構(gòu)建和培育耐鹽草坪草的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種構(gòu)建和培育耐鹽草坪草的方法，其特征在于，包括以下步驟：（一）、構(gòu)建農(nóng)桿菌重組二元質(zhì)粒：將擬南芥SOS1，SOS2，SOS3，CBL10完整的表達(dá)基因克隆，并將其植入大腸桿菌二元質(zhì)粒，獲得重組二元質(zhì)粒；（二）、轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌和草坪草：將重組二元質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，并感染草坪草愈傷組織；（三）、選擇和培育轉(zhuǎn)基因草坪草。本發(fā)明的有益之處在于：轉(zhuǎn)基因耐鹽草坪草的構(gòu)建和培育為改良鹽堿地提供了一個(gè)新途徑，它使鹽堿地的改良工程提升到了高新科技的基因工程；這種方法的投入量很少，并且無性繁殖使它具有了不可估量的長(zhǎng)遠(yuǎn)效益。
【專利說明】構(gòu)建和培育耐鹽草坪草的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種構(gòu)建和培育耐鹽草坪草的方法，屬于生物轉(zhuǎn)基因【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，我國耕地有18億畝，鹽堿地面積占到5.4億畝，我國西部地區(qū)地處干旱半干旱地區(qū)，由于干旱缺水，鹽堿化、荒漠化現(xiàn)象嚴(yán)重。同時(shí)，由于近幾年來氣候原因，全球變暖和人類的活動(dòng)，使得全國耕地面積變化總體呈現(xiàn)一種下降的趨勢(shì)，這種現(xiàn)象也日趨嚴(yán)重，已經(jīng)成為亟待解決的世界性問題。
[0003]現(xiàn)有改善鹽堿地的主要方法是構(gòu)建大量的排水網(wǎng)絡(luò)，使地表鹽分隨著灌溉水或降雨流入低處，以及將脫硫渣摻入鹽堿地，改善土壤PH值，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。但是所有這些方法需要大量的前期投入。
[0004]草坪草作為重要的禾本科草本植物，具有很多優(yōu)點(diǎn)，是現(xiàn)代化都市中不可缺少的生態(tài)環(huán)境組成部分。不僅具有保持水土、改造自然、美化環(huán)境、改善生態(tài)環(huán)境等功能，而且可以提供高質(zhì)量的運(yùn)動(dòng)和休憩場(chǎng)地。長(zhǎng)期種植還可以改良鹽堿土壤，防止水土流失，增加土壤的肥沃度、保護(hù)生態(tài)環(huán)境。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于利用基因工程的方法構(gòu)建并培育能耐較高鹽分的草坪草的方法，從而改善和利用鹽堿地。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案:
[0007]一種構(gòu)建和培育耐鹽草坪草的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0008](一)、構(gòu)建農(nóng)桿菌重組二元質(zhì)粒:將擬南芥S0S1，S0S2,S0S3, CBLlO完整的表達(dá)基因克隆，并將其植入大腸桿菌二元質(zhì)粒，獲得重組二元質(zhì)粒；
[0009](二)、轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌和草坪草:將重組二元質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，并感染草坪草愈傷組織；
[0010](三)、選擇和培育轉(zhuǎn)基因草坪草。
[0011 ] 前述的構(gòu)建和培育耐鹽草坪草的方法，其特征在于，在步驟(一沖，選擇KEGT-A作為重組二元質(zhì)?；究蚣埽贙EGT-A插入選擇基因BAR基因。
[0012]前述的構(gòu)建和培育耐鹽草坪草的方法，其特征在于，重組二元質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)為:
[0013]RB 基因-TM220 基因-SOSl 基因-S0S3 基因-S0S2 基因-TMl 基因-CBLlO 基因-TM2基因-BAR基因-TM220基因-LB基因。
[0014]前述的構(gòu)建和培育耐鹽草坪草的方法，其特征在于，在步驟(二)中，前述的草坪草愈傷組織由草坪草 種子在MS+5.5ml/L2, 4_D培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化而來。
[0015]前述的構(gòu)建和培育耐鹽草坪草的方法，其特征在于，在步驟(三)中，前述的轉(zhuǎn)基因草坪草在MS+2.0ml/L6-BA+l.0ml/L KT培養(yǎng)基中分化出幼芽。
