非標(biāo)記snp檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種非標(biāo)記SNP檢測方法，包括：(1)提供兩種以上寡核苷酸探針，并將其中至少一種寡核苷酸探針通過三硫代金剛烷衍生物連接至金基體表面；(2)將該兩種以上寡核苷酸探針置于適于進(jìn)行DNA雜交反應(yīng)的環(huán)境中，并加入目標(biāo)DNA進(jìn)行雜交反應(yīng)；(3)在雜交反應(yīng)過程中和/或雜交反應(yīng)完成后，通過對雜交反應(yīng)體系和/或雜交反應(yīng)形成的產(chǎn)物的相關(guān)特征性參數(shù)進(jìn)行檢測，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)DNA的檢測。本發(fā)明以三硫代金剛烷衍生物連接寡聚核苷酸探針和金基體，使寡聚核苷酸探針系通過三個(gè)硫?qū)饘俦砻孢M(jìn)行螯合，可獲得極高金屬表面包被穩(wěn)定性(如化學(xué)、光學(xué)、溫度、生物、電化學(xué)和電學(xué)穩(wěn)定性)，既利于相關(guān)試驗(yàn)的順利進(jìn)行，且提升了相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果的精確度。
【專利說明】非標(biāo)記SNP檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物分子檢測方法，特別涉及一種非標(biāo)記基因單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前業(yè)界已經(jīng)發(fā)展出多種通過將生物分子連接于金納米粒子，鉬表面的金納米粒子，金電極、金納米薄膜等材料的表面，繼而構(gòu)建生物檢測試劑盒、傳感器或者三維納米結(jié)構(gòu)材料的技術(shù)。在現(xiàn)有的這些技術(shù)中，生物分子與金材料的連接通常是通過連接在生物分子上的單個(gè)或多個(gè)巰基對金表面的強(qiáng)吸附實(shí)現(xiàn)的，但因巰基化學(xué)穩(wěn)定性差，極易受氧氣、光照作用而降解，并產(chǎn)生副產(chǎn)物，繼而干擾后續(xù)反應(yīng)的進(jìn)行或影響試驗(yàn)的精密度。
[0003]例如，對于現(xiàn)有的SNP檢測方法，其大多是通過將寡聚核苷酸探針連接于金納米粒子、金薄膜等基體上，再通過觀測該等寡聚核苷酸探針與目標(biāo)DNA的結(jié)合情況而實(shí)現(xiàn)的，但由于前述的缺陷，往往導(dǎo)致檢測結(jié)果不甚理想。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]鑒于現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的主要目的在于提供一種非標(biāo)記SNP檢測方法。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案:
[0006]一種非標(biāo)記SNP檢測方法，包括:
[0007](I)提供兩種以上寡核苷酸探針，并將其中至少一種寡核苷酸探針通過三硫代金剛烷衍生物連接至金基體表面；`
[0008](2)將該兩種以上寡核苷酸探針置于適于進(jìn)行雜交反應(yīng)的環(huán)境中，并加入目標(biāo)DNA進(jìn)行雜交反應(yīng)；
[0009](3)在雜交反應(yīng)過程中和/或在雜交反應(yīng)完成后,通過對雜交反應(yīng)體系和/或雜交反應(yīng)形成的產(chǎn)物的相關(guān)特征性參數(shù)進(jìn)行檢測，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)DNA的檢測。
[0010]作為較為優(yōu)選的實(shí)施方案之一，步驟(1)包括:將兩種以上寡核苷酸探針分別通過三硫代金剛烷衍生物連接至金基體表面，所述金基體包含金納米粒子。
[0011]進(jìn)一步的，該方法包括:
[0012](2)將兩種寡核苷酸探針置于適于進(jìn)行寡核苷酸雜交反應(yīng)的環(huán)境中，并分別加入目標(biāo)DNA、具有與該兩種寡核苷酸探針完全互補(bǔ)的序列的DNA標(biāo)準(zhǔn)品、具有一個(gè)以上與該兩種寡核苷酸探針非匹配位點(diǎn)的DNA標(biāo)準(zhǔn)品以及與該兩種寡核苷酸探針完全非互補(bǔ)的DNA標(biāo)準(zhǔn)品，并進(jìn)行雜交反應(yīng)；
