哺乳動物細胞高效表達載體的構(gòu)建及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及哺乳動物細胞高效表達載體pSNEO，該載體是基于新霉素抗性篩選基因NEO通過聯(lián)合弱化篩選基因表達和增強目的基因表達的策略構(gòu)建而成。其中，篩選基因的弱化包括兩方面，在啟動子中引入缺失突變實現(xiàn)篩選基因的轉(zhuǎn)錄弱化，然后在篩選基因翻譯起始位點前引入發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列以實現(xiàn)篩選基因的翻譯弱化。目的基因的表達增強是在目的基因表達框的多克隆位點與PolyA加尾信號之間加入轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件WPRE序列。本發(fā)明構(gòu)建的pSNEO載體可以方便快速的完成目的基因的穩(wěn)定高表達細胞株的構(gòu)建，為大分子重組蛋白的制備提供了新的工具。
【專利說明】晡乳動物細胞高效表達載體的構(gòu)建及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物制藥基因工程表達技術(shù)，具體涉及一種哺乳動物細胞高效表達載體的構(gòu)建及應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]哺乳動物細胞高效表達系統(tǒng)及高表達工程細胞株的獲得是基因工程藥物研究和生產(chǎn)的瓶頸，而表達載體和宿主細胞是哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的兩個基本組成部分。目前用于制備基因工程藥物的表達系統(tǒng)包括以大腸桿菌為宿主的原核表達系統(tǒng)和以酵母、昆蟲細胞、植物細胞和哺乳動物細胞為宿主的真核表達系統(tǒng)。
[0003]CHO表達系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的真核表達系統(tǒng)之一，是為數(shù)不多的可進行高密度懸浮培養(yǎng)的動物細胞之一。CHO細胞表達的外源基因產(chǎn)物與天然蛋白在結(jié)構(gòu)、糖基化類型和方式上幾乎相同，且能正確組裝成多亞基蛋白，并可大規(guī)模、高密度培養(yǎng)。但是該細胞系在表達外源基因時存在著培養(yǎng)成本高、周期長、表達量低等問題。因此，建立哺乳動物細胞高效表達系統(tǒng)包括高表達載體構(gòu)建、高表達工程細胞株的獲得、生物反應(yīng)器無血清高密度培養(yǎng)工藝以及目標(biāo)蛋白的分離純化工藝，是生物制藥工業(yè)研究和生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)。本發(fā)明就哺乳動物細胞高表達載體的構(gòu)建做了進一步研究。
[0004]目的基因在哺乳動物細胞中的表達受整合目的基因的染色體區(qū)域的狀態(tài)、目的基因的拷貝數(shù)及目的基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后加工修飾的效率影響。構(gòu)建一個高表達的哺乳動物細胞表達載體，應(yīng)從表達載體在染色體上整合位點的優(yōu)化、轉(zhuǎn)錄與翻譯效率的提高以及目的基因的拷貝數(shù)的增加等方面綜合考慮。
[0005]一、整合位點的優(yōu)化。目的基因在CHO細胞染色體上整合位點的狀態(tài)對于目的基因的表達與否、表達高低以及目的基因在宿主細胞中的穩(wěn)定性起著決定性作用，只有那些整合位點處于染色體活躍區(qū)的細胞形成的克隆才可高水平表達目的基因。其方法主要有:
(I)利用選擇基因的弱化表達提聞轉(zhuǎn)基因表達水平；(2)利用核基質(zhì)附著區(qū)提聞轉(zhuǎn)基因表達水平；(3)利用位點特異性重組提高目的基因表達水平。二、增加目的基因拷貝數(shù)。單拷貝或低拷貝目的基因，無論表達載體調(diào)控元件如何優(yōu)化、整合的染色體位點多么合適，其外源基因表達量都是有限的，因此通過增加目的基因拷貝數(shù)來獲得高表達重組藥物的CHO工程細胞株是基因工程藥物研究不可或缺的重要環(huán)節(jié)。三、轉(zhuǎn)錄水平的提高。啟動子及其相應(yīng)的增強子、轉(zhuǎn)錄終止信號及多聚腺苷酸加尾信號對轉(zhuǎn)錄水平的高低及mRNA的穩(wěn)定性有很大影響，其中強啟動子、增強子是提高轉(zhuǎn)錄水平的關(guān)鍵因素。四、提高翻譯水平。翻譯水平的調(diào)控(如mRNA壽命，mRNA的翻譯起始效率)和翻譯產(chǎn)物加工修飾的效率也對目的基因的表達產(chǎn)生重要影響。Poly A的存在不但能影響mRNA穩(wěn)定性，而且也能部分引起“翻譯增強子”的作用，提高mRNA翻譯水平。
