一種用于抑制內(nèi)皮細(xì)胞分化的蟾皮鈣調(diào)素結(jié)合蛋白edf-1編碼基因的克隆方法
【專利摘要】一種用于抑制內(nèi)皮細(xì)胞分化的蟾皮鈣調(diào)素結(jié)合蛋白EDF-1編碼基因的克隆方法，屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。以從蟾蜍的皮膚第一鏈cDNA為模板實(shí)施PCR，將獲得的PCR產(chǎn)物與轉(zhuǎn)化至E.coli感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)篩選陽(yáng)性的菌落，質(zhì)?；厥占懊盖?，獲得能用于抑制內(nèi)皮細(xì)胞分化的蟾皮鈣調(diào)素結(jié)合蛋白EDF-1編碼基因，其工藝簡(jiǎn)便，原料充足，獲得的編碼基因性能穩(wěn)定。
【專利說(shuō)明】—種用于抑制內(nèi)皮細(xì)胞分化的蟾皮鈣調(diào)素結(jié)合蛋白EDF-1編碼基因的克隆方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種用于抑制內(nèi)皮細(xì)胞分化的蟾皮鈣調(diào)素結(jié)合蛋白EDF-1編碼基因的克隆方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蟾蜍基原的我國(guó)傳統(tǒng)中藥材蟾酥、蟾皮和蟾衣等具有消炎、止痛、抗腫瘤等作用。近年的試驗(yàn)及臨床研究表明，它們可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化以及抑制腫瘤血管 形成等作用。外用蟾酥在治療體表腫瘤及癌癥中也具有良好的療效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究還表明，蟾皮的藥理活性強(qiáng)，在抗腫瘤及治療心血管疾病方面具有重要作用。
[0003]近幾年來(lái)，發(fā)明人從事蟾蜍皮膚多肽類有效成分的研究，以日本蟾蜍(Bufojaponicus formosus)皮膚 cDNA 質(zhì)粒文庫(kù)為模板，通過(guò)菌落 PCR (polymerase chainreaction)篩選具有完整開放閱讀框(open reading frame, 0RF)的cDNA。同時(shí)，為拓展中華大蟾蜍(B.gargarizans)的藥用價(jià)值及后續(xù)研究中的取材方便，合成中華大蟾蜍背部皮膚第一鏈cDNA，進(jìn)行其相關(guān)基因的克隆。內(nèi)皮分化相關(guān)因子-1 (EndothelialDifferentiation-related Factor-1, EDF-1)是一種鈣調(diào)素(calmodulin, CaM)結(jié)合蛋白，參與抑制內(nèi)皮細(xì)胞的分化的過(guò)程。血管生成是指從現(xiàn)有血管形成新的毛細(xì)血管的過(guò)程，在生理和病理?xiàng)l件下均會(huì)發(fā)生。而這個(gè)復(fù)雜的過(guò)程需要內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，并分化成管狀結(jié)構(gòu)。所以，從某種角度看，EDF-1參與腫瘤發(fā)育和演進(jìn)過(guò)程，并起到抑制作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種用于抑制內(nèi)皮細(xì)胞分化的蟾皮鈣調(diào)素結(jié)合蛋白EDF-1編碼基因的克隆方法的技術(shù)方案，其性能穩(wěn)定、方法簡(jiǎn)單快捷，獲得的EDF-1含量高。
[0005]所述的一種用于抑制內(nèi)皮細(xì)胞分化的蟾皮鈣調(diào)素結(jié)合蛋白EDF-1編碼基因的克隆方法，其特征在于包括以下步驟:
I)將蟾蜍清洗處死，取其背部皮膚剪成小塊后投入液氮中速凍9-15h，置于_70°C超低溫冰箱保存?zhèn)溆茫?br> 2)稱取步驟I)中一小塊蟾蜍背部皮膚，按RNA提取試劑盒說(shuō)明提取其總RNA，用Quantscript RT kit合成其皮膚第一鏈cDNA,備用；