[0016]前述的構(gòu)建和培育耐鹽草坪草的方法，其特征在于，在步驟(三)中，前述的轉(zhuǎn)基因草坪草在1/2MS+0.3ml/L IBA培養(yǎng)基中分化出根，前述MS培養(yǎng)基的鐵鹽加倍。
[0017]本發(fā)明的有益之處在于:轉(zhuǎn)基因耐鹽草坪草的構(gòu)建和培育為改良鹽堿地提供了一個(gè)新途徑，它使鹽堿地的改良工程提升到了高新科技的基因工程；這種方法的投入量很少，并且無性繁殖使它具有了不可估量的長(zhǎng)遠(yuǎn)效益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是本發(fā)明的構(gòu)建和培育耐鹽草坪草的方法的流程圖；
[0019]圖2是二元重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0020]圖3是轉(zhuǎn)基因苜?；蚪MDNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0021]圖4是SOSl基因PCR擴(kuò)增電泳圖；
[0022]圖5是S0S2基因PCR擴(kuò) 增電泳圖；
[0023]圖6是S0S3基因PCR擴(kuò)增電泳圖；
[0024]圖7是CBLlO基因PCR擴(kuò)增電泳圖；
[0025]圖8是Southern雜交結(jié)果圖；
[0026]圖9是Northern雜交中SOSl基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)結(jié)果圖；
[0027]圖10是Northern雜交中S0S2基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)結(jié)果圖；
[0028]圖11是Northern雜交中S0S3基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)結(jié)果圖；
[0029]圖12是Northern雜交中CBL10基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030]以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作具體的介紹。
[0031]參照?qǐng)D1，本發(fā)明的構(gòu)建和培育耐鹽草坪草的方法，包括以下步驟:
[0032](一)、構(gòu)建農(nóng)桿菌重組二元質(zhì)粒:將擬南芥S0S1，S0S2,S0S3, CBL10完整的表達(dá)基因克隆，并將其植入大腸桿菌二元質(zhì)粒，獲得重組二元質(zhì)粒；
[0033](二)、轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌和草坪草:將重組二元質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，并感染草坪草愈傷組織；
[0034](三)、選擇和培育轉(zhuǎn)基因草坪草。
[0035]下面以高羊茅為例進(jìn)行說明，其他草坪草的操作一樣。
[0036]首先，用PCR將擬南芥SOS基因的完整編碼序列從它的cDNA克隆中擴(kuò)增。
[0037]根據(jù)bar、S0S1、S0S2、S0S3、CBL10基因序列，PCR合成引物如下:
[0038]BarF:GCG GTC TGC ACC ATC GTC A
[0039]BarR:GTA CCG GCA GGC TGA AGT CCA
[0040]S0S1-R:5，CCT GCC AAA GGA AAT CAT C3，
[0041]S0S1-F:5’GCT TGC TAC ATT TCT GCT G3’
[0042]S0S2-R:5' CCA TTG AGT TCG CTA CAG C3’
[0043]S0S2-F:5’ TTA GTG GAC AGG GTT ACG A3’
[0044]S0S3-F:5'GGG ATG GGC TGC TCT GTA TCG AAG3’
[0045]S0S3-R:5'ACC ACC GAG CTC TAG GAA GAT ACG3’
[0046]CBL10-F:5，GCA ATT CTG CGC CGT CTT TAT ACC3，[0047]CBLlO-R:5’CAT TTG TTG CAC CTC TTC TCG CTC3’
[0048]PCR反應(yīng)條件如下:
[0049]在25μ I的PCR反應(yīng)管中，加入下述反應(yīng)試劑:0.5μ I Taq酶，2.0 μ I引物，2.0 μ IdNTP，2.5μ 110 X buffer, 1.0μ I 模板和 17.0 μ lddH20。
[0050](I) bar基因PCR反應(yīng)程序如下:
[0051]94°C 預(yù)變性 5min ；
[0052]94。(:變性 30sec ；
[0053]58°C退火 3Osec;
[0054]72°C 延伸 Imin ；
[0055]72? 延伸 5min ；
[0056]循環(huán)數(shù):30；
[0057]4°C保存。PCR擴(kuò)增后將獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)并在凝膠成像儀上照相。
