Baff基因?qū)崟r(shí)熒光pcr檢測(cè)引物和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種BAFF基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)引物，正向引物如SEQ?ID?NO.1所示；反向引物如SEQ?ID?NO.2所示；還提供給了一種利用本引物對(duì)進(jìn)行BAFF基因進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)的試劑盒，該試劑盒包括一種檢測(cè)溶液，其檢測(cè)溶液含有含SYBR?Premix?Ex?Taq(2×)、正向引物10μM、反向引物10μM、Rox?Dye。本發(fā)明采用SYBR?Green?I實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，對(duì)BAFF基因進(jìn)行鑒定，具有檢測(cè)實(shí)時(shí)性和高效性，并可以對(duì)早期BAFF基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，用于早期判斷自身免疫性疾病。本發(fā)明采用SYBR?Green?I實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，對(duì)APRIL基因進(jìn)行鑒定，具有檢測(cè)實(shí)時(shí)性和高效性，并可以對(duì)早期APRIL基因表達(dá)進(jìn)行快速檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】BAFF基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)引物和試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及基因檢測(cè)方法，尤其是涉及BAFF基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)方法及其相關(guān)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]BAFF (B cell activation factor)，B細(xì)胞激活因子，腫瘤壞死因子家族成員，屬于II跨膜蛋白，與同屬于同一家族的APRIL有高度的同源性，在結(jié)構(gòu)上兩者是通過(guò)不同的D-E環(huán)結(jié)合它們共同受體，從而導(dǎo)致不同親和。經(jīng)蛋白酶水解形成可溶性[16]，可溶性BAFF在血清中主要是以三聚體的形式存在[M.Cao，P.Cao，H.Yanet al.,ApplBiochemBiotechnol, 2009, 157 (3):562-574]，是由免疫細(xì)胞分泌，包括肥大細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞，DC細(xì)胞及B和T細(xì)胞等。BAFF促進(jìn)B細(xì)胞及T細(xì)胞的增殖及分化，對(duì)成熟B細(xì)胞產(chǎn)生及維持有重要的作用，基因擾亂BAFF基因會(huì)導(dǎo)致成熟B2細(xì)胞和MZ B細(xì)胞明顯的缺陷[Y.Laabi, A.Strasser, Science, 2000，289 (5481):883-884]。BAFF 可以結(jié)合 TNFR 家族的三種受體:TACI (transmembrane activator, calcium modulator, and cyclophilin ligandinteractor),BCMACB cell maturation Ag)和 BAFF-R(BAFF-receptor)。 TACI 和 BCMA 也可以結(jié)合APRIL，BCMA和TACI對(duì)B細(xì)胞的成熟及發(fā)育是必不可少，另外有研究表明TACI是BAFF負(fù)調(diào)節(jié)受體，引起B(yǎng)細(xì)胞的凋亡，調(diào)節(jié)B細(xì)胞的穩(wěn)定。B細(xì)胞增殖主要是通過(guò)是由BAFF的第三受體BAFF-R進(jìn)行誘導(dǎo)。
[0003]BAFF也參與自身免疫性疾病的發(fā)展。在自身免疫性疾病，如SLE，RA，病人血清中發(fā)現(xiàn)BAFF明顯高于正常人，在BA FF的轉(zhuǎn)基因小鼠中出現(xiàn)了嚴(yán)重的淋巴細(xì)胞紊亂和自身免疫性疾病的癥狀。BAFF的過(guò)量表達(dá)會(huì)促進(jìn)低親和性的自身反應(yīng)B細(xì)胞的聚集，也會(huì)促進(jìn)T細(xì)胞的過(guò)度活化，分化為效應(yīng)T細(xì)胞，及抗凋亡因子Bcl2的表達(dá)和Thl細(xì)胞因子的分泌，從而引起自身免疫系統(tǒng)的紊亂；目前對(duì)于BAFF過(guò)量表達(dá)主要是通過(guò)血清濃度的直接檢測(cè)，檢測(cè)周期長(zhǎng)，并且沒(méi)有在國(guó)內(nèi)醫(yī)院系統(tǒng)內(nèi)大范圍的使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明目的在于提供一種方便和快捷檢測(cè)BAFF基因表達(dá)的引物和試劑盒。
[0005]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
[0006]BAFF基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)引物:
[0007]正向引物(SEQID N0.1):GATGACT CCACAGAAAG
[0008]反向引物(SEQID N0.2):ACAGCAGTTTCAAGC ；
[0009]并利用上述引物對(duì)進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)的試劑盒，試劑盒包括一種檢測(cè)溶液，其檢測(cè)溶液含有含SYBR Premix Ex Taq(2X)、正向引物10 ii M、反向引物10 ii M、Rox Dye(50X)；
[0010]其中所述正向引物和方向引物為上訴的引物對(duì)。[0011]利用本試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的步驟如下:
[0012]I)提取待檢測(cè)樣品的RNA，并反轉(zhuǎn)錄DNA溶液。
[0013]2)反應(yīng)體系:取2ul步驟I)中所得的DNA溶液，并與上述試劑盒中的檢測(cè)溶液14ul進(jìn)行混合，并加入無(wú)菌超純水至反應(yīng)體積20ul ;加入到實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)管中，進(jìn)行離心；
[0014]3)將步驟2)的反應(yīng)體系按照下述條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè):
[0015]預(yù)變性940C /30s, I次循環(huán)；變性950C /5s，延伸66°C /100s，40次循環(huán)。