3)根據(jù)蟾蜍其他兩棲類EDF-lcDNA序列設(shè)計(jì)上、下游引物，取步驟2)中第一鏈cDNA 0.8-1.5 μ L，加滅菌超純水至18-22 μ L，加入與第一鏈cDNA等量的上、下游引物，在50-98°C循環(huán)實(shí)施PCR60-80min ;反應(yīng)結(jié)束后，取一部分PCR產(chǎn)物與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化至E.coli感受態(tài)細(xì)胞DH5，然后取2-5mL轉(zhuǎn)化液均勻涂布于LB瓊脂盤上，并在37°C恒溫培養(yǎng)14-18h，挑取白色菌落接種于10-15mL LB培養(yǎng)基中，實(shí)施菌落PCR，將通過(guò)菌落PCR確定為陽(yáng)性的菌落0.2-05mL接種于2-4mL含100mg/mL氨芐青霉素-的LB培養(yǎng)液中，再次37°C恒溫振蕩培養(yǎng)14_18h，然后使用試劑盒進(jìn)行質(zhì)?；厥詹?duì)其進(jìn)行EcoR I和Xho I雙酶切，SP可。
[0006]所述的一種用于抑制內(nèi)皮細(xì)胞分化的蟾皮鈣調(diào)素結(jié)合蛋白EDF-1編碼基因的克隆方法，其特征在于蟾蜍皮膚液氮中速凍時(shí)間為10-14h，優(yōu)選為ll-13h。
[0007]所述的一種用于抑制內(nèi)皮細(xì)胞分化的蟾皮鈣調(diào)素結(jié)合蛋白EDF-1編碼基因的克隆方法，其特征在于PCR的溫度為60-90°C，優(yōu)選65-80°C ；PCR的時(shí)間為65_75min，優(yōu)選68-72min。
[0008]所述的一種用于抑制內(nèi)皮細(xì)胞分化的蟾皮鈣調(diào)素結(jié)合蛋白EDF-1編碼基因的克隆方法，其特征在于轉(zhuǎn)化液均勻涂布于LB瓊脂盤上后在37°C恒溫培養(yǎng)15-16h。
[0009]所述的一種用于抑制內(nèi)皮細(xì)胞分化的蟾皮鈣調(diào)素結(jié)合蛋白EDF-1編碼基因的克隆方法，其特征在于菌落振蕩培養(yǎng)時(shí)間為15_16h。
[0010]上述一種用于抑制內(nèi)皮細(xì)胞分化的蟾皮鈣調(diào)素結(jié)合蛋白EDF-1編碼基因的克隆方法，以從蟾蜍的皮膚第一鏈cDNA為模板實(shí)施PCR，將獲得的PCR產(chǎn)物與轉(zhuǎn)化至E.coli感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)篩選陽(yáng)性的菌落，質(zhì)?；厥占懊盖?，獲得能用于抑制內(nèi)皮細(xì)胞分化的蟾皮鈣調(diào)素結(jié)合蛋白EDF-1編碼基因，其工藝簡(jiǎn)便，原料充足，獲得的編碼基因性能穩(wěn)定。
[0011]本申請(qǐng)文件中涉及的百分含量除另有說(shuō)明外，其它的均為純物質(zhì)的重量百分含量。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1為中華大蟾蜍及F-7 ORF的克?。?br> 圖2為中華大蟾蜍沒F-7 ORF序列及其推導(dǎo)氨基酸序列；
圖1中M:標(biāo)準(zhǔn)DNA; Al: PCR產(chǎn)物；B1: pGM_T_及F_7 EcoR I和ZAo I酶切產(chǎn)物； 圖2中□為起始密碼子和終止密碼子。
[0013]
【具體實(shí)施方式】
[0014]現(xiàn)結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的有益效果。
[0015]實(shí)施例1
將蟾蜍清洗處死，取其背部皮膚剪成小塊后投入液氮中速凍9h，再稱取一小塊蟾蜍背部皮膚，按RNA提取試劑盒說(shuō)明提取其總RNA,用Quantscript RT kit合成其皮膚第一鏈cDNA，然后根據(jù)其他兩棲類EDF-lcDNA序列確設(shè)計(jì)上、下游引物，取第一鏈cDNAl.3 μ L，加滅菌超純水至22 μ L，加入與第一鏈cDNA等量的上、下游引物，在90°C循環(huán)實(shí)施PCR60min。反應(yīng)結(jié)束后，取一部分PCR產(chǎn)物與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化至E.coli感受態(tài)細(xì)胞DH5，然后取
3.5mL轉(zhuǎn)化液均勻涂布于LB瓊脂盤上。并在37°C恒溫培養(yǎng)14h。挑取白色菌落接種于IOmLLB培養(yǎng)基中，實(shí)施菌落PCR。將通過(guò)菌落PCR確定為陽(yáng)性的菌落0.35mL接種于4mL含IOOmg/mL氨芐青霉素-的LB培養(yǎng)液中，再次37°C恒溫振蕩培養(yǎng)15.5h，然后使用試劑盒進(jìn)行質(zhì)?；厥詹?duì)其進(jìn)行EcoR I和Xho I雙酶切，即得鈣調(diào)素結(jié)合蛋白EDF-1的編碼基因。
