抑制pcsk9基因表達(dá)的組合物和方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于抑制PCSK9基因(PCSK9基因)表達(dá)的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，所述dsRNA包含長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸且通常為19-25個(gè)核苷酸的核苷酸序列反義鏈，并且所述反義鏈與PCSK9基因的至少一部分基本互補(bǔ)。本發(fā)明還涉及包含所述dsRNA和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，使用所述藥物組合物治療由PCSK9基因的表達(dá)和PCSK9基因表達(dá)導(dǎo)致的疾病的方法。
【專利說(shuō)明】抑制PCSK9基因表達(dá)的組合物和方法
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2007年05月10日和發(fā)明名稱為“抑制PCSK9基因表達(dá)的組合物和方法”的200780024854.1號(hào)發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0003]本申請(qǐng)要求于2006年5月11日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60 / 799，458號(hào)，于2006年6月27日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60 / 817，203號(hào)，于2006年8月25日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60 / 840,089號(hào)，于2006年10月18日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60 / 829，914號(hào)和于2007年2月13日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60 / 901，134號(hào)的優(yōu)先權(quán)。所有這些臨時(shí)申請(qǐng)的內(nèi)容均通過引用整體并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004]本發(fā)明涉及雙鏈核糖核酸(dsRNA)及其介導(dǎo)RNA干涉以抑制PCSK9基因表達(dá)的用途，以及dsRNA在治療如高脂血癥等可由PCSK9下調(diào)介導(dǎo)的病理過程的用途。
【背景技術(shù)】
[0005]枯草溶菌素前蛋白轉(zhuǎn)化酶9 (Proprotein convertase subtilisin kexin9,PCSK9)是枯草溶菌素絲氨酸蛋白酶家族的成員。其它8個(gè)哺乳動(dòng)物枯草溶菌素蛋白酶PCSK1-PCSK8(也被稱為 PCl / 3、PC2、弗林蛋白酶、PC4、PC5 / 6、PACE4、PC7 和 SlP /SK1-1)是加工多種分泌通路中蛋白質(zhì)并在多種生物進(jìn)程中發(fā)揮作用的前蛋白轉(zhuǎn)化酶(Bergeron,F.(2000)J.Mol.Endocrinol.24,1-22, Gensberg,K., (1998)Semin.Cell Dev.Biol.9，11-17，Seidah, N.G.(1999)Brain Res.848，45-62，Taylor, N.A., (2003)FASEBJ.17，1215-1227，和 Zhou，A.，(1999) J.Biol.Chem.274，20745-20748)?，F(xiàn)已提出 PCSK9在膽固醇代謝中發(fā)揮作用。PCSK9mRNA的表達(dá)在膽固醇膳食飼養(yǎng)的小鼠中下調(diào)(Maxwell，K.N.，(2003) J.LipidRes.44,2109-2119)，在 H印G2 細(xì)胞系中上調(diào)(Dubuc, G.，(2004)Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.24,1454-1459)，而在固醇調(diào)節(jié)兀件結(jié)合蛋白(SREBP)的轉(zhuǎn)基因小鼠中上調(diào)(Horton, J.D.，(2003) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA100，12027-12032)，這類似于膽固醇生物合成酶以及低密度脂蛋白受體(LDLR)。此外，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)PCSK9錯(cuò)義突變與常染色體顯性高膽固醇血癥(Hchola3)相關(guān)(Abi fade I, M.，et al.(2003) Nat.Genet.34，154-156，Timms,K.M.，(2004)Hum.Genet.114，349-353，Leren，T.P.(2004)Clin.Genet.65,419-422)。因?yàn)楝F(xiàn)已在日本人中發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性(SNP)與膽固醇水平相關(guān)，因此PCSK9可能還決定普通人群的LDL膽固醇水平(Shioji，K.，(2004) J.Hum.Genet.49,109-114)。
