由干細胞分化誘導心肌細胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明在由干細胞分化誘導心肌細胞的方法中，通過特征為將干細胞在抑制BMP信號傳導物質的存在下進行向心肌細胞的分化誘導培養(yǎng)的該方法，提供高效而且有選擇性地對心肌細胞進行分化誘導的方法。
【專利說明】由干細胞分化誘導心肌細胞的方法
[0001]本申請是申請日為2004年10月4日的申請?zhí)枮?00480028917.7 (PCT /JP2004 / 014598)的專利申請“由干細胞分化誘導心肌細胞的方法”的分案申請。
【技術領域】
[0002]本發(fā)明涉及由ES細胞等多能性干細胞選擇性地且高效率地制備心肌細胞的方法，以及通過該方法得到的再生醫(yī)療用細胞。
【背景技術】 [0003]一般來說，心肌細胞在出生前邊進行自律搏動，邊活躍地進行細胞分裂，從剛出生后就喪失了其分裂能力，另外由于不具有未分化的前體細胞，所以因暴露于心肌梗塞或心肌炎等各種壓力下，一旦導致心肌細胞死亡，喪失的心肌細胞不能補充。結果殘存心肌細胞通過代償性肥大雖然能夠維持心功能，但各種壓力仍持續(xù)存在，一旦超過其容許范圍，會進一步誘使心肌細胞疲憊、死亡，表現(xiàn)出心肌功能低下(即，心力衰竭)的狀態(tài)。
[0004]以心力衰竭為首的心臟病已成在日本成為位居第二的死亡原因，其預后也非常差，心臟疾病患者的5年生存率為50%左右。因此，認為治療效果好的心力衰竭治療法的開發(fā)與醫(yī)療福利的巨大進步以及醫(yī)療經濟的改善緊密相關。作為心力衰竭治療藥，以往一直使用使心肌收縮力增加的洋地黃制劑或黃嘌呤制劑等強心劑，已知這些藥劑長期服用，由于心肌能量的過度消耗，會使病情惡化。而最近，雖然使用可通過交感神經系統(tǒng)或腎素-血管緊張素系統(tǒng)的亢進來減輕過度的心臟負荷的β抑制劑和ACE阻礙藥進行治療已經成為主流，這些藥物不過是對癥的治療法，并不是可使受到傷害的心組織本身恢復的藥物。此外，心臟移植是對于重癥心力衰竭的根本治療法，但由于臟器提供者不足以及醫(yī)療倫理、患者肉體的、經濟的負擔重等問題，難以將本法作為一般的治療法經常使用。
[0005]因此，認為對衰弱的或喪失的心肌細胞進行補充性移植的方法對于心力衰竭的治療非常有用。事實上，在使用動物的實驗中，已知從胎兒取得未成熟的心肌細胞，將它移植到發(fā)育成熟心臟組織，移植細胞可作為心肌細胞起到有效作用(參照非專利文獻I)。然而，難以用該方法取得大量心肌細胞，從倫理觀點看，也難以應用到臨床醫(yī)療。
[0006]因此，由未分化干細胞分化誘導心肌細胞，將該細胞作為移植用細胞而進行利用的方法近年來特別引人注目。目前，由于尚未發(fā)現(xiàn)能明確鑒定為可作為在發(fā)育成熟心臟組織中能產生心肌細胞的前體細胞或干細胞的細胞集團，為了實施上述方法，考慮使用更為未分化的而且具有多種細胞分化能力的多能性干細胞。
[0007]所謂多能性干細胞(pluripotent stem cells)被定義為通過體外培養(yǎng)仍保持未分化狀態(tài)，幾乎可進行永久或長期的細胞增殖，呈現(xiàn)正常的核(染色體)型，在適當?shù)臈l件下，具有分化為三胚層(外胚層，中胚層和內胚層)所有譜系細胞的能力的細胞?，F(xiàn)在，作為多能性干細胞，最熟知的有從初期胚分離的胚胎干細胞(embryonic stem cells:ES細胞)、從胎兒期的原始生殖細胞分離的胚胎生殖細胞(embryonic germ cells:EG細胞)以及從發(fā)育成熟骨髓分離的成人型多能性干細胞(multipotent adult progenitor cells:MAPC)3 種。
[0008] 特別是ES細胞以前就知道通過體外培養(yǎng)可以分化誘導為心肌細胞。初期的研究幾乎都是使用來自小鼠的ES細胞進行的。如果對ES細胞在單一細胞狀態(tài)(通過實施酶處理等，細胞之間沒有粘附的各個細胞分散的狀態(tài))下，在沒有白血病抑制因子(leukemiainhibitory factor:LIF)等分化抑制因子存在下進行懸浮培養(yǎng)，ES細胞彼此粘附、凝集，形成稱為胚狀體(embryoid body:EB)的類似初期胚的結構體。已知然后，通過以懸浮狀態(tài)或粘附狀態(tài)培養(yǎng)EB，出現(xiàn)了具有自發(fā)搏動性的心肌細胞。
