斤0.001至0.25毫克、每公斤0.01至20微克、每公斤0.01至10微克、每公斤0.10至5微克和每公斤0.1至2.5微克。
50.根據(jù)權(quán)利要求48所述的制劑，其中所述制劑包含脂類。`
51.ー種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其含有根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsNA。
52.ー種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsNA和藥學(xué)上可接受的載體。
53.ー種試劑盒，其包括根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsNA和其使用說明。
54.根據(jù)權(quán)利要求30所述的組合物，其中所述的分離的dsNA的第二鏈的3’末端含有1-5個(gè)單鏈核苷酸。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK103555722SQ201310485274
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2010年4月5日 優(yōu)先權(quán)日:2009年4月3日
【發(fā)明者】B·D·布朗 申請(qǐng)人:戴瑟納制藥公司