[0006]常染色體顯性高膽固醇血癥(ADH)是單基因疾病，其患者表現(xiàn)為升高的總膽固醇水平和LDL膽固醇水平、肌腱黃色瘤和過早的動(dòng)脈粥樣硬化(Rader，D.J.，(2003) J.Clin.1nvest.111，1795-1803)。ADH及退行性疾病隱性遺傳性高膽固醇血癥(ARH) (Cohen, J.C.，(2003) Curr.0pin.Lipidol.14，121-127)的發(fā)病機(jī)理是肝臟對(duì)LDL吸收的缺陷。阻礙LDL吸收的LDLR突變或LDL上與LDLR結(jié)合的載脂蛋白B的突變均可導(dǎo)致ADH。ARH是由ARH蛋白質(zhì)中的突變?cè)斐傻?，其中ARH蛋白質(zhì)是通過與網(wǎng)格蛋白相互作用而內(nèi)吞LDLR-LDL復(fù)合物所必需的。因此，如果PCSK9突變是Hchola3家族病的病因，那么PCSK9很可能在受體介導(dǎo)的LDL吸收中起作用。
[0007]過表達(dá)研究指出PCSK9可以控制LDLR的水平，并以此控制肝臟對(duì)LDL的吸收(Maxwell, K.N.(2004) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA101，7100-7105，Benjannet，S.，et al.(2004) J.Biol.Chem.279, 48865-48875, Park, S.ff., (2004) J.Biol.Chem.279,50630-50638)。小鼠中由腺病毒介導(dǎo)的小鼠或人PCSK9過表達(dá)3或4天可導(dǎo)致總膽固醇水平和LDL膽固醇水平的升高，而在LDLR敲除動(dòng)物中則未發(fā)現(xiàn)此作用(Maxwell，K.N.(2004)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 101, 7100-7105, Benjannet, S.，et al.(2004) J.Biol.Chem.279，48865-48875，Park, S.ff.，(2004) J.Biol.Chem.279，50630-50638)。此外，PCSK9過表達(dá)造成肝臟LDLR蛋白質(zhì)的大量減少，但不影響LDLR mRNA水平、SREBP蛋白質(zhì)水平或SREBP蛋白的細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)比例。這些結(jié)果說(shuō)明PCSK9通過轉(zhuǎn)錄后機(jī)制直接或間接地降低LDLR蛋白質(zhì)水平。
[0008]現(xiàn)已設(shè)計(jì)出PCSK9功能缺失突變的小鼠模型(Rashid et.al.，(2005)PNAS, 102，5374-5379)，并在人類個(gè)體中鑒定出PCSK9功能缺失突變(Cohen et al.，(2005)，NatureGenetics.,37,161-165)。在這兩種情況下，PCSK9功能缺失均導(dǎo)致總膽固醇水平和LDLc膽固醇水平的降低?；仡欉^去15年的研究成果發(fā)現(xiàn)，缺失一個(gè)拷貝PCSK9可降低LDLc，并有助于提高對(duì)抗心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的能力(Cohen et.al., 2006N.Engl.J.Med., 354.,1264-1272.)。迄今為止的證據(jù)清楚地說(shuō)明降低PCSK9水平可降低LDLc。
[0009]目前已發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA分子(dsRNA)通過被稱為RNA干擾(RNAi)的高度保守的調(diào)控機(jī)制來(lái)阻斷基因表達(dá)。W099 / 32619 (Fire et al.)公開了長(zhǎng)度為至少25個(gè)核苷酸的dsRNA在抑制線蟲(C.elegans)基因表達(dá)中的用途?，F(xiàn)還發(fā)現(xiàn)dsRNA在其它生物體中降解靶RNA，其中所述生物體包括植物(參見，例如W099 / 53050，Waterhouse et al.和W099 / 61631,Heifetz et al.)、果蠅(參見，例如 Yang，D.，et al.,Curr.Biol.(2000) 10:1191-1200)和哺乳動(dòng)物(參見 WOOO / 44895，Limmer 和 DE10100586.5，Kreutzer et al.)。這種天然機(jī)制現(xiàn)已成為治療因基因異?；蛴泻φ{(diào)控而引發(fā)的疾病的新型藥物的研發(fā)熱點(diǎn)。