[0006]為了獲得高表達細胞株，一般都是通過將攜帶目的基因及篩選基因的真核表達載體轉(zhuǎn)染進細胞后隨機整合到基因組中實現(xiàn)目的基因的穩(wěn)定表達，通過篩選基因的篩選，得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子。[0007]常用的真核篩選基因有NEO基因、GS基因等。NEO基因是一種常用的獲得穩(wěn)定表達細胞株的篩選基因，編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，可以將G418轉(zhuǎn)變成無毒形式。G418是一種氨基糖類抗生素，其結(jié)構(gòu)與新霉素、慶大霉素、卡那霉素相似，它通過影響80S核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成，對細菌、酵母、植物和哺乳動物細胞等原核和真核等細胞都有毒性，是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的選擇試劑。當(dāng)NEO基因被整合進真核細胞基因組合適的地方后，則能啟動NEO基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為mRNA，從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達，使細胞獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長。[0008]在細胞中表達水平的調(diào)控是由基因的順式作用元件與細胞內(nèi)存在的反式作用因子之間的相互作用來實現(xiàn)。由于在特定的細胞內(nèi)，反式作用因子是固定的，不可改變的，因此基因的表達主要取決于其順式作用元件的作用。為了得到高表達細胞株，借助真核基因表達調(diào)控的理論，可將較強的順式作用元件集中到一個載體中，使其方便高效地表達目的基因。必須的順式作用元件包括:真核啟動子、增強子、加尾信號序列等，此外還包括一些特定的5'端非翻譯區(qū)或3'端非翻譯區(qū)。尤其是mRNA5'端非翻譯區(qū)的發(fā)夾(hairpin)結(jié)構(gòu)是一類非常重要然而又常常受到忽視的順式作用元件。如果mRNA的翻譯起始密碼子ATG附近存在穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，從而影響到翻譯起始效率，尤其是那些非常穩(wěn)定的發(fā)卡的存在會完全抑制翻譯起始。同時也有報道表明，當(dāng)5'非翻譯區(qū)存在富含G-C配對的莖環(huán)(stem-loop)結(jié)構(gòu)時,翻譯起始復(fù)合體很難在體外組裝成功，從而影響翻譯的起始(PestovaTV, Kolupaeva VG.Genes Dev.2002，16 (22):2906-2922.)。
[0009]在真核表達載體中，常用的真核啟動子為巨細胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)啟動子、猴空泡病毒40 (Simian virus 40，SV40)啟動子、小鼠巨細胞病毒(Mousecytomegalovirus, mCMV)啟動子等。有研究表明:在CHO細胞中，CMV啟動子的轉(zhuǎn)錄活性分別是SV40啟動子和LTR (Rous肉瘤病毒基因)啟動子的10倍和30倍左右，在之前的研究中我們通過一個比較強的啟動子如CMV promoter來驅(qū)動目的基因的表達，和一個稍弱的啟動子如SV40 promoter來表達篩選基因,但是最后形成的克隆仍是很多,從成千上萬個轉(zhuǎn)染子中篩選高表達細胞系仍然是很困難的，通常需要耗費很長時間。
[0010]選擇基因(如neo、dhfr)的弱化表達,使大量整合在低表達整合位點的細胞由于選擇標(biāo)記基因表達量不夠而在選擇培養(yǎng)基條件下死亡，只有那些少量整合在轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)的細胞由于表達足夠的選擇基因產(chǎn)物而存活下來形成克隆。在弱化選擇基因的表達上，本領(lǐng)域的研究者做了很多嘗試:(I)通過基因突變來削弱篩選基因的功能(Sautter K，EnenkelB.Bioengineer.2005 Mar 5; 89 (5): 530-8.) ; (2)通過改造起始密碼子鄰近的基因序列來弱化篩選基因的表達(Reff，US Patent N0.5，733，799，1998 ); (3)通過對起始密碼子本身進行改造，使篩選基因的起始密碼子具有比較低的翻譯起始效率，之后連接的目的基因的起始密碼子為優(yōu)化的密碼子，從而提高目的基因的表達(Van Blokland et al.J Biotechnol.2007 Feb I; 128 (2): 237-45)。有文獻報道，刪除SV40啟動子中兩個重復(fù)72bp序列，或在刪除一個72bp重復(fù)序列后，在剩余的一個72bp重復(fù)序列的第5-7位引入TGG-GTT突變，可使SV40啟動子轉(zhuǎn)錄活性分別降低為野生型的1/3、1/1000及1/36 (JamesJ, Lucy CP, Patricia ED.Sciense.1994; 249:404-406)。通常情況下，經(jīng)過這樣嚴(yán)格的篩選，表達篩選基因低的細胞將會被更有效的殺死，表達篩選基因聞的細胞才能存活下來；同時形成的克隆會比較少，這些克隆一般會比較高水平的表達目的蛋白。