[0058](2) SOSl基因PCR反應(yīng)程序如下:
[0059]94°C 預(yù)變性 5min ；
[0060]94。(:變性 30sec ；
[0061]53°C退火 50sec ;
[0062]72? 延伸 Imin ；
[0063]72°C 延伸 5min ；
[0064]循環(huán)數(shù):30；
[0065]4°C保存。PCR擴(kuò)增后將獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)并在凝膠成像儀上照相。
[0066](3) S0S2基因PCR反應(yīng)程序如下:
[0067]94°C 預(yù)變性 5min ；
[0068]94。(:變性 30sec ；
[0069]52°C退火 30sec
[0070]72。(:延伸 Imin ；
[0071]72。〇延伸511^11;
[0072]循環(huán)數(shù):30；
[0073]4°C保存。PCR擴(kuò)增后將獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)并在凝膠成像儀上照相。
[0074](4) S0S3基因PCR反應(yīng)程序如下:
[0075]94°C 預(yù)變性 5min ；
[0076]94。(:變性 30sec ；
[0077]59O退火 3Osec;
[0078]72。(:延伸 Imin ；
[0079]72 O 延伸 5 min ；
[0080]循環(huán)數(shù):30；
[0081]4°C保存。PCR擴(kuò)增后將獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)并在凝膠成像儀上照相。
[0082](5) CBLlO基因PCR反應(yīng)程序如下:
[0083]94。0預(yù)變性511^11;
[0084]94?變性 30sec ；
[0085]57。〇退火3086。；
[0086]72 O 延伸 Imin ；
[0087]72 O 延伸 5min ；
[0088]循環(huán)數(shù):30；
[0089]4°C保存。PCR擴(kuò)增后 將獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)并在凝膠成像儀上照相。
[0090]然后，選擇KEGT-A作為重組二元質(zhì)粒基本框架，在KEGT-A插入選擇基因bar基因。重組二元質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)如圖2所示。
[0091]接下來，含有SOS基因的重組二元質(zhì)粒先被用來轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌；重組農(nóng)桿菌再被用來轉(zhuǎn)化草坪草愈傷組織。該愈傷組織在含有植物激素的培養(yǎng)基中長(zhǎng)成整株轉(zhuǎn)基因草坪草。具體過程如下:
[0092]1、草坪草種子在MS+5.5ml/L2, 4_D培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化為愈傷組織。
[0093]MS培養(yǎng)基含有以下成分:
[0094](I) 100ml/L 大量元素(10 X 大量元素含有 KN0319g/L ；NH4N0316.5g/L ；CaCL23.33g/L ；MgS04.7H203.7g/L ；KH2P041.7g/L)，
[0095](2)101111/1微量元素(100\ 微量元素含有 MnS04.4H202230mg/L ；KI83mg/L；H3B03620mg/L ；ZnS04.7H20860mg/L ；Na2Mo04.2H2025mg/L ；CuS04.5H202.5mg/L ；CoCL2.6H202.5mg/L),
[0096](3) lOml/L 鐵鹽(100X 鐵鹽含有 FeS04 *7H202780mg/L ;Na2_EDTA *2H203730mg/L),
[0097](4) lOml/L有機(jī)成分(100X有機(jī)成分含有IV A肌醇10g/L ；IV B煙酸50mg/L ;維生素 B650mg/L ;維生素 B110mg/L ;甘氨酸 200mg/L)，
[0098]pH 為 5.8。
[0099]2、轉(zhuǎn)基因草坪草在MS+2.0ml/L6-BA+l.0ml/L KT培養(yǎng)基中分化出幼芽。
[0100]3、轉(zhuǎn)基因草坪草在1/2MS (鐵鹽加倍)+0.3ml/L IBA培養(yǎng)基中分化出根。
[0101]再然后，我們分別用了 PCR、Southern雜交、Northern印跡雜交來證實(shí)轉(zhuǎn)基因草坪草中含有擬南芥SOS基因,且其聞效表達(dá)。分別說明如下:
[0102]1、PCR擴(kuò)增時(shí)，模板為轉(zhuǎn)基因苜蓿基因組DNA (P1-P7)，陽性對(duì)照(CK+)為質(zhì)粒基因組DNA，陰性對(duì)照(CK-)為野生型草坪草基因組DNA。PCR結(jié)果見圖3至圖7。