[0010]除了在RNAi領(lǐng)域的顯著進(jìn)展以及由下調(diào)PCSK9基因表達(dá)介導(dǎo)的病理過程治療的進(jìn)展之外，人們還需要能夠抑制PCSK9基因表達(dá)并能夠治療如高脂血癥等與PCSK9基因表達(dá)相關(guān)疾病的藥劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明通過使用雙鏈核糖核酸(dsRNA)沉默枯草溶菌素前蛋白轉(zhuǎn)化酶9(PCSK9)表達(dá)，從而提供了關(guān)于可受PCSK9基因下調(diào)調(diào)節(jié)的疾病治療的問題解決方案。
[0012]本發(fā)明提供了雙鏈核糖核酸(dsRNA)以及使用此類dsRNA抑制細(xì)胞或哺乳動(dòng)物中PCSK9基因表達(dá)的組合物和方法。本發(fā)明還提供了用于治療如聞脂血癥等可受PCSK9基因表達(dá)下調(diào)調(diào)節(jié)的病癥的組合物和方法。本發(fā)明的dsRNA包含具有長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸且通常長(zhǎng)度為19-24個(gè)核苷酸區(qū)域的RNA鏈(反義鏈)，并且其中所述區(qū)域基本與PCSK9基因mRNA轉(zhuǎn)錄本的至少一部分互補(bǔ)。
[0013]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于抑制PCSK9基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸(dsRNA)分子。所述dsRNA包含至少兩條彼此互補(bǔ)的序列。所述dsRNA包含具有第一序列的正義鏈和具有第二序列的反義鏈。所述反義鏈包含與PCSK9編碼mRNA的至少一部分基本互補(bǔ)的核苷酸序列，并且互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸，通常為19-24個(gè)核苷酸。所述dsRNA在與表達(dá)PCSK9的細(xì)胞接觸時(shí)可至少抑制40%的PCSK9基因表達(dá)。
[0014]例如，本發(fā)明的dsRNA分子可由dsRNA的第一序列和第二序列組成，其中所述第一序列選自于由表1和表2中正義序列組成的組，所述第二序列選自于由表1和表2中反義序列組成的組。本發(fā)明的dsRNA分子可包含天然存在的核苷酸或包含至少一種修飾核苷酸，所述修飾核苷酸例如為2' -0-甲基修飾的核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基團(tuán)的核苷酸以及與膽留醇基衍生物相連接的末端核苷酸。或者，所述修飾核苷酸可選自以下組:2'-脫氧-2'-氟代修飾核苷酸、2'-脫氧-修飾核苷酸、鎖核苷酸(locked nucleotide)、無(wú)堿基核苷酸、2'-氨基-修飾核苷酸、2'-烷基-修飾核苷酸、嗎啉代核苷酸、氨基磷酸酯和含有非天然堿基的核苷酸。通常，此類修飾序列可基于所述dsRNA的第一序列和第二序列，其中所述第一序列選自于由表1和表2中正義序列組成的組，所述第二序列選自于由表1和表2中反義序列組成的組。
[0015]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含一種本發(fā)明dsRNA的細(xì)胞。所述細(xì)胞通常為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如人類細(xì)胞。
[0016]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制生物體(通常為人類受試者)體內(nèi)PCSK9基因表達(dá)的藥物組合物，所述藥物組合物包含一種或多種本發(fā)明的dsRNA以及藥學(xué)上可接受的載體或遞送載體。
[0017]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制細(xì)胞內(nèi)PCSK9基因表達(dá)的方法，所述方法包含以下步驟: [0018](a)將雙鏈核糖核酸(dsRNA)引入細(xì)胞中，其中所述dsRNA包含至少兩條彼此互補(bǔ)的序列。所述dsRNA包含正義鏈和反義鏈，其中所述正義鏈包含第一序列，所述反義鏈包含第二序列。所述反義鏈包含與PCSK9編碼mRNA的至少一部分基本互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)，并且所述互補(bǔ)區(qū)域的長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸，通常為19-24個(gè)核苷酸，并且所述dsRNA在與表達(dá)PCSK9接觸時(shí)可至少抑制40%的PCSK9基因表達(dá)；和
[0019](b)將步驟(a)中得到的細(xì)胞維持足夠長(zhǎng)的時(shí)間以降解PCSK9基因的mRNA轉(zhuǎn)錄本，從而抑制細(xì)胞內(nèi)PCSK9基因的表達(dá)。