[0011 ] 據(jù)報道，土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控兀件(Woodchuck Hepatitis VirusPosttranscriptional Regulatory Element, WPRE)是存在于土撥鼠肝炎病毒基因組序列(GenBank Accession N0.J04514)的HBVPRE(人乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件)相類似的區(qū)域，是基因組序列第1093位到1684位的592個堿基的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控區(qū)域(Journal ofVirology, Vol.72, 5085-5092, 1998),可以增強基因的表達水平(US 6284469 BI)。關(guān)于WPRE的報道主要集中在與病毒載體相關(guān)的基因治療方面。中國專利CN102618579A公開了HA-VP2基因重組桿狀病毒表達載體的構(gòu)建證實了添加調(diào)控元件WPRE可以提高桿狀病毒介導(dǎo)外源基因在CHO細胞中的表達率。專利CN102533862A中發(fā)明人成功地構(gòu)建EGFP基因重組桿狀病毒表達載體，WPRE增強了外源基因的表達效率。同時有文獻報道WPRE可以提高蛋白的瞬時表達水平(Biotechnology and Bioprocess Engineering.2009 October;Volume 14, Issue 5, pp 633-638)。
[0012]本發(fā)明基于以上思路，構(gòu)建了一種攜帶篩選基因的真核表達載體pSNEO，篩選基因的啟動子是弱化后的SV40啟動子，同時在篩選基因翻譯起始位點前引入發(fā)卡結(jié)構(gòu)，共同的目標(biāo)是使轉(zhuǎn)染子的形成率大大降低，只有那種整合位點較好，高表達目的基因的轉(zhuǎn)染子才可以存活下來。同時加入轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件WPRE，利用該載體可以簡單快速的獲得目的基因的穩(wěn)定聞表達細胞株，為真核重組蛋白的表達提供了新的工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了真核表達載體pSNEO，該載體主要由篩選基因表達框與目的基因表達框組成。該真核表達載體pSNEO的篩選基因啟動子是弱化的SV40啟動子，即SV40'，可以降低篩選基因的轉(zhuǎn)錄水平；篩選基因翻譯起始位點前引入發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列，該序列可以降低篩選基因的翻譯水平；目的基因表達框的多克隆位點與rabbitbeta-globin polyA之間加入WPRE序列，該轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件可以增強目的基因mRNA的穩(wěn)定性，進而提聞目的基因的表達水平。
[0014]弱化的SV40啟動子和發(fā) 夾結(jié)構(gòu)序列可以確保本發(fā)明中的載體上的篩選基因的低水平表達，因而在該載體整合至宿主細胞的基因組之后，只有整合在適合外源基因高表達的“熱點”位置(hot-spot)的克隆才能存活，不僅能夠有效克服高表達克隆篩選過程的“位置效應(yīng)”(position effect)，而且減少了篩選過程中的低表達背景克隆。聯(lián)合WPRE序列，本發(fā)明將能夠有效提高構(gòu)建高表達細胞株的效率。
[0015]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
本發(fā)明提供了一種真核表達載體，該載體是以PTSE載體為基礎(chǔ)改造獲得，包括表達弱化的篩選基因表達框和表達增強的目的基因表達框，該載體被命名為pSNEO。
[0016]所述的真核表達載體，其表達弱化的篩選基因表達框依次含有弱化的SV40啟動子、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、篩選基因、SV40 polyA加尾信號；表達增強的目的基因表達框依次含有CMV啟動子，多克隆位點，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件WPRE和rabbit beta-globin polyA加尾信號。
[0017]所述弱化的SV40啟動子核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述的發(fā)夾結(jié)構(gòu)核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述WPRE核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0018]所述的的真核表 達載體，其篩選基因是新霉素抗性基因NE0。
