一種krt8基因外顯子區(qū)域中snp位點及其確定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種KRT8基因外顯子區(qū)域中SNP位點及其確定方法，是KRT8基因第8外顯子區(qū)域12563位G/T多態(tài)（GG）的SNP位點，具有SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2的核苷酸序列，本發(fā)明還提供了這種SNP位點的確定方法，通過對該基因多態(tài)的研究開發(fā)，可應(yīng)用于原發(fā)性膽汁性肝硬化方面的研究，如控制原發(fā)性膽汁性肝硬化發(fā)病、肝硬化病變程度或提高肝移植成功率。
【專利說明】—種KRT8基因外顯子區(qū)域中SNP位點及其確定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種KRT8基因外顯子區(qū)域中SNP位點的核苷酸序列，和這種核苷酸序列的確定方法，并且其應(yīng)用于控制原發(fā)性膽汁性肝硬化發(fā)病。
【背景技術(shù)】
[0002]細胞骨架由微絲、微管和大小介于兩者之前的中間絲組成。角蛋白是中間絲家族的最重要和含量最豐富的成員，分為酸性(I型，K9-28)和堿性(II型，Κ1-8，Κ71-80)兩類。所有上皮細胞至少表達一種I型和一種II型的角蛋白單體，二者反向平行形成二聚體進而組成四聚體，構(gòu)成角蛋白基本可溶性單位。角蛋白表達于表皮和上皮細胞且具有組織特異性，例如肝細胞和胰腺腺泡細胞主要表達Κ8和Κ18，膽管上皮細胞表達Κ7/Κ8/Κ18/Κ19，以及少量Κ20。除了維持細胞機械性完整外，角蛋白還參與許多細胞的重要生物學功能，包括細胞分裂、運動、囊泡的轉(zhuǎn)運、抗應(yīng)激及抗凋亡能力等。在小鼠和人類，角質(zhì)細胞的角蛋白突變是某些皮膚和角膜疾病的直接病因，非角質(zhì)細胞的角蛋白突變可增加疾病的易感性，如肝臟疾病。
[0003]CK8基因定位于12號染色體長臂十三區(qū)，亞細胞定位:細胞漿。它是構(gòu)成細胞結(jié)構(gòu)的主要成分之一，其突變可導(dǎo)致隱源性肝硬化。KRT8，KRT18常以復(fù)合物形式存在，最初是在非鱗狀上皮層發(fā)現(xiàn)，具有保護肝臟免受機械和中毒性損傷的作用。
[0004]動物模型表明角蛋白對肝細胞有重要的保護作用。肝損傷情況下，小鼠肝臟Κ8和K18mRNA及蛋白的表達量可升高近3倍。K8-/-小鼠有明顯的肝臟表型，C57/B1背景的K8-/-小鼠有94%胚胎期死亡伴廣泛肝出血；而FVB/n背景的K8-/-小鼠雖然55%有正常的生存期，但在基礎(chǔ)狀態(tài)時表現(xiàn) 為輕微肝炎，對Fas介導(dǎo)的凋亡敏感性明顯增加。轉(zhuǎn)基因小鼠過表達突變的KRT8基因可使小鼠肝細胞骨架斷裂。與過表達野生型基因相比，這些小鼠將發(fā)展為慢性肝炎，同時易造成肝損害。
[0005]近十余年來，與肝損傷和肝衰竭相關(guān)的人類角蛋白突變位點被逐漸發(fā)現(xiàn)。針對KRTSSNPs研究多數(shù)位于外顯子區(qū)，非翻譯區(qū)的研究極少。在美國和歐洲白種人群中，K8最常見的突變位點是R341H，其次常見的突變位點是G62。R341H出現(xiàn)頻率在美國肝病患者為
6.7%，對照組為3.1% (ρ〈0.01);在德國患者為3.5%，而對照組中未檢出(ρ〈0.09)。在急性肝衰竭病例中，與對照組相比，K8R341H在白種人中比例相應(yīng)較高(ρ=0.01)，而美籍非洲人1(864355更為常見(？=0.02)。這些結(jié)果均提示角蛋白突變具有人種差異性。我國對角蛋白基因變異與疾病關(guān)系進行系統(tǒng)分析研究的報道尚少。同時，目前沒有關(guān)于定位在基因KRT8上位點rsll554491的報道。