[0020]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療、預(yù)防或控制如高脂血癥等可由PCSK9基因表達(dá)下調(diào)介導(dǎo)的病理過程的方法，所述方法包含向需要此類治療、預(yù)防或控制的患者施用治療有效量或預(yù)防有效量的一種或多種本發(fā)明的dsRNA。
[0021]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制細(xì)胞內(nèi)PCSK9基因表達(dá)的載體，所述載體包含可操作地與編碼本發(fā)明dsRNA的至少一條鏈的核苷酸序列連接的調(diào)控序列。
[0022]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞，其包含抑制細(xì)胞內(nèi)PCSK9基因表達(dá)的載體。所述載體包含可操作地與編碼本發(fā)明dsRNA的至少一條鏈的核苷酸序列連接的調(diào)控序列。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1:顯示ND-98脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)。[0024]圖2:顯示靶向PCSK9mRNA的不同ORF區(qū)域(具有圖中所指出的ORF位點(diǎn)的第一個(gè)核苷酸)的16種小鼠特異性PCSK9siRNA(AL-DP-9327至AL-DP-9342)在C57 / BL6小鼠(每組5只)體內(nèi)的篩選結(jié)果。計(jì)算各處理組肝臟裂解物中PCSK9mRNA與GAPDH mRNA比例的平均值，并與使用PBS處理的對(duì)照組或使用不相關(guān)SiRNA(凝血因子VII)的對(duì)照組進(jìn)行比較。
[0025]圖3:顯示靶向PCSK9mRNA的不同ORF區(qū)域(具有圖中所指出的ORF位點(diǎn)的第一個(gè)核苷酸)的16種人/小鼠/大鼠交叉反應(yīng)性PCSK9siRNA(AL-DP-9311至AL-DP-9326)在C57 / BL6小鼠(每組5只)體內(nèi)的篩選結(jié)果。計(jì)算各處理組肝臟裂解物中PCSK9mRNA與GAPDH mRNA比例的平均值，并與使用PBS處理的對(duì)照組或使用不相關(guān)siRNA(凝血因子VII)的對(duì)照組進(jìn)行比較。
[0026]PCSK9mRNA的沉默造成血清總膽固醇水平的下降。
[0027]能最有效地敲除PSCK9信使的SiRNA顯示最顯著的膽固醇降低效果(約20-30% )。
[0028]圖4:顯示 16 種小鼠特異性 PCSK9siRNA(AL-DP-9327 至 AL-DP-9342)在 C57 / BL6小鼠(每組5只)體內(nèi)的篩選結(jié)果。計(jì)算各處理組血清總膽固醇水平的平均值，并與使用PBS處理的對(duì)照組或使用不相關(guān)siRNA(凝血因子VII)的對(duì)照組進(jìn)行比較。
[0029]圖5:顯示在16種人/小鼠/大鼠交叉反應(yīng)性PCSK9siRNA (AL-DP-9327至AL-DP-9342)在C57 / BL6小鼠(每組5只)體內(nèi)的篩選結(jié)果。計(jì)算各處理組血清總膽固醇水平的平均值，并與使用PBS處理的對(duì)照組或使用不相關(guān)siRNA(凝血因子VII)的對(duì)照組進(jìn)行比較。
[0030]圖6:顯示體外和體內(nèi)PCSK9沉默結(jié)果的比較。
[0031]圖7A和圖7B:顯示使用猴原代肝細(xì)胞在體外沉默PCSK9的結(jié)果。
[0032]圖8:顯示由LNP-Ol配制的靶向pcsk-9的siRNA的體內(nèi)活性。
[0033]圖9:顯示由LNP-Ol配制的修飾親本分子9314和10792在不同時(shí)期的體內(nèi)活性。修飾型10792清楚地顯示出體內(nèi)沉默活性。
【具體實(shí)施方式】
[0034]本發(fā)明提供了關(guān)于可受PCSK9基因下調(diào)調(diào)節(jié)的治療疾病的問題解決方案，通過使用雙鏈核糖核酸(dsRNA)沉默PCSK9基因從而提供如高脂血癥等疾病的治療方法。
[0035]本發(fā)明提供了雙鏈核糖核酸(dsRNA)以及以及使用所述dsRNA抑制細(xì)胞或哺乳動(dòng)物中PCSK9基因表達(dá)的組合物和方法。本發(fā)明還提供了用于治療由PCSK9基因表達(dá)下調(diào)調(diào)節(jié)的病理過程和疾病的組合物和方法。dsRNA通過被稱為RNA干擾(RNAi)的過程指導(dǎo)序列特異性mRNA降解。本發(fā)明的dsRNA包含具有長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸，通常長(zhǎng)度為19-24個(gè)核苷酸區(qū)域的RNA鏈(反義鏈)，其中所述區(qū)域與PCSK9基因mRNA轉(zhuǎn)錄本的至少一部分互補(bǔ)。使用這些dsRNA能夠靶向降解參與鈉運(yùn)輸?shù)膍RNA。使用基于細(xì)胞的試驗(yàn)以及動(dòng)物試驗(yàn)，本發(fā)明人已證明極低劑量的這些dsRNA可特異且高效介導(dǎo)RNAi，造成PCSK9基因表達(dá)的顯著抑制。因此，本發(fā)明中包含這些dsRNA的方法和組合物可用于可受PCSK9下調(diào)介導(dǎo)的病理過程治療，例如高脂血癥的治療。