[0009]上述那樣制備的來自ES細胞的心肌細胞呈現(xiàn)出與來自胎兒心臟的未成熟心肌細胞非常類似的特性(參照非專利文獻2，3)。此外，實際上，有將來自ES細胞的心肌細胞移植到發(fā)育成熟心臟組織的動物實驗例中，幾乎與移植了胎兒心肌的例子沒有變化，也確認表現(xiàn)出極高的有效性(參照專利文獻1，非專利文獻4)。
[0010]1995年，Thomson等人首次通過由靈長類建立ES細胞，使用來自多能性干細胞的心肌細胞的心肌再生治療法的實際應用成為可能(參照專利文獻2，非專利文獻5)。接下來他們還成功地實現(xiàn)了從人初期胚分離、建立人ES細胞株(參照非專利文獻6)。另外，Gearhart等人也由人原始生殖細胞建立了 hEG細胞株(參照非專利文獻7,專利文獻3)。
[0011]Kehat等人(參照非專利文獻8)以及Chunhui等人(參照專利文獻4,非專利文獻9)報告了與小鼠ES細胞同樣，也可以由人ES細胞分化誘導心肌細胞。如果根據這些報告，不用說由人ES細胞分化誘導的心肌細胞具有自發(fā)搏動能力，在表達、產生肌球蛋白重鏈/輕鏈和α -輔肌動蛋白、肌鈣蛋白1、心房性利尿肽(artial natriuretic peptide ；ANP)等心肌特異性蛋白質、GATA-4或Nkx2.5、MEF_2c等心肌特異性轉錄因子的同時，微細解剖學的觀察以及電生理學的解析也表明保持著胎兒期的未成熟心肌細胞的特性，預期可用于再生醫(yī)療。
[0012]另外，作為將來自多能性干細胞的心肌細胞用于細胞移植治療或其它目的時的重要問題，例如:使用以往方法由ES細胞或EG細胞形成的EB除了發(fā)育為心肌細胞以外，還可發(fā)育為包括血細胞、或血管細胞、神經細胞、腸細胞、骨/軟骨細胞等在內的其它種類的細胞。另外，在這些分化的細胞中，心肌細胞所占比例不太高，只不過為整體的5~20%左右。
[0013]作為從混有其它種類細胞的細胞溶液中有選擇性地只挑選心肌細胞的方法，例如，通過對ES細胞的基因進行人為修飾,賦予耐藥性或異地表達(ectopic expression)能力，回收心肌細胞或具有作為其前體細胞特性的細胞的方法。例如，F(xiàn)ield以及共同研究者等構建了通過將在α型肌球蛋白重鏈啟動子調控下，可表達新霉素(G418)耐性基因的基因序列組導入小鼠ES細胞，只在該ES細胞向心肌細胞分化，并伴隨分化進行α型肌球蛋白重鏈基因表達時，可在添加了 G418的培養(yǎng)基中存活的體系(參照專利文獻1，非專利文獻4)。通過該方法作為G418耐性細胞挑選的細胞以99%以上的概率確認是心肌細胞。然而，使用該方法，雖然心肌細胞的純度非常高，但最終得到的心肌細胞數(shù)不過為全細胞數(shù)的百分之幾程度，不容易獲得移植治療所必需的心肌細胞。
[0014]最近，Chunhui等人報告了通過用5-氮雜胞(嘧啶核)苷對人ES細胞進行處理，EB中的肌鈣蛋白I陽性(心肌)細胞由15%增加到44% (參照非專利文獻9)，在該方法中，心肌細胞所占比例沒有超過EB中的50 %。另外，脫甲基化劑5-氮雜胞(嘧啶核)苷是通過使與DNA結合的甲基脫掉，使基因的表達狀態(tài)變化的藥劑，由于藥劑直接作用于染色體，所以不合適作為制備移植用細胞的藥劑。
[0015]另外，作為使由ES細胞更高效率地產生心肌細胞的方法，已知例如，在小鼠ES細胞中添加視黃酸(參照非專利文獻10)或抗壞血酸(參照非專利文獻11)、TGF0、BMP-2(參照非專利文獻12)，H)GF (參照非專利文獻13) ,Dynorphin B (參照非專利文獻14)、或使細胞內的活性氧類(reactive oxigen species:R0S)(參照非專利文獻15)和Ca2+(參照非專利文獻16)增加的處理可起到促進心肌細胞的分化誘導作用。然而，無論使用那一種方法，心肌細胞特異的或有選擇性的分化誘導都尚未成功。 [0016]分泌性蛋白質頭蛋白(Noggin)和索蛋白(Chordin)當初作為非洲爪蟾胚中的神經誘導因子被鑒定(參照非專利文獻17，18，專利文獻5~8)。已報道通過其后的研究，頭蛋白和索蛋白通過與具有抑制神經細胞的發(fā)育、分化效果的BMP(Bone MorphogenicProtein ;骨形成因子)家族分子結合，阻斷其信號傳導，表現(xiàn)出神經誘導效果(參照非專利文獻19~21)。實際上，即使在使用小鼠ES細胞的實驗中，也表明通過對頭蛋白基因或索蛋白基因進行恒定表達，可誘導向神經細胞的分化(參照非專利文獻22)。