[0016]本發(fā)明采用SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，對(duì)BAFF基因進(jìn)行鑒定，具有檢測(cè)實(shí)時(shí)性和高效性，并可以對(duì)早期BAFF基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，用于早期判斷自身免疫性疾病，另外可以對(duì)病人進(jìn)行個(gè)性診斷和治療過(guò)程中，BAFF的基因表達(dá)情況的檢測(cè)，并判斷病人復(fù)發(fā)和加重病情的可能性。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1檢測(cè)試劑實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)特異性擴(kuò)增曲線；
[0018]圖2是實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增數(shù)值對(duì)比；
[0019]圖3是陰性對(duì)照和檢測(cè)樣品ELISA檢測(cè)對(duì)比。
【具體實(shí)施方式】
[0020]根據(jù)實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0021]實(shí)施例1所示:`
[0022]1.設(shè)計(jì)BAFF基因?qū)崟r(shí)熒光檢測(cè)引物，針對(duì)BAFF cDNA的胞外區(qū)進(jìn)行設(shè)計(jì)引物:
[0023]正向引物:GATGACTCCACAGAAAG
[0024]反向引物:ACAGCAGITTCAAGC；
[0025]2.構(gòu)建利用上述引物對(duì)進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)的試劑盒，試劑盒包括一種檢測(cè)溶液，其檢測(cè)溶液含有含SYBR Premix Ex Taq(2X)、正向引物10 ii M、反向引物10 ii M、Rox Dye(50X)；
[0026]3.檢驗(yàn)樣品的制備
[0027]離心待檢測(cè)樣品和陰性對(duì)照血液，提取下層細(xì)胞的RNA，并反轉(zhuǎn)錄cDNA溶液，低溫保存?zhèn)溆?；其中檢測(cè)樣品取自系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人血液(1-6)作為檢測(cè)對(duì)象，取6份正常人血清陰性對(duì)照。
[0028]4.PCR 反應(yīng)
[0029]取2ul步驟3)中所得的cDNA溶液，并與上述試劑盒中的檢測(cè)溶液14ul進(jìn)行混合，并加入無(wú)菌超純水至反應(yīng)體積20ul ;加入到實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)管中，進(jìn)行離心；
[0030]預(yù)變性94°C /30s, I次循環(huán)；變性95°C /5s，延伸66°C /100s，40次循環(huán)。
[0031]4.結(jié)果判斷和分析。
[0032]如圖1所示的PCR擴(kuò)增曲線，附圖2對(duì)陰性對(duì)照和病人進(jìn)行熒光性比對(duì)分析。圖1所示的擴(kuò)增曲線表相本引物對(duì)具有良好的特異性，如附圖2所示，檢測(cè)樣品1-6具有較陰性對(duì)照具有較高的BAFF基因表達(dá)情況。
[0033]5.對(duì)病人樣品中的血清利用BAFF抗體進(jìn)行ELISA驗(yàn)證檢測(cè)，所述的BAFF抗體購(gòu)自BioVision公司。如附圖3所示，其中“***”表示p〈0.001，具有明顯性差異，其中樣品6沒(méi)有顯著性差異；如樣品6外，ELISA檢測(cè)結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的趨勢(shì)相符。
[0034]其中，利用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)BAFF基因表達(dá)后，分析檢測(cè)樣品1_6相對(duì)于陰性對(duì)照具有顯著的差異，利用ELISA驗(yàn)證時(shí)，確定病人1-5血清中BAFF的濃度較高，進(jìn)而判斷為BAFF依賴性系統(tǒng)自身免疫性疾病，針對(duì)BAFF進(jìn)行藥物使用；對(duì)病人6再進(jìn)行其他方面的分析。
[0035]上述實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述的引物對(duì)具有良好的特異性，可用于BAFF基因表達(dá)檢測(cè)，用于區(qū)別病人 自身免疫性疾病的病因。
【權(quán)利要求】
1.BAFF基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)引物，其特征是:正向引物如SEQ ID N0.1所示; 反向引物如SEQ ID N0.2所示。
2.BAFF基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)的試劑盒，其特征是:試劑盒包括一種檢測(cè)溶液，其檢測(cè)溶液含有含 SYBR Premix Ex Taq(2X)、正向引物 10 ii M、反向引物 10 ii M、Rox Dye (50X)； 其中所述正向引物和反向引物為權(quán)利要求1所示引物。
3.BAFF基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，利用權(quán)利要求2所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，其特征是，具體步驟如下: 1)提取待檢測(cè)樣品的RNA，并反轉(zhuǎn)錄DNA溶液； 2)反應(yīng)體系:取2ul步驟I)中所得的DNA溶液，并與權(quán)利要求2所述試劑盒中的檢測(cè)溶液14ul進(jìn)行混合，并加入無(wú)菌超純水至反應(yīng)體積20ul ;加入到實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)管中，進(jìn)行離心； 3)將步驟2)的反應(yīng)體系按照下述條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的條件如下: 預(yù)變性940C /30s, I次循環(huán)；變性950C /5s，延伸66V /100s，40次循環(huán)。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103498001SQ201310488978
【公開(kāi)日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2013年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月17日
【發(fā)明者】于惠, 管淑紅, 李艷麗 申請(qǐng)人:于惠