[0036]下文的詳細(xì)說(shuō)明公開了制備和使用dsRNA和包含dsRNA的組合物以抑制靶基因PCSK9表達(dá)，以及治療如高脂血癥等可受PCSK9表達(dá)下調(diào)調(diào)節(jié)的疾病的組合物和方法。本發(fā)明的藥物組合物包含dsRNA和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述dsRNA具有長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸，通常長(zhǎng)度為19-24個(gè)核苷酸互補(bǔ)區(qū)域的反義鏈，其中所述互補(bǔ)區(qū)域與PCSK9基因mRNA轉(zhuǎn)錄本的至少一部分互補(bǔ)。
[0037]因此，本發(fā)明的某些方面提供了包含本發(fā)明的dsRNA和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，使用所述組合物抑制PCSK9基因表達(dá)的方法和使用所述藥物組合物治療可受PCSK9表達(dá)下調(diào)調(diào)節(jié)的疾病的方法。
[0038]1.定義 [0039]為了方便起見，下文提供了本說(shuō)明書、實(shí)施例和權(quán)利要求書中使用的特定術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)的含義。如果某術(shù)語(yǔ)在本說(shuō)明書其它部分中的用法與本節(jié)中提供的其定義之間有明顯差異，應(yīng)以本節(jié)中的定義為準(zhǔn)。
[0040]“ G ”、“ C ”、“ A ”和“ U ”通常分別代表包含鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶作為堿基的核苷酸。然而，應(yīng)理解的是術(shù)語(yǔ)“核糖核苷酸”或“核苷酸”也可指如下文詳述的修飾核苷酸，或具替換部分的替代物(surrogate replacement moiety)。技術(shù)人員熟知可將鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶替換成其它部分而基本不改變包含帶有此類替換部分的核苷酸的寡核苷酸堿基配對(duì)性質(zhì)。例如但不限于:包含次黃嘌呤作為其堿基的核苷酸可與包含腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸進(jìn)行堿基配對(duì)。因此，本發(fā)明的核苷酸序列中包含尿嘧啶、鳥嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可被替換成包含如次黃嘌呤等的核苷酸。包含此類替換部分的序列是本發(fā)明的實(shí)施方案。
[0041]本文所使用的“PCSK9”是指枯草溶菌素前蛋白轉(zhuǎn)化酶9基因或蛋白(也被稱為FH3, HCH0LA3、NARC-1、NARCI)。所提供的 PCSK9 的 mRNA 序列有人類:NM_174936 ;小鼠:NM_153565 ;和大鼠:NM_199253。
[0042]本文所使用的“靶序列”是指PCSK9基因轉(zhuǎn)錄過程中形成的mRNA分子核苷酸序列中的連續(xù)部分，包括作為初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的RNA加工產(chǎn)物的mRNA。
[0043]本文所用術(shù)語(yǔ)“包含序列的鏈”是指包含核苷酸鏈的寡核苷酸，該寡核苷酸鏈通過利用標(biāo)準(zhǔn)核苷酸命名法表示的序列進(jìn)行闡述。
[0044]除非另有說(shuō)明，否則在用于描述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的關(guān)系時(shí)，本文所用術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”是指包含所述第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些條件下與包含所述第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸雜交并形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的能力，本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解這一點(diǎn)。例如，此類條件可以是嚴(yán)格條件，其中所述嚴(yán)格條件可包括400mMNaCl、40mM PIPES pH6.4、lmM EDTA，在 50°C或 70°C下持續(xù) 12-16 小時(shí)，隨后進(jìn)行清洗。也可應(yīng)用其它條件，例如可能在生物體內(nèi)遇到的生理相關(guān)條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)雜交核苷酸的最終應(yīng)用決定最適合于兩序列互補(bǔ)試驗(yàn)的系列條件。