[0019]本發(fā)明同時提供了所 述基礎(chǔ)載體pTSE載體的構(gòu)建方法，具體步驟如下:以pTT載體為基礎(chǔ)進行改造獲得pTSE載體，關(guān)于pTT載體的制備過程在參考文獻(Yves Durocher,Sylvie Perret and Amine Kamen, Nucleic Acids Research, 2002, Vol.30，N0.2 e9)中有詳細的描述。pTSE載體的制備過程如下:首先用EcoRI單切pTT載體，接著用Τ4 DNA polymerase將產(chǎn)生的粘性末端補平，重新連接該載體，消除EcoRI酶切位點；接著將得到的載體用SalI單切,用T4 DNA polymerase將產(chǎn)生的粘性末端補平,重新連接該載體，消除SalI酶切位點，得到pTT'載體。合成含信號肽及多克隆位點的序列如下:5’ -agtgtttaaacggagaattcgccgccaccATGGAGACCGACACCCTGCTGCTCTGGGTGCTGCTGCTCTGGGTGCCCGGGTCGACCGGTGGCGCCAAGCTTGGATCCAGA-3，，下劃線部分分別為 Pme1、EcoR1、BamHI 位點，方框部分為信號肽序列，便于表達的外源蛋白分泌到胞外。PmeI及BamHI雙酶切該序列后定向克隆入PlT載體的PmeI及BamHI之間，從而引入信號肽及多克隆位點(包括Sail、Age1、Kas1、HindIII及BamHI)，得到pTSE載體，結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0020]為了構(gòu)建PSNEO，接著對pTSE載體進行了改造，在目的基因表達框的多克隆位點與rabbit beta-globin polyA之間定向克隆入WPRE,得到表達載體pTSE_w,為了證明WPRE的功能，我們分別構(gòu)建了抗CD22的人源化抗體hRFB4的輕鏈與重鏈基因表達載體pTSE-hRFB4K 及 pTSE_hRFB4H、pTSE_hRFB4K_w 及 pTSE_hRFB4H_w，在相同的條件下轉(zhuǎn)染293E細胞，比較它們的蛋白表達量，具體見實施例1。
[0021]接著在pTSE-w的基礎(chǔ)上，連接入SV4(V -NE0_SV40polyA表達單元，在NEO基因翻譯起始位點ATG前引入可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的序列，如SEQ ID No:2所示，構(gòu)建成真核表達載體pSNEO。連接的SV4(V -NE0-SV40polyA表達單元來源于商業(yè)化的pcDNA3.1+載體(購自invitrogen),通過設(shè)計引物缺失突變SV40啟動子序列的第一個72bp重復(fù)序列及第二個72bp重復(fù)序列的前26個堿基。為了驗證該載體的有效性，我們構(gòu)建了腫瘤壞死因子TNF-α的表達載體pSNEO-TNF，用于穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的篩選，陽性克隆形成率很高，具體見實施例2。同時構(gòu)建了抗原癌基因人類表皮生長因子受體2即Her2的抗體antiHer2的表達載體PSNE0-antiHer2，用于穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的篩選，最后得到高表達的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，具體見實施例2。
[0022]本發(fā)明同時提供了所述真核表達載體的構(gòu)建方法，具體步驟如下:
(1)在目的基因表達框的多克隆位點與rabbitbeta-globin polyA之間定向克隆入WPRE,構(gòu)建含WPRE序列的表達載體，命名為pTSE-w ；
(2)由PcDNA3.1+ 制備篩選表達單位 SV40' -NE0-SV40polyA ；
(3)在NEO基因翻譯起始位點ATG前引入可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的序列，構(gòu)建真核表達載體命名為pSNEO。
[0023]本發(fā)明同時提供了所述的真核表達載體在單基因或雙基因表達中的應(yīng)用。
[0024]本發(fā)明同時提供了所述的真核表達載體在制備哺乳動物細胞高表達細胞株中的應(yīng)用。
[0025]該載體不僅能實現(xiàn)蛋白在瞬時表達水平上的提升，而且能夠快速得到穩(wěn)定的高表達株，縮短了穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的研發(fā)周期。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為pTSE質(zhì)粒圖譜。[0027]圖2為pTSE-w質(zhì)粒圖譜。
[0028]圖3為hRFB4抗體純化產(chǎn)物電泳圖。其中，泳道I代表pTSE_hRFB4K與pTSE-hRFB4H共轉(zhuǎn)染293E細胞收獲的上清純化后的電泳圖，泳道2代表pTSE-hRFB4K_w與pTSE-hRFB4H-w共轉(zhuǎn)染293E細胞收獲的上清純化后的電泳圖，marker指的是Themo的PageRuler Unstained Protein Ladder, 10_200KDa 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。
[0029]圖4為發(fā)卡結(jié)構(gòu)示意圖。
[0030]圖5為pSNEO質(zhì)粒圖譜。
[0031]圖6為pSNEO-TNF質(zhì)粒圖譜。