[0016]實(shí)施例2將蟾蜍清洗處死，取其背部皮膚剪成小塊后投入液氮中速凍15h，再稱取一小塊蟾蜍背部皮膚，按RNA提取試劑盒說(shuō)明提取其總RNA,用Quantscript RT kit合成其皮膚第一鏈cDNA，然后根據(jù)其他兩棲類EDF-lcDNA序列設(shè)計(jì)上、下游引物，取第一鏈cDNA 1.1 μ L，加滅菌超純水至18yL，加入與第一鏈00嫩等量的上、下游引物，在561:循環(huán)實(shí)施？0?801^11。反應(yīng)結(jié)束后，取一部分PCR產(chǎn)物與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化至E.coli感受態(tài)細(xì)胞DH5，然后取
2.5mL轉(zhuǎn)化液均勻涂布于LB瓊脂盤上。并在37°C恒溫培養(yǎng)18h。挑取白色菌落接種于15mLLB培養(yǎng)基中，實(shí)施菌落PCR。將通過(guò)菌落PCR確定為陽(yáng)性的菌落0.25mL接種于2mL含IOOmg/HiL氨芐青霉素-的LB培養(yǎng)液中，再次37°C恒溫振蕩培養(yǎng)17h，然后使用試劑盒進(jìn)行質(zhì)?；厥詹?duì)其進(jìn)行EcoR I和Xho I雙酶切，即得鈣調(diào)素結(jié)合蛋白EDF-1的編碼基因。
[0017]實(shí)施例3 將蟾蜍清洗處死，取其背部皮膚剪成小塊后投入液氮中速凍10h，再稱取一小塊蟾蜍背部皮膚，按RNA提取試劑盒說(shuō)明提取其總RNA,用Quantscript RT kit合成其皮膚第一鏈cDNA，然后根據(jù)其他兩棲類EDF-lcDNA序列設(shè)計(jì)上、下游引物，取第一鏈cDNA 1.0 μ L，加滅菌超純水至19 μ L，加入與第一鏈cDNA等量的上、下游引物，在72°C循環(huán)實(shí)施PCR72min。反應(yīng)結(jié)束后，取一部分PCR產(chǎn)物與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化至E.coli感受態(tài)細(xì)胞DH5，然后取4mL轉(zhuǎn)化液均勻涂布于LB瓊脂盤上。并在37°C恒溫培養(yǎng)15h。挑取白色菌落接種于IlmL LB培養(yǎng)基中，實(shí)施菌落PCR。將通過(guò)菌落PCR確定為陽(yáng)性的菌落0.3mL接種于3mL含IOOmg/mL氨芐青霉素-的LB培養(yǎng)液中，再次37°C恒溫振蕩培養(yǎng)16h，然后使用試劑盒進(jìn)行質(zhì)?；厥詹?duì)其進(jìn)行EcoR I和Xho I雙酶切，即得鈣調(diào)素結(jié)合蛋白EDF-1的編碼基因。
[0018]實(shí)施例4
將蟾蜍清洗處死，取其背部皮膚剪成小塊后投入液氮中速凍lih，再稱取一小塊蟾蜍背部皮膚，按RNA提取試劑盒說(shuō)明提取其總RNA,用Quantscript RT kit合成其皮膚第一鏈cDNA，然后根據(jù)其他兩棲類EDF-lcDNA序列設(shè)計(jì)上、下游引物，取第一鏈cDNA 0.9 μ L，加滅菌超純水至20 μ L，加入與第一鏈cDNA等量的上、下游引物，在78°C循環(huán)實(shí)施PCR75min。反應(yīng)結(jié)束后，取一部分PCR產(chǎn)物與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化至E.coli感受態(tài)細(xì)胞DH5，然后取3mL轉(zhuǎn)化液均勻涂布于LB瓊脂盤上。并在37°C恒溫培養(yǎng)16h。挑取白色菌落接種于12mL LB培養(yǎng)基中，實(shí)施菌落PCR。將通過(guò)菌落PCR確定為陽(yáng)性的菌落0.4mL接種于2.5mL含IOOmg/mL氨芐青霉素-的LB培養(yǎng)液中，再次37°C恒溫振蕩培養(yǎng)15h，然后使用試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒回收并對(duì)其進(jìn)行EcoR I和Xho I雙酶切，即得鈣調(diào)素結(jié)合蛋白EDF-1的編碼基因。
[0019]實(shí)施例5