[0103]2、Southern雜交時(shí)，模板為轉(zhuǎn)基因苜?；蚪MDNA (P1、P2)，陽性對(duì)照(CK+)為質(zhì)粒基因組DNA，陰性對(duì)照(CK-)為野生型草坪草基因組DNA。具體的反應(yīng)條件如下:
[0104]Southern 試劑配制:
[0105]變性液:1.5mol/L NaCl ;0.5mol/L NaOH
[0106]中和液:lmol/LTris-Cl (pH8.0) ；1.5mol/L NaCl
[0107]轉(zhuǎn)移液(20XSSC):3mol/L NaCl ;0.3mol/L檸檬酸鈉；pH7.0 (高壓滅菌，室溫保存)
[0108]10%SDS (配制時(shí)68°C加熱助溶，濃鹽酸調(diào)pH至7.2，定容室溫保存)
[0109]洗膜緩沖液1:2 X SSC ；0.1%SDS (用 20 X SSC 和 10%SDS 溶液配制)
[0110]洗膜緩沖液2:0.5 X SSC ；0.1%SDS (用 20 X SSC 和 10%SDS 溶液配制)
[0111]洗液(washingsolution):0.lmol/L Maleic acid (馬來酸)；0.15mol/L NaCl ；ρΗ7.520°C) ；0.3%Tween20
[0112]Maleic acid buffer (馬來酸緩沖液):0.lmol/L Maleic acid ;0.15mol/LNaCl ；pH7.5 (20。。)(固體 NaOH 調(diào) pH 至 7.5)
[0113]Detection buffer:0.lmol/L Tris-Cl ；0.lmol/L NaCl ；pH7.5 (20°C )
[0114]I)制備探針
[0115]提取帶有目的基因的質(zhì)粒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增bar (460bp)，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收(方法參考天根公司提供的回收試劑盒)。取2ul DNA加滅菌去離子水至16 μ I在開水中溫育IOmin,然后在冰水浴中驟冷。
[0116]反應(yīng)體系:
[0117]
【權(quán)利要求】
1.構(gòu)建和培育耐鹽草坪草的方法，其特征在于，包括以下步驟: (一)、構(gòu)建農(nóng)桿菌重組二元質(zhì)粒:將擬南芥S0S1，S0S2,S0S3, CBLlO完整的表達(dá)基因克隆，并將其植入大腸桿菌二元質(zhì)粒，獲得重組二元質(zhì)粒； (二)、轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌和草坪草:將重組二元質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，并感染草坪草愈傷組織； (三)、選擇和培育轉(zhuǎn)基因草坪草。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建和培育耐鹽草坪草的方法，其特征在于，在步驟(一)中，選擇KEGT-A作為重組二元質(zhì)?；究蚣埽贙EGT-A插入選擇基因BAR基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建和培育耐鹽草坪草的方法，其特征在于，重組二元質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)為: RB基因-TM220基因-SOSl基因-S0S3基因-S0S2基因-TMl基因-CBLlO基因-TM2基因-BAR基因-TM220基因-LB基因。
4.根據(jù)權(quán) 利要求1所述的構(gòu)建和培育耐鹽草坪草的方法，其特征在于，在步驟(二)中，所述的草坪草愈傷組織由草坪草種子在MS+5.5ml/L2, 4_D培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化而來。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建和培育耐鹽草坪草的方法，其特征在于，在步驟(三)中，所述的轉(zhuǎn)基因草坪草在MS+2.0ml/L6-BA+l.0ml/L KT培養(yǎng)基中分化出幼芽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建和培育耐鹽草坪草的方法，其特征在于，在步驟(三)中，所述的轉(zhuǎn)基因草坪草在1/2MS+0.3ml/L IBA培養(yǎng)基中分化出根，所述MS培養(yǎng)基的鐵鹽加倍。
【文檔編號(hào)】C12N15/84GK103540610SQ201310488229
【公開日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2013年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月17日
【發(fā)明者】麻冬梅, 許興, 郭伶娜, 蔡進(jìn)軍, 楊亞亞 申請(qǐng)人:寧夏大學(xué)