[0032]圖7為表達TNF膜蛋白的CHO-S穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株流式檢測結(jié)果圖。其中2、4、5、6、8號為陽性克隆，1、3、7、9、10號克隆為陰性克隆。
[0033]圖8 為 pSNE0_antiHer2 質(zhì)粒圖譜。
[0034]圖9為表達antiHer2抗體的10株pSNE0_antiHer2穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株表達示意圖。
[0035]下面對所有質(zhì)粒圖譜中的縮寫標(biāo)注進行解釋=Amp-R是氨芐青霉素抗性基因；pBR322 ori是質(zhì)粒pBR322復(fù)制原點；PSV40'是弱化后的SV40早期啟動子；hairpin是可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的序列；ΝΕ0是新霉素抗性基因；SV40 polyA是SV40病毒蛋白表達的加尾信號序列；PCMV是人巨細胞病毒啟動子；leader是信號肽序列；WPRE是土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件；Rabbit beta-globin polyA是兔β球蛋白加尾信號序列；EBV ori是EBV病毒復(fù)制原點；TNF是一種腫瘤壞死因子；antiHer2-L是antiHer2抗體的輕鏈序列；antiHer2_H是antiHer2抗體的重鏈序列。`
[0036]【具體實施方式】:
下述實施例中所述實驗方法如無特殊說明均為常規(guī)實驗方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0037]實施例1:pTSE-w載體的構(gòu)建及WPRE序列的有效性的驗證
1、pTSE-w載體的構(gòu)建:
WPRE序列如SEQ IN NO:3所示，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。設(shè)計PCR引物擴增，然后用BamHI和BglII酶切，得目的片段。
[0038]Pl:5，-TAGGGATCCAATCAACCTCTGGA-3，
P2:5， - TGTAGATCTCGAAGACGCGGAAGAGGCCG-3>
用BamHI線性化pTSE載體，并進行去磷酸化，防止載體自連；因為BamHI及BglII為同尾酶，產(chǎn)生的粘性末端可以連接，最后挑取WPRE插入方向為正向的pTSE-w載體(我們規(guī)定與PCMV-MCS-RBGp0IyA相同的插入方向為正向)。此時保留原來多克隆位點的BamHI位點，WPRE序列連入后，下游的酶切位點消失。BamHI與BglII雙酶切的WPRE序列與BamHI線性化的PTSE載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，挑取克隆，提取質(zhì)粒，測序得到正確的pTSE-w載體,如見圖2所示。
[0039]、WPRE序列的有效性的驗證:
通過構(gòu)建人源化的抗⑶22抗體的輕鏈與重鏈基因表達載體pTSE-hRFB4K及pTSE-hRFB4H、pTSE-hRFB4K-w 及 pTSE_hRFB4H_w 來驗證 WPRE 序列的有效性。
[0040]擴增hRFB4重鏈(hRFB4H)所需的引物是P3與P4，擴增hRFB4輕鏈(hRFB4K)所需的引物是P5與P6 ;以pGH-hRFB4K與pGH_hRFB4H質(zhì)粒(即CN 103214578A說明書第6頁第54段公開的含hRFB4輕鏈和重鏈基因的pCDNA3.1的載體，此處分別命名為pGH_hRFB4K和pGH-hRFB4H，由上海捷瑞生物工程有限公司全合成)為模板合成引物:
P3:5， -cggGtcGaccggTGAAGTGCAGCTGGT-3，
P4:5’ -GACGGATCCTCATTTACCCGGGGACAGGGA-3’
P5:5’ -cggGtcGaccggTGATATCCAGATGACCCAGAGC-3’
P6:5’ -GACGGATCCTAACACTCTCCCCTGTTGA-3’ P3與P5下劃線部分是SalI酶切位點，P4與P6下劃線部分是BamHI酶切位點。SalI與BamHI雙酶切pTSE_w及pTSE載體，并雙酶切由PCR得到的hRFB4K及hRFB4H，分別進行連接轉(zhuǎn)化鑒定后得到正確的pTSE-hRFB4K、pTSE- hRFB4H、pTSE- hRFB4K_w及pTSE- hRFB4H_w四種載體。
[0041]在完全平行的條件下，將pTSE-hRFB4K與pTSE-hRFB4H等量各取15ug共轉(zhuǎn)染30ml293Ecell，pTSE- hRFB4K_w 及 pTSE- hRFB4H_w 等量各取 15ug 共轉(zhuǎn)染 30ml 293E 細胞，分別在3天后收獲上清，用Protein A進行純化。pTSE- hRFB4K與pTSE- hRFB4H共轉(zhuǎn)染收獲的上清純化后得到的蛋白總量是1.lmg，pTSE- hRFB4K-w及pTSE- hRFB4H_w共轉(zhuǎn)染收獲的上清純化后得到的蛋白總量是2mg。