將蟾蜍清洗處死，取其背部皮膚剪成小塊后投入液氮中速凍12h，再稱取一小塊蟾蜍背部皮膚，按RNA提取試劑盒說(shuō)明提取其總RNA,用Quantscript RT kit合成其皮膚第一鏈cDNA，然后根據(jù)其他兩棲類EDF-lcDNA序列設(shè)計(jì)上、下游引物，取第一鏈cDNA 1.5 μ L，加滅菌超純水至21 μ L，加入與第一鏈cDNA等量的上、下游引物，在50°C循環(huán)實(shí)施PCR65min。反應(yīng)結(jié)束后，取一部分PCR產(chǎn)物與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化至E.coli感受態(tài)細(xì)胞DH5，然后取5mL轉(zhuǎn)化液均勻涂布于LB瓊脂盤上。并在37°C恒溫培養(yǎng)17h。挑取白色菌落接種于13mL LB培養(yǎng)基中，實(shí)施菌落PCR。將通過(guò)菌落PCR確定為陽(yáng)性的菌落0.5mL接種于3.5mL含IOOmg/mL氨芐青霉素-的LB培養(yǎng)液中，再次37°C恒溫振蕩培養(yǎng)18h，然后使用試劑盒進(jìn)行質(zhì)?；厥詹?duì)其進(jìn)行EcoR I和Xho I雙酶切，即得鈣調(diào)素結(jié)合蛋白EDF-1的編碼基因。[0020]實(shí)施例6
將蟾蜍清洗處死，取其背部皮膚剪成小塊后投入液氮中速凍14h，再稱取一小塊蟾蜍背部皮膚，按RNA提取試劑盒說(shuō)明提取其總RNA,用Quantscript RT kit合成其皮膚第一鏈cDNA，然后根據(jù)其他兩棲類EDF-lcDNA序列設(shè)計(jì)上、下游引物，取第一鏈cDNA 0.8 μ L，加滅菌超純水至20.5 μ L，加入與第一鏈cDNA等量的上、下游引物，在98°C循環(huán)實(shí)施PCR63min。反應(yīng)結(jié)束后，取一部分PCR產(chǎn)物與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化至E.coli感受態(tài)細(xì)胞DH5，然后取2mL轉(zhuǎn)化液均勻涂布于LB瓊脂盤上。并在37°C恒溫培養(yǎng)15.5h。挑取白色菌落接種于14mLLB培養(yǎng)基中，實(shí)施菌落PCR。將通過(guò)菌落PCR確定為陽(yáng)性的菌落0.2mL接種于2.8mL含100mg/mL氨芐青霉素-的LB培養(yǎng)液中，再次37°C恒溫振蕩培養(yǎng)14h，然后使用試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒回收并對(duì)其進(jìn)行EcoR I和Xho I雙酶切，即得鈣調(diào)素結(jié)合蛋白EDF-1的編碼基因。[0021 ] 以下通過(guò)試驗(yàn)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的有益試驗(yàn)結(jié)果。
[0022]試驗(yàn)一:
中華大蟾蜍鈣調(diào)素結(jié)合蛋白EDF-1的克隆:
一)中華大蟾蜍皮膚總RNA的制備及其第一鏈cDNA的合成
從一 70°C 超低溫冰箱中取一小塊中華大蟾蜍背部皮膚，稱重，然后按RNA提取試劑盒說(shuō)明提取其總RNA，瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA的完整性，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA溶液的濃度和純度。用Quantscript RT kit合成其皮膚第一鏈cDNA。
[0023]二)引物設(shè)計(jì)及中華大蟾蜍皮膚及F-7 cDNA的克隆
根據(jù)其他兩棲類EDF-1 cDNA序列設(shè)計(jì)上、下游引物Pl (5 ; -TAGAAGGCGAAACATGG-3')和 P2 (5' -GAGCACCGATTTCGAGGCT-3 ')。然后，以中華大蟾蜍皮膚第一鏈cDNA為模板實(shí)施PCR。反應(yīng)體系:2XPCR PrimeStar Max Premix 10.0 μ L，上、下游引物各I UL (2 pmol/mL)，中華大蟾蜍皮膚第一鏈cDNA 1.0 μ L，加滅菌超純水至20 μ L15PCR程序:98°C/2 min, (98°C /10 s,50°C /15 s,72°C /10 s) X 35 循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，將 PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及DNA凝膠回收。然后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行加A反應(yīng)，并取一部分PCR產(chǎn)物與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化至萬(wàn).co7i感受態(tài)細(xì)胞DH5，再將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布于藍(lán)白斑篩選用的LB瓊脂盤上(含氨節(jié)青霉素Ampicilin: 100 μ g 異丙基-3-D-硫代半乳糖苷 IPTG: 24 μ g*mL-l，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 Χ-gal: 40 μ g *mL-l) ?次日選取白色菌落實(shí)施菌落PCR以篩選陽(yáng)性菌落。