[0045]這包括包含所述第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸與包含所述第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在第一和第二核苷酸序列的全長(zhǎng)范圍內(nèi)的堿基配對(duì)。本文中這些序列被稱為彼此“完全互補(bǔ)”。然而，在本文中當(dāng)提到所述第一序列與所述第二序列“基本互補(bǔ)”時(shí)，所述兩個(gè)序列可完全互補(bǔ)或在雜交時(shí)形成一個(gè)或多個(gè)，但通常不超過4個(gè)、3個(gè)或2個(gè)錯(cuò)配堿基對(duì)，同時(shí)保留與其最終應(yīng)用最相關(guān)的條件下的雜交能力。但是，當(dāng)兩個(gè)寡核苷酸經(jīng)設(shè)計(jì)以雜交形成一個(gè)或多個(gè)單鏈懸端時(shí)，考慮到互補(bǔ)的定義這種懸端不應(yīng)該被認(rèn)做是錯(cuò)配。例如，在包含一條長(zhǎng)度為21個(gè)核苷酸的寡核苷酸和另一條長(zhǎng)度為23個(gè)核苷酸的寡核苷酸的dsRNA中，較長(zhǎng)寡核苷酸包含與較短寡核苷酸完全互補(bǔ)的21個(gè)核苷酸的序列，在本發(fā)明的目的下，這種情況也屬于“完全互補(bǔ)”。
[0046]只要其雜交能力能夠滿足上述需求，本文所用“互補(bǔ)”序列也可以包含或完全由非Watson-Crick堿基對(duì)形成和/或由非天然和修飾核苷酸形成的堿基對(duì)形成。
[0047]本文中對(duì)于dsRNA的正義鏈與反義鏈間堿基配對(duì)，或dsRNA的反義鏈與靶序列間堿基配對(duì)可使用術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”、“完全互補(bǔ)”和“基本互補(bǔ)”，所述術(shù)語(yǔ)可根據(jù)其所處上下文進(jìn)
行理解。
[0048]本文所用的與信使RNA (mRNA)的“至少一部分基本互補(bǔ)”的多核苷酸是指與目標(biāo)mRNA(例如，編碼PCSK9的mRNA)的連續(xù)片段基本互補(bǔ)的多核苷酸。例如，如果多核苷酸的序列與編碼PCSK9的mRNA中的非中斷片段基本互補(bǔ)，那么所述多核苷酸與PCSK9mRNA的至少一部分互補(bǔ)。
[0049]本文所用術(shù)語(yǔ)“雙鏈RNA”或“dsRNA”是指核糖核酸分子的復(fù)合物，所述復(fù)合物具有雙鏈結(jié)構(gòu)并包含兩條反平行且如上所述的基本互補(bǔ)的核酸鏈。形成所述雙鏈結(jié)構(gòu)的兩條鏈可以是同一條較大RNA分子的不同部分，或者是單獨(dú)的RNA分子。如果所述兩條鏈為單獨(dú)的RNA分子，此類dsRNA在文獻(xiàn)中常被稱為siRNA ( “小干擾RNA”)。如果所述兩條鏈為一個(gè)較大分子的部分并且通過形成雙鏈結(jié)構(gòu)的一條鏈3,-末端及另一條鏈5'-末端之間的非中斷核苷酸鏈相連接，那么所述相連的RNA鏈被稱為“發(fā)夾環(huán)”、“短發(fā)夾RNA”或“shRNA”。如果所述兩條鏈通過形成雙鏈結(jié)構(gòu)的一條鏈3'-末端及另一條鏈5'-末端之間的非中斷鏈之外的方式共價(jià)連接，那么所述連接結(jié)構(gòu)被稱為“接頭(linker)”。所述RNA鏈可具有相同或不同數(shù)量的核苷酸。堿基對(duì)的最大值是dsRNA中的最短鏈減去雙鏈中存在的任何懸端后的核苷酸數(shù)目。除雙鏈結(jié)構(gòu)之外，dsRNA可包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸懸端。此外，在本說(shuō)明書中使用的“dsRNA”可包括對(duì)核糖核苷酸的化學(xué)修飾，包括對(duì)多個(gè)核苷酸的修飾，并包括本文公開或本領(lǐng)域已知的所有修飾類型。基于本說(shuō)明書和權(quán)利要求書的目的，“dsRNA”涵蓋用于siRNA類型分子的所有此類修飾。
[0050]本文所用“核苷酸懸端”是指當(dāng)dsRNA的一條鏈的3’末端超過另一條鏈的5’末
端或反之時(shí)從dsRNA的結(jié)構(gòu)突出的一個(gè)或多個(gè)未配對(duì)核苷酸?！捌蕉恕被颉捌侥┒恕笔?br> 指在dsRNA的末端沒有未配對(duì)的核苷酸，即沒有核苷酸懸端?！捌侥┒嘶摹?dsRNA是指在其全長(zhǎng)范圍均為雙鏈的dsRNA，即在此分子任一個(gè)末端均沒有核苷酸懸端。為清楚起見，在確定siRNA是否具有懸端或平端時(shí)，不考慮結(jié)合到siRNA的3'-末端或5'-末端的化學(xué)帽或非核苷酸的化學(xué)部分。