[0042]各取500ul收獲的-上清加入IXPB (0.02M, pH7.0)平衡好的Protein A懸液，使Protein A與培養(yǎng)上清中的抗體充分結(jié)合,離心舍棄上清,在余下的Protein A介質(zhì)中加A 50ul I X loading buffer,沸水煮3_5min。取出煮好的樣品,冷卻后再離心一下樣品,取上層澄清液體5ul，上樣于SDS-PAGE膠，電泳結(jié)果如圖3，結(jié)果證明pTSE載體連入WPRE序列后可以提聞蛋白的表達水平。
[0043]實施例2:pSNE0載體的構(gòu)建及在細胞株構(gòu)建方面高效性的驗證 UpSNEO載體的構(gòu)建
以pTSE-w載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建用于篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的載體pSNEO，具體的構(gòu)建方法如下:以PcDNA3.1+質(zhì)粒(購自Invitrogen公司)為模板,合成引物序列如下(PNE0F-1與PNE0R-2合成5’端磷酸化引物):
PNE0F-1:5’ -GCAGGCAGAAGTATGCAAAG-3’
PNE0R-1:5’ -GATGTCTACTGCATCCTCGATGTGATCAGATCCGAAAAT-3’
PNE0F-2:5’ -AGGATGCAGTAGACATCCTCGATGATTGAACAAGATGGAT-3’
PNE0R-2:5’ -GATATCGCTACATGTATACAGACATGATAAGATACATTGATG-3^
方框標(biāo)注部分為反向互補序列，下劃線部分分別是EcoRV與PciI酶切位點，PNE0F-1與PNE0R-1擴增得到片段NEOl，PNE0F-2與PNE0R-2擴增得到片段NE02，以PNE0F-1與PNE0R-2為引物，NEOl 與 NE02 為模板，重疊 PCR 得至Ij “SV40,啟動子-hairpin-NE0_SV40 polyA”單元,該單元的啟動子是缺失 5，-CTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCMAGCATGCATCTCMTTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCA-3，片段的弱化的啟動子，同時在翻譯起始位點ATG前引入序列5’-CATCGAGGATGCAGTAGACATCCTCGATG-3’，該序列可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，如圖4所示，影響篩選基因的翻譯起始；在該篩選單元的下游引入EcoRV與PciI酶切位點，便于構(gòu)建重鏈與輕鏈在一個載體的全抗體表達載體。PciI單切質(zhì)粒pTSE-w,然后用T4 DNA polymerase將產(chǎn)生的粘性末端補平,接著用CIP進行去磷酸化，回收后連接pTSE-w和5’端磷酸化的篩選基因表達單元PCR產(chǎn)物，構(gòu)建質(zhì)粒pSNEO，如圖5所示，經(jīng)過鑒定測序挑取正向方向的克隆(我們規(guī)定與PCMV-MCS-Rabbit beta-globinpolyA相同的插入方向為正向，MCS指多克隆位點)。
[0044]2、pSNEO載體在穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建方面具有高效性的驗證
2.1載體pSNEO-TNF的構(gòu)建:
為了驗證真核表達載體PSNEO在穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建方面具有高效性，我們構(gòu)建了表達腫瘤壞死因子TNF- α的載體pSNEO-TNF。
[0045]以pGH-TNF (Τ.Arora et al.Cytokine 45 (2009) 124-131 中第 125 頁所用的含突變的TNF DNA序列的慢病毒載體，此處命名為pGH-TNF載體，由上海捷瑞生物工程有限公司合成)為模板合成擴增TNF的引物序列:
PTNFF:5’ -AGCGAATTCGCCGCCACCATGAGCACTGAAAGCATGATC-3’
PTNFR:5’ -ACTGGATCCTCACAGGGCAATGATCC-3，
下劃線部分分別為EcoRI與BamHI酶切位點，方框部分為kozak序列，將擴增的PCR片段定向插入PSNEO載體的EcoRI與BamHI酶切位點之間，得到正確的pSNEO-TNF質(zhì)粒，如圖6所示。
[0046]將pSNEO-TNF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CH0-S細胞，具體的轉(zhuǎn)染過程參見Lipof ectamine2000 (購自Invitrogen, Cat.N0.11668-019)的說明書,轉(zhuǎn)染及篩選過程如下:轉(zhuǎn)染前一天在六孔板中每孔接種6 X IO5個CH0-S細胞,轉(zhuǎn)染時每孔需IOul Lipofectamine2000及4ug SSpI線性化的pSNEO-TNF質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24h后，以1:10的比例將細胞傳代至150mm細胞培養(yǎng)皿中，傳代24h后換成篩選培養(yǎng)基進行篩選，篩選培養(yǎng)基是含10% FBS、4mM Glutamine和500 ug/mlG418的IMDM培養(yǎng)基；接下來每2_3天更換篩選培養(yǎng)基，10-14天后可見清晰的單克隆形成，每個150mm細胞培養(yǎng)皿大概長單克隆30-50個，隨機挑取10個單克隆擴大培養(yǎng)到12孔板，接著擴大到6孔板，待細胞匯合度達到90%時，進行鑒定。