[0024]三)中華大蟾蜍及F-7 ORF的克隆及其編碼蛋白理化性質(zhì)分析
以Pl和P2為引物，以中華大蟾蜍皮膚第一鏈CDNA為模板實(shí)施PCR，結(jié)果得到略小于500 bp的PCR產(chǎn)物(圖1的A)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化并進(jìn)行陽(yáng)性菌落篩選和重組質(zhì)?；厥占跋拗菩詢?nèi)切酶消化(圖1的B)。將確定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒委托公司進(jìn)行測(cè)序。
測(cè)序結(jié)果分析表明，該P(yáng)CR產(chǎn)物的ORF為447 bp，編碼由148個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白質(zhì)(如圖2所示)。其編碼蛋白的氨基酸序列與日本蟾蜍編碼蛋白具僅3個(gè)氨基酸殘基不同，對(duì)應(yīng)于日本蟾蜍EDF-1 Ser22、Gln39和Lys88對(duì)應(yīng)的中華大蟾蜍的氨基酸是Ala22、Glu39和Arg88，故命名該克隆為中華大蟾蜍EDF-1。
【權(quán)利要求】
1.一種用于抑制內(nèi)皮細(xì)胞分化的蟾皮鈣調(diào)素結(jié)合蛋白EDF-ι編碼基因的克隆方法，其特征在于包括以下步驟: I)將蟾蜍清洗處死，取其背部皮膚剪成小塊后投入液氮中速凍9-15h，置于-70°C超低溫冰箱保存?zhèn)溆茫? 2)稱取步驟I)中一小塊蟾蜍背部皮膚，按RNA提取試劑盒說(shuō)明提取其總RNA，用Quantscript RT kit合成其皮膚第一鏈cDNA,備用； 3)根據(jù)蟾蜍其他兩棲類EDF-lcDNA序列設(shè)計(jì)上、下游引物，取步驟2)中第一鏈cDNA 0.8-1.5 μ L，加滅菌超純水至18-22 μ L，加入與第一鏈cDNA等量的上、下游引物，在50-98°C循環(huán)實(shí)施PCR60-80min ;反應(yīng)結(jié)束后，取一部分PCR產(chǎn)物與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化至E.coli感受態(tài)細(xì)胞DH5，然后取2-5mL轉(zhuǎn)化液均勻涂布于LB瓊脂盤上，并在37°C恒溫培養(yǎng)14-18h，挑取白色菌落接種于10-15mL LB培養(yǎng)基中，實(shí)施菌落PCR，將通過(guò)菌落PCR確定為陽(yáng)性的菌落0.2-05mL接種于2-4mL含100mg/mL氨芐青霉素-的LB培養(yǎng)液中，再次37°C恒溫振蕩培養(yǎng)14_18h，然后使用試劑盒進(jìn)行質(zhì)?；厥詹?duì)其進(jìn)行EcoR I和Xho I雙酶切，SP可。
2.如權(quán)利要求1所述的一種用于抑制內(nèi)皮細(xì)胞分化的蟾皮鈣調(diào)素結(jié)合蛋白EDF-1編碼基因的克隆方法，其特征在于蟾蜍皮膚液氮中速凍時(shí)間為10-14h，優(yōu)選為ll-13h。
3.如權(quán)利要求1所述 的一種用于抑制內(nèi)皮細(xì)胞分化的蟾皮鈣調(diào)素結(jié)合蛋白EDF-1編碼基因的克隆方法，其特征在于PCR的溫度為60-90°C，優(yōu)選65-80°C ;PCR的時(shí)間為65-75min，優(yōu)選 68_72min。
4.如權(quán)利要求1所述的一種用于抑制內(nèi)皮細(xì)胞分化的蟾皮鈣調(diào)素結(jié)合蛋白EDF-1編碼基因的克隆方法，其特征在于轉(zhuǎn)化液均勻涂布于LB瓊脂盤上后在37°C恒溫培養(yǎng)15-16h。
5.如權(quán)利要求1所述的一種用于抑制內(nèi)皮細(xì)胞分化的蟾皮鈣調(diào)素結(jié)合蛋白EDF-1編碼基因的克隆方法，其特征在于菌落振蕩培養(yǎng)時(shí)間為15_16h。
【文檔編號(hào)】C12N15/12GK103540597SQ201310489681
【公開日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2013年10月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月18日
【發(fā)明者】楊仙玉, 方琦璐 申請(qǐng)人:浙江農(nóng)林大學(xué)