而西方國家最常見的位點rsll554495 (pG61C)多態(tài)性與PBC無明顯相關(guān)性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供一種KRT8基因外顯子區(qū)域中SNP位點及其確定方法，方法簡單，并應(yīng)用在治療或預(yù)防原發(fā)性膽汁性肝硬化方面的新研究。[0007]本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0008]一種KRT8基因外顯子區(qū)域中SNP位點，是KRT8基因第8外顯子區(qū)域12563位G/T多態(tài)的SNP位點，具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2的核苷酸序列。
[0009]本發(fā)明還提供了這種KRT8基因外顯子區(qū)域中SNP位點的確定方法，是通過以下的步驟實現(xiàn)的:
[0010](I)提取宿主細胞的基因組模板DNA ；
[0011](2)將所述模板DNA進行PCR擴增，其引物是:
[0012]上游:5，-ACGTTGGATGTTCTTCACAACCACGGCCCT-3，，
[0013]下游:5，-ACGTTGGATGTTCTTCACAACCACGGCCCT-3，；
[0014]將擴增后的PCR產(chǎn)物進行純化；
[0015](3)純化后的PCR產(chǎn)物進行PCR延伸反應(yīng)，所述延伸反應(yīng)的引物是:
[0016]上游:5，-ACGTTGGATGTTCTTCACAACCACGGCCCT-3，，
[0017]下游:5’ -GGAGGAGCTGGTGCGG-3，，
[0018]最后進打樹脂純化；
[0019](4)芯片點樣后，采用質(zhì)譜儀檢測，進行數(shù)據(jù)分析，確定SNP位點基因型。
[0020]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明確定的KRT8基因外顯子區(qū)域中SNP位點與原發(fā)性膽汁性肝硬化、肝硬化程度、肝移植成功率等相關(guān)。因此，通過對該基因多態(tài)的研究開發(fā)可用于原發(fā)性膽汁性肝硬化方面，如控制原發(fā)性膽汁性肝硬化發(fā)病、肝硬化病變程度或肝移植成功率。
【具體實施方式】
[0021]以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明做進一步說明。
[0022](一)研究對象
[0023]1、候選基因SNPs檢測樣本
[0024]根據(jù)美國臨床實踐指南:原發(fā)性膽汁性肝硬化(Poupon R.Primary biliarycirrhosis: a2010update. J Hepatol.2010; 52 (5): 745-58.)確診原發(fā)性膽汁性肝硬化患者樣本76例，患者親屬作為對照，對照215例。
[0025]2、入選SNPs分型樣本
[0026]I)原發(fā)性膽汁性肝硬化組(PBC組)
[0027]來自第四軍醫(yī)大學附屬西京醫(yī)院消化科病房，共76例，平均年齡51±11 (均數(shù)加減標準差)歲，原發(fā)性膽汁性肝硬化診斷參照美國臨床實踐指南:原發(fā)性膽汁性肝硬化(Poupon R.Primary biliary cirrhosis:a2010update.J Hepatol.2010;52(5):745-58.)頒布的原發(fā)性膽汁性肝硬化診斷標準，均經(jīng)肝臟穿刺活檢確診。排除病毒性肝炎、藥物性肝炎等患者。
[0028]2)健康對照組(Control組)
[0029]來自經(jīng)診斷為原發(fā)性膽汁性肝硬化患者的家屬，共215例，平均年齡51 ± 13歲，經(jīng)自身抗體篩查排除自身免疫性肝病的可能性。
[0030]3、目的片段PCR擴增
[0031]1)PCR反應(yīng)體系:采用多重PCR擴增技術(shù)，每個反應(yīng)總體積5μ 1，包含模板DNAlO n g, Hotstar Taq0.5U，擴增引物每條 0.5pmol，25mM dNTP, 0.1 μ I ?