[0013](3)對由所述目標(biāo)DNA、具有與該兩種寡核苷酸探針完全互補(bǔ)的序列的DNA標(biāo)準(zhǔn)品、具有一個(gè)以上與該兩種寡核苷酸探針非匹配位點(diǎn)的DNA標(biāo)準(zhǔn)品以及與該兩種寡核苷酸探針完全非互補(bǔ)的DNA標(biāo)準(zhǔn)品與該兩種寡核苷酸探針反應(yīng)形成的雜交產(chǎn)物的熔點(diǎn)分別進(jìn)行檢測，并確定所述非匹配位點(diǎn)的數(shù)量與所述雜交產(chǎn)物的熔點(diǎn)之間的對應(yīng)關(guān)系，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)DNA的檢測。[0014]作為具體應(yīng)用方案之一，步驟(3)中檢測所述雜交產(chǎn)物熔點(diǎn)的方法包括:將所述雜交產(chǎn)物置于適于進(jìn)行寡核苷酸雜交反應(yīng)的環(huán)境中，調(diào)整環(huán)境溫度，并實(shí)時(shí)測量吸收光譜隨溫度的變化情況，進(jìn)而測得所述雜交產(chǎn)物的熔點(diǎn)。
[0015]作為較為優(yōu)選的實(shí)施方案之一，步驟(1)包括:將一種寡核苷酸探針分別通過三硫代金剛烷衍生物連接至金基體表面，所述金基體包含金薄膜芯片。
[0016]進(jìn)一步的，步驟⑵包括:
[0017]1.將連接在金薄膜芯片上的一種寡核苷酸探針置于適于進(jìn)行寡核苷酸雜交反應(yīng)的環(huán)境中，并加入目標(biāo)DNA進(jìn)行雜交反應(yīng)，同時(shí)以SPR光譜實(shí)時(shí)觀測所述雜交反應(yīng)過程；
[0018]i1.將另一種寡核苷酸探針加入步驟i形成的混合反應(yīng)體系中，并繼續(xù)進(jìn)行雜交反應(yīng)，同時(shí)以SPR光譜實(shí)時(shí)觀測所述雜交反應(yīng)過程。
[0019]作為較為優(yōu)選的實(shí)施方案之一，該方法包括:
[0020](2)
[0021]1.將連接在金薄膜芯片上的一種寡核苷酸探針置于適于進(jìn)行寡核苷酸雜交反應(yīng)的環(huán)境中，并分別加入目標(biāo)DNA、具有與該兩種寡核苷酸探針完全互補(bǔ)的序列的DNA標(biāo)準(zhǔn)品、具有一個(gè)以上與該兩種寡核苷酸探針非匹配位點(diǎn)的DNA標(biāo)準(zhǔn)品以及與該兩種寡核苷酸探針完全非互補(bǔ)的DNA標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行雜交反應(yīng)，同時(shí)以SPR光譜實(shí)時(shí)觀測所述雜交反應(yīng)過程;
[0022]i1.將另一種寡核苷酸探針加入步驟i形成的混合反應(yīng)體系中，并繼續(xù)進(jìn)行雜交反應(yīng)，同時(shí)以SPR光譜實(shí)時(shí)觀測所述雜交反應(yīng)過程；
[0023](3)確定所述SPR光譜參數(shù)變化與所述非匹配位點(diǎn)的數(shù)量之間的對應(yīng)關(guān)系，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)DNA的檢測。
[0024]具體而言，所述三硫代金剛烷衍生物具有如下結(jié)構(gòu)式:
[0025]
【權(quán)利要求】
1.一種非標(biāo)記SNP檢測方法，其特征在于，包括: (1)提供兩種以上寡核苷酸探針，并將其中至少一種寡核苷酸探針通過三硫代金剛烷衍生物連接至金基體表面； (2)將該兩種以上寡核苷酸探針置于適于進(jìn)行DNA雜交反應(yīng)的環(huán)境中，并加入目標(biāo)DNA進(jìn)行雜交反應(yīng)； (3)在雜交反應(yīng)過程中和/或在雜交反應(yīng)完成后,通過對雜交反應(yīng)體系和/或雜交反應(yīng)形成的產(chǎn)物的相關(guān)特征性參數(shù)進(jìn)行檢測，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)DNA的檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非標(biāo)記SNP檢測方法，其特征在于，步驟(1)包括:將兩種以上寡核苷酸探針分別通過三硫代金剛烷衍生物連接至金基體表面，所述金基體包含金納米粒子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的非標(biāo)記SNP檢測方法，其特征在于，該方法包括: (2)將兩種寡核苷酸探針置于適于進(jìn)行寡核苷酸雜交反應(yīng)的環(huán)境中，并分別加入目標(biāo)DNA、具有與該兩種寡核苷酸探針完全互補(bǔ)的序列的DNA標(biāo)準(zhǔn)品、具有一個(gè)以上與該兩種寡核苷酸探針非匹配位點(diǎn)的DNA標(biāo)準(zhǔn)品以及與該兩種寡核苷酸探針完全非互補(bǔ)的DNA標(biāo)準(zhǔn)品，并進(jìn)行雜交反應(yīng)； (3)對由所述目標(biāo)DNA、具有與該兩種寡核苷酸探針完全互補(bǔ)的序列的DNA標(biāo)準(zhǔn)品、具有一個(gè)以上與該兩種寡核苷酸探針非匹配位點(diǎn)的DNA標(biāo)準(zhǔn)品以及與該兩種寡核苷酸探針完全非互補(bǔ)的DNA標(biāo)準(zhǔn)品 與該兩種寡核苷酸探針反應(yīng)形成的雜交產(chǎn)物的熔點(diǎn)分別進(jìn)行檢測，并確定所述非匹配位點(diǎn)的數(shù)量與所述雜交產(chǎn)物的熔點(diǎn)之間的對應(yīng)關(guān)系，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)DNA的檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的非標(biāo)記SNP檢測方法，其特征在于，步驟(3)中檢測所述雜交產(chǎn)物熔點(diǎn)的方法包括:將所述雜交產(chǎn)物置于適于進(jìn)行寡核苷酸雜交反應(yīng)的環(huán)境中，調(diào)整環(huán)境溫度，并實(shí)時(shí)測量吸收光譜隨溫度的變化情況，進(jìn)而測得所述雜交產(chǎn)物的熔點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非標(biāo)記SNP檢測方法，其特征在于，步驟(1)包括:將一種寡核苷酸探針分別通過三硫代金剛烷衍生物連接至金基體表面，所述金基體包含金薄膜芯片。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的非標(biāo)記SNP檢測方法，其特征在于，步驟(2)包括: i.將連接在金薄膜芯片上的一種寡核苷酸探針置于適于進(jìn)行寡核苷酸雜交反應(yīng)的環(huán)境中，并加入目標(biāo)DNA進(jìn)行雜交反應(yīng)，同時(shí)以SPR光譜實(shí)時(shí)觀測所述雜交反應(yīng)過程； ii.將另一種寡核苷酸探針加入步驟i形成的混合反應(yīng)體系中，并繼續(xù)進(jìn)行雜交反應(yīng)，同時(shí)以SPR光譜實(shí)時(shí)觀測所述雜交反應(yīng)過程。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的非標(biāo)記SNP檢測方法，其特征在于，該方法包括:
(2) i.將連接在金薄膜芯片上的一種寡核苷酸探針置于適于進(jìn)行寡核苷酸雜交反應(yīng)的環(huán)境中，并分別加入目標(biāo)DNA、具有與該兩種募核昔酸探針完全互補(bǔ)的序列的DNA標(biāo)準(zhǔn)品、具有一個(gè)以上與該兩種寡核苷酸探針非匹配位點(diǎn)的DNA標(biāo)準(zhǔn)品以及與該兩種寡核苷酸探針完全非互補(bǔ)的DNA標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行雜交反應(yīng)，同時(shí)以SPR光譜實(shí)時(shí)觀測所述雜交反應(yīng)過程； ii.將另一種寡核苷酸探針加入步驟i形成的混合反應(yīng)體系中，并繼續(xù)進(jìn)行雜交反應(yīng)，同時(shí)以SPR光譜實(shí)時(shí)觀測所述雜交反應(yīng)過程；(3)確定所述SPR光譜參數(shù)變化與所述非匹配位點(diǎn)的數(shù)量之間的對應(yīng)關(guān)系，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)DNA的檢測。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的非標(biāo)記SNP檢測方法，其特征在于，所述三硫代金剛烷衍生物具有如下結(jié)構(gòu)式:
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的非標(biāo)記SNP檢測方法，其特征在于，所述三硫代金剛烷衍生物至少選自如下化合物中的任一種:
【文檔編號】C12Q1/68GK103614459SQ201310485829
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月17日
【發(fā)明者】胡軍, 方晨 申請人:蘇州青山生物科技有限公司