[0051]術(shù)語(yǔ)“反義鏈”是指dsRNA中的一條鏈，其包含與靶序列基本互補(bǔ)的區(qū)域。本文所用術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)區(qū)”是指 反義鏈上與本文所定義的序列(例如靶序列)基本互補(bǔ)的區(qū)域。如果互補(bǔ)區(qū)與靶序列不完全互補(bǔ)，則最能容許的錯(cuò)配發(fā)生在末端區(qū)域，并且如果存在錯(cuò)配，則通常位于末端區(qū)域，或者例如5'和/或3'末端的6、5、4、3或2個(gè)核苷酸之內(nèi)。
[0052]本文所用術(shù)語(yǔ)“正義鏈”是指dsRNA中的一條鏈，其包含與所述反義鏈區(qū)域基本互補(bǔ)的區(qū)域。
[0053]如本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解，所述“引入到細(xì)胞中(或向細(xì)胞引入)”在用于dsRNA時(shí)，是指便于攝取或吸收進(jìn)入細(xì)胞。dsRNA的吸收或攝取可通過非輔助性擴(kuò)散或主動(dòng)的細(xì)胞過程發(fā)生，或者通過輔助試劑或設(shè)備發(fā)生。此術(shù)語(yǔ)的內(nèi)涵不限定于體外細(xì)胞；也可以將dsRNA “引入到細(xì)胞中(或向細(xì)胞引入dsRNA)”，其中所述細(xì)胞是活生物體一部分。在此情況下，引入到細(xì)胞中將包括向生物體的遞送。例如，在體內(nèi)遞送中，可將dsRNA注射到組織位點(diǎn)或進(jìn)行全身施用。向體外細(xì)胞的引入包括本領(lǐng)域已知的方法，例如電穿孔法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(Iipofection)0
[0054]當(dāng)術(shù)語(yǔ)“沉默”和“抑制表達(dá)”是針對(duì)PCSK9基因的表達(dá)時(shí)，它們?cè)诒疚闹钢辽俨糠忠种芇CSK9基因的表達(dá)，通過與第二細(xì)胞或細(xì)胞群相比可以從第一細(xì)胞或細(xì)胞群中分離的轉(zhuǎn)錄自PCSK9基因的mRNA數(shù)量的減少來(lái)表示，其中所述第一細(xì)胞或細(xì)胞群中PCSK9基因被轉(zhuǎn)錄且其已經(jīng)被處理以至PCSK9基因的表達(dá)被抑制，所述第二細(xì)胞或細(xì)胞群與所述第一細(xì)胞或細(xì)胞群基本相當(dāng)?shù)錄]有作此處理(對(duì)照細(xì)胞)。抑制度通常用以下方式表示:
[0055]
【權(quán)利要求】
1.用于抑制細(xì)胞內(nèi)人PCSK9基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包含至少兩條互補(bǔ)的序列，并且其中的正義鏈包含第一序列，反義鏈包含第二序列，所述第二序列包含與編碼PCSK9的mRNA的至少一部分基本互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)，其中所述互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸，且其中所述dsRNA在接觸表達(dá)所述PCSK9的細(xì)胞時(shí)抑制所述PCSK9基因的表達(dá)。
2.如權(quán)利要求1所述的dsRNA，其中所述第一序列選自于由表1和表2組成的組，所述第二序列選自于由表1和表2組成的組。
3.如權(quán)利要求1所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含至少一個(gè)修飾核苷酸。
4.如權(quán)利要求2所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含至少一個(gè)修飾核苷酸。
5.如權(quán)利要求3所述的dsRNA，其中所述修飾核苷酸選自-.2'-O-甲基修飾核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基團(tuán)的核苷酸和與膽固醇衍生物或月桂酸雙癸酰胺基團(tuán)連接的末端核苷酸。
6.如權(quán)利要求3所述的dsRNA，其中所述修飾核苷酸選自于:2'-脫氧-2'-氟代修飾核苷酸、2'-脫氧-修飾核苷酸、鎖核苷酸、無(wú)堿基核苷酸、2'-氨基-修飾核苷酸、2/ -烷基-修飾核酸、嗎啉基核苷酸、氨基磷酸酯和包含非天然堿基的核苷酸。
7.如權(quán)利要求3所述的dsRNA，其中所述第一序列選自于由表1和表2組成的組，所述第二序列選自于由表1和表2組成的組。
8.如權(quán)利要求6所述的dsRNA,其中所述第一序列選自于由表1和表2組成的組,所述第二序列選自于由表1和表2組成的組。
9.細(xì)胞，其包含權(quán)利要求1所述的dsRNA。
10.用于抑制生物體內(nèi)PCSK9基因表達(dá)的藥物組合物，所述藥物組合物包含dsRNA和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述dsRNA包含至少兩條彼此互補(bǔ)的序列，并且其中的正義鏈包含第一序列，反義鏈包含第二序列，且所述第二序列包含與編碼PCSK9的mRNA的至少一部分基本互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)，并且其中所述互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸，且其中所述dsRNA在接觸表達(dá)所述PCSK9的細(xì)胞時(shí)抑制所述PCSK9基因的表達(dá)。