[0032]2)PCR反應(yīng)程序:反應(yīng)條件為94°C 4分鐘；94°C 20秒，56 V 30秒，72 V I分鐘，45個循環(huán)；72°C3分鐘；4°Cm。
[0033]4、PCR產(chǎn)物純化
[0034]純化體系:PCR反應(yīng)產(chǎn)物使用 0.5U SAP (shrimp alkaline phosphatase)處理，去除體系中游離的dNTP。反應(yīng)體系7 μ 1，其中PCR產(chǎn)物5 μ 1，SAP混合液2 μ I (SAP0.5U, buffer0.17 μ I)。
[0035]純化反應(yīng):反應(yīng)程序37°C 20分鐘；85°C 5分鐘；4°C①。
[0036]5、測序反應(yīng)(雙向直接測序)
[0037]I)反應(yīng)體系:采用多重PCR擴增技術(shù)，每個反應(yīng)總體積5 μ 1，包含模板DNAlO n g, Hotstar Taq0.5U，擴增引物每條 0.5pmol, 25mMdNTP, 0.1 μ I。
[0038]2) PCR擴增反應(yīng):
[0039]94°C 4 分鐘，94°C 20 秒，56°C 30 秒，72°C I 分鐘，72°C 3 分鐘，4°C ^。其中，94°C 20秒，56 0C 30秒，72 0C I分鐘進行45次循環(huán)。
[0040]3)乙醇沉淀。
[0041]4)測序反應(yīng)產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳。
[0042]6、確定SNP位點，如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
[0043](二)SNP 分型
[0044]MALD1-T0F 質(zhì)譜檢測
[0045]1、引物設(shè)計:應(yīng)用MassARRAYTM Assay Design2.0軟件設(shè)計多重PCR引物。
[0046]2、PCR擴增反應(yīng)
[0047]I)反應(yīng)體系:每個反應(yīng)總體積5 μ 1，包含模板DNAlO n g, Hotstar Taq0.5U，擴增引物每條 0.5pmol,25mM dNTP, 0.1 μ I。
[0048]2)反應(yīng)程序:反應(yīng)條件為94°C 4分鐘；94°C 20秒，56°C 30秒，72°C I分鐘，45個循環(huán)；72°C3分鐘；4°Cm。
[0049]3、PCR產(chǎn)物純化
[0050]I)反應(yīng)體系:PCR 反應(yīng)產(chǎn)物使用 0.5U SAP (shrimp alkaline phosphatase)處理，去除體系中游離的dNTP。反應(yīng)體系7 μ 1，其中PCR產(chǎn)物5 μ 1，SAP混合液
2μ I (SAP0.5U, buffer0.17 μ I)。
[0051]2)反應(yīng)程序:反應(yīng)程序37°C 20分鐘；85°C 5分鐘；4°C^。
[0052]4、延伸反應(yīng)
[0053]I)反應(yīng)體系:總體積9μ I反應(yīng)體系包含SAP處理后PCR產(chǎn)物7 μ 1，其中各延伸反應(yīng)引物混合物0.804 μ I, iPLEX酶0.041 μ I,延伸混合物0.2 μ I。
[0054]2)反應(yīng)程序:反應(yīng)程序為94°C 30秒；94°C 5秒；52°C 5秒，80°C 5秒5個循環(huán)；返回94°C 5秒共40個循環(huán)；72°C 3分鐘，4°C①。
[0055]5、Resin樹脂純化:每個延伸反應(yīng)產(chǎn)物用6mg Clean Resin樹脂純化。
[0056]6、芯片點樣:將純化產(chǎn)物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上，上機測定。SpectroCHIP芯片使用MALD1-TOF(matrix_assisted laser desorption/ionization timeof flight)基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜分析。[0057]7、MassARRAYTM Analyzer 質(zhì)譜檢測(SEQUENOM)，檢測結(jié)果使用 TYPER4.0 軟件(sequenom)分型并輸出結(jié)果。
[0058](三)統(tǒng)計方法
[0059]應(yīng)用SPSS13.0for Windows軟件進行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計:組間均數(shù)比較采用t檢驗；組間頻數(shù)分布比較采用卡方檢驗；相關(guān)疾病基因型風險率采用比數(shù)比(odds ratio, OR)和95%可信區(qū)間(95%CI)表示；多組間均數(shù)比較采用單向方差分析(One-way AN0VA)。P〈0.05為有統(tǒng)計學 意義。
【權(quán)利要求】
1.一種KRT8基因外顯子區(qū)域中SNP位點，其特征在于是KRT8基因第8外顯子區(qū)域12563位G/T多態(tài)的SNP位點，具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2的核苷酸序列。
2.—種KRT8基因外顯子區(qū)域中SNP位點的確定方法，其特征在于是通過以下的步驟實現(xiàn)的: (1)提取宿主細胞的基因組模板DNA； (2)將所述模板DNA進行PCR擴增，其引物是:
上游:5’ -ACGTTGGATGTTCTTCACAACCACGGCCCT-3’， 下游:5，-ACGTTGGATGTTCTTCACAACCACGGCCCT-3，； 將擴增后的PCR產(chǎn)物進行純化； (3)純化后的PCR產(chǎn)物進行PCR延伸反應(yīng)，所述延伸反應(yīng)的引物是:
下游:5’ -GGAGGAGCTGGTGCGG-3’， 最后進行樹脂純化； (4)芯片點樣后，采用質(zhì)譜儀檢測，進行數(shù)據(jù)分析，確定SNP位點基因型。
【文檔編號】C12N15/11GK103602671SQ201310485646
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月16日
【發(fā)明者】韓英 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學