[0047]通過流式細胞儀鑒定表達的TNF- α膜蛋白，具體的方法如下:首先配含1%BSA的PBS工作液，每個克隆分別取I X IO6個細胞，用工作液洗2遍細胞，接著孵育抗TNF-α的抗體humira (購自國藥控股北京有限公司),每管加入IOOul濃度為10ug/ml的humira抗體稀釋液重懸細胞，4°C孵育Ih ;用工作液洗2-3遍細胞，將未結(jié)合的humira抗體全部洗掉；接著孵育以1:50稀釋的IPTG標(biāo)記的山羊抗人IgG 二抗(購自中杉金橋有限公司)，每管加入IOOul 二抗工作液，混勻重懸后4°C孵育Ih ;將細胞洗2-3遍后，重懸至500ul的PBS工作液中，用流式細胞儀進行檢測，檢測結(jié)果見圖7。在檢測的10個單克隆中陽性克隆率占50%，證明構(gòu)建的pSNEO載體能很好的應(yīng)用于穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的構(gòu)建，且陽性克隆形成率很高。[0048]2.2 載體 pSNEO-antiHer2 的構(gòu)建:
為了驗證pSNEO載體在穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建方面具有高效性，我們構(gòu)建了抗原癌基因人類表皮生長因子受體2即Her2的抗體antiHer2的表達載體pSNE0_antiHer2。
[0049]2.2.1 pTSE-antiHer2L-w 的構(gòu)建
以 pBT-antiHer2 質(zhì)粒(US20090202546A1，2009年 8 月 13 日中公開的含 SEQ IN NO:13輕鏈和SEQ IN NO:14重鏈氨基酸序列的載體，此處命名為pBT_antiHer2，由上海捷瑞生物工程有限公司合成)為模板，設(shè)計并合成以下引物:
PantiHer2LF: 5， -TCAGTCGACCGGTGACATCCAGATGACCCAGAG-3，
PantiHer2LR: 5’ - GACGGATCCTAACACTCTCCCCTGTTGA -3’其中下劃線部分分別為Sal I及BamHI的酶切位點，將擴增到的PCR產(chǎn)物ant iHer2輕鏈即antiHer2L片段定向插入pTSE_w載體的SalI與BamHI位點之間，得到pTSE-antiHer2L_w0
[0050]以構(gòu)建好的pTSE-antiHer2L_w為模板,設(shè)計并合成以下引物:
PLEUF: 5’ - TTGCTCACATGTTCTTTCCTG -3’
PLEUR: 5’ -GATCTCGACCAAATGATTTGC-3’
下劃線部分為PciI酶切位點，以PTSE-antiHer2L-w為模板，PLEUF及PLEUR擴增得到antiHer2 輕鏈的整個表達單兀 “pCMV-leader_antiHer2L- polyA”。
[0051]2.2.2 pSNE0_antiHer2H 的構(gòu)建
以pBT-antiHer2質(zhì)粒為模板,設(shè)計并合成以下引物:
PherceptinVHF:5’ -TCAGTCGACCGGTGAGGTGCAGCTGGTGG-3，
PherceptinCHR:5’ -GACGGATCCTCAACCCGGGGACAGGGAGAGG-3，
其中下劃線部分分別為SalI及BamHI的酶切位點，將擴增的antiHer2重鏈片段antiHer2H定向插入pSNEO載體的SalI及BamHI酶切位點之間，得到載體pSNE0-antiHer2Ho
[0052]2.2.3 pSNE0-antiHer2 構(gòu)建
將上述2.2.1擴增得到的ant1`-Her2輕鏈表達單元PciI酶切后定向插入到pSNE0-antiHer2H的PciI及EcoRV之間，得到正確的pSNE0_antiHer2載體，如圖8所示。
[0053]將pSNE0_antiHer2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CH0-S細胞，具體的轉(zhuǎn)染過程參考pSNE0_TNF的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染及篩選過程如下:為了獲得高表達的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，我們將起始轉(zhuǎn)染細胞數(shù)擴大為6 X IO6個細胞，轉(zhuǎn)染24h后，以1:10的比例將轉(zhuǎn)染的細胞傳代至150mm細胞培養(yǎng)皿中，傳代24h后換成篩選培養(yǎng)基進行篩選，篩選培養(yǎng)基是含10%FBS、4mMGlutamine和500ug/mlG418的IMDM培養(yǎng)基；接下來每2-3天更換篩選培養(yǎng)基，10-14天后可見清晰的單克隆形成，此時我們通過消化傳代，將150mm細胞培養(yǎng)皿中的單克隆混在一起形成混合克隆，即clonepool，計數(shù)后通過有限稀釋法將細胞稀釋到5個/ml，于96孔細胞培養(yǎng)板中每孔接種200ul稀釋的細胞懸液，共接種10板96孔板，每板單克隆的形成率為30%左右。7天后，通過ELISA方法進行穩(wěn)定表達細胞株的初篩。