11.如權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其中所述dsRNA的第一序列選自于由表1和表2組成的組，所述dsRNA的第二序列選自于由表1和表2組成的組。
12.如權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其中所述dsRNA的第一序列選自于由表1和表2組成的組，所述dsRNA的所述第二序列選自于由表1和表2組成的組。
13.抑制細(xì)胞內(nèi)PCSK9基因表達(dá)的方法，所述方法包括: (a)向所述細(xì)胞引入雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包含至少兩條彼此互補(bǔ)的序列，并且其中的正義鏈包含第一序列，反義鏈包含第二序列，且所述第二序列包含與編碼PCSK9的mRNA的至少一部分基本互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)，并且其中所述互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸，且其中所述dsRNA在接觸表達(dá)所述PCSK9的細(xì)胞時(shí)抑制所述PCSK9基因的表達(dá)，和 (b)將步驟(a)中得到的細(xì)胞維持足夠長(zhǎng)的時(shí)間以降解PCSK9基因的mRNA轉(zhuǎn)錄本，從而抑制細(xì)胞中PCSK9基因的表達(dá)。
14.治療、預(yù)防或控制可由PCSK9基因表達(dá)下調(diào)介導(dǎo)的病理過程的方法，所述方法包含給所需患者施用治療有效量或預(yù)防有效量的dsRNA,其中所述dsRNA包含至少兩條彼此互補(bǔ)的序列，并且其中的正義鏈包含第一序列，反義鏈包含第二序列，且所述第二序列包含與編碼PCSK9的mRNA的至少一部分基本互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)，并且其中所述互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸，且其中所述dsRNA在接觸表達(dá)所述PCSK9的細(xì)胞時(shí)抑制所述PCSK9基因的表達(dá)。
15.抑制細(xì)胞內(nèi)PCSK9基因表達(dá)的載體，其中所述載體包含可操作地連接于編碼dsRNA中至少一條鏈的核苷酸序列的調(diào)節(jié)序列，其中所述dsRNA的一條鏈與編碼PCSK9的mRNA的至少一部分基本互補(bǔ)，并且其中所述dsRNA的長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸，且其中所述dsRNA在接觸表達(dá)所述PCSK9的細(xì)胞時(shí)抑制所述PCSK9基因的表達(dá)。
16.細(xì)胞,其包含權(quán)利要求15所述的載體。
17.用于降低細(xì)胞內(nèi)人PCSK9基因表達(dá)水平的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包含至少兩條彼此互補(bǔ)的序列，并且其中的正義鏈包含第一序列，反義鏈包含第二序列，且所述第二序列包含與編碼PCSK9的mRNA的至少一部分基本互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)，且其中所述dsRNA在接觸表達(dá)所述PCSK9的細(xì)胞時(shí)降低所述PCSK9基因的表達(dá)水平。
18.如權(quán)利要求17所述的dsRNA，其中所述接觸降低所述PCSK9基因的表達(dá)水平。
19.如權(quán)利要求17所述的dsRNA，其中所述接觸在體外以30nM或更低濃度進(jìn)行。
20.用于降低生物體內(nèi)PCSK9基因表達(dá)水平的藥物組合物，其包含權(quán)利要求17所述的dsRNA和藥學(xué)上可接受的載體。
21.用于治療PCSK9相關(guān)病變的方法，其包含向所需患者施用治療有效量的權(quán)利要求17所述的dsRNA。
22.用于治療PCSK9相關(guān)病變的方法，其包含向所需患者施用治療有效量的權(quán)利要求17所述的ds RNA。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103614375SQ201310491236
【公開日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2007年5月10日 優(yōu)先權(quán)日:2006年5月11日
【發(fā)明者】帕梅拉·譚, 比吉特·布拉姆利奇, 瑪麗亞·弗蘭克-卡米尼斯基, 凱文·菲茨杰拉德, 埃金·阿肯克, 威克特·E·考特廉斯基 申請(qǐng)人:阿爾尼拉姆醫(yī)藥品有限公司