[0054]具體ELISA方法如下:將山羊抗人純化IgG(購自中杉金橋)用包被液稀釋，IOOul/孔包被ELISA親和96孔板，4°C包被過夜；接著以200ul/孔的封閉液(PBST+1%BSA)37°C封閉Ih ；PBST洗板3次，將待測樣品等量稀釋后IOOul/孔加入96孔板，37°C孵育Ih ；PBST洗板3-4次；將辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG 二抗(購自中杉金橋)以1:10000的比例稀釋至PBST中配成二抗工作液，每孔加入二抗工作液IOOul，37°C孵育30min_lh ；PBST洗板3-4遍；用TMB底物顯色試劑盒(購自康為世紀(jì)，Cat.N0.CW0050)中的試劑配置的顯色工作液顯色，0.5MH2S04終止顯色，于酶標(biāo)儀上測0D450及0D630值。
[0055]通過一輪初篩后挑選表達antiHer2抗體的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，比較選擇后挑選相對表達量高的單克隆10個，擴大培養(yǎng)到12孔板中，待細胞匯合度達到90%左右，進行細胞計數(shù)，以I X 105/ml細胞每孔接種Iml至24孔板，24h后收取上清，通過ELISA方法進行表達分析，表達antiHer2蛋白的10株細胞株表達量在6.5_18pg/cell/day,具體的表達結(jié)果如圖9所示。
【權(quán)利要求】
1.一種真核表達載體，該載體是以PTSE載體為基礎(chǔ)改造獲得，其特征在于，該載體包括表達弱化的篩選基因表達框和表達增強的目的基因表達框，該載體被命名為pSNEO。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的真核表達載體，其特征在于，表達弱化的篩選基因表達框依次含有弱化的SV40啟動子、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、篩選基因、SV40 polyA加尾信號；表達增強的目的基因表達框依次含有CMV啟動子，多克隆位點，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件WPRE和rabbit beta-globinpolyA加尾信號。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的真核表達載體，其特征在于，所述弱化的SV40啟動子核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述的發(fā)夾結(jié)構(gòu)核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述WPRE核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的真核表達載體，其特征在于，篩選基因是新霉素抗性基因ΝΕΟ。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的真核表達載體，其特征在于，所述PTSE載體為如圖1所示的載體，其構(gòu)建步驟如下: (1)以pTT載體為基礎(chǔ)，消除EcoRI酶切位點和SalI酶切位點，所得載體命名為pTT'載體； (2)合成含信號肽及多克隆位點的序列，PmeI及BamHI雙酶切該序列后定向克隆入pTT'載體的PmeI及BamH I之間，所述多克隆位點包括Sal1、Age1、Kas1、HindIII及BamHI，所得載體命名為PTSE載體。
6.構(gòu)建權(quán)利要求1所述真核表達載體的方法，具體步驟如下: (1)在目的基因表達框的多克隆位點與rabbitbeta-globin polyA之間定向克隆入WPRE,構(gòu)建含WPRE序列的表達載體，命名為pTSE-w ； (2)由PcDNA3.1+ 制備篩選表達單位 SV40' -NE0-SV40polyA ； (3)在NEO基因翻譯起始位點ATG前引入可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的序列，構(gòu)建真核表達載體命名為pSNEO。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的真核表達載體用于單基因或雙基因的表達中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的真核表達載體用于構(gòu)建哺乳動物細胞高表達細胞株中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N5/10GK103525868SQ201310486380
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月17日
【發(fā)明者】孟艷敏, 劉志剛, 王康, 任秀梅, 高震, 郭晶晶, 彭博, 白先宏 申請人:百泰生物藥業(yè)有限公司