[0017]另外，據報道如果將人ES細胞用添加頭蛋白的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，通過抑制ES細胞內因性產生的BMP-2的作用，ES細胞向胚體外內胚層細胞的分化被抑制，在ES細胞保持未分化狀態(tài)的同時，通過繼續(xù)在神經分化培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，可促進向神經細胞的分化誘導(參照專利文獻9)。
[0018]另外，據報道在使用雞胚(參照非專利文獻23)，非洲爪蟾胚(參照非專利文獻24)或小鼠胚胎癌細胞(參照非專利文獻25)的以往的解析中，對于心肌細胞的發(fā)育和/或分化，BMP家族分子起著促進作用，如果通過頭蛋白刺激阻礙其作用，心肌細胞的發(fā)育和/或分化也就被抑制了。
[0019]因此，通過利用頭蛋白、或索蛋白或其它BMP信號抑制因子，促進心肌細胞發(fā)育、分化的嘗試到目前為止完全沒有。
[0020]【專利文獻I】美國專利第6015671號說明書
[0021]【專利文獻2】美國專利第5843780號說明書
[0022]【專利文獻3】美國專利第6090622號說明書
[0023]【專利文獻4】國際專利公開第03/ 06950號小冊子
[0024]【專利文獻5】國際專利公開第94/ 05791號小冊子
[0025]【專利文獻6】美國專利第5，679，783號說明書
[0026]【專利文獻7】美國專利第5，846，770號說明書
[0027]【專利文獻8】美國專利第5，986，056號說明書
[0028]【專利文獻9】國際專利公開第01/ 98463號小冊子
[0029]【非專利文獻I 】Soonpaa 等人，Science, 264:98,1994
[0030]【非專利文獻2】Maltsev 等人，Mech.Dev.,44:41,1993
[0031]【非專利文獻3】Maltsev 等人，Circ.Res.,75:233，1994
[0032]【非專利文獻4】Klug 等人，J.Clin.1nvest.,98:216,1996
[0033]【非專利文獻5】Thomson 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 92:7844,1995
[0034]【非專利文獻6】Thomson 等人，Science, 282:114,1998
[0035]【非專利文獻7】Shamblott 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 95:13726，1998[0036]【非專利文獻8】Kehat 等人，J.Clin.1nvest.，108:407,2001
[0037]【非專利文獻9】Chunhui 等人，Circ.Res.,91:508,2002
[0038]【非專利文獻10】Wobus 等人，J.Mol.Cell.Cardiol.,29:1525,1997
[0039]【非專利文獻11】Takahashi 等人，Circulation，107:1912,2003 [0040]【非專利文獻12IBehfar 等人，F(xiàn)ASEB J.，16 =1558,2002
[0041]【非專利文獻13】Sachinidis 等人，Cardiovasc.Res.，58:278, 2003
[0042]【非專利文獻14】Ventura 等人，Circ.Res.,92:623,2003
[0043]【非專利文獻15] Sauer 等人，F(xiàn)EBS Lett.,476:218,2000
[0044]【非專利文獻16】Li 等人，J.Cell Biol.，158:103，2002
[0045]【非專利文獻17】Smith & Harland, Cell, 70:829,1992
[0046]【非專利文獻18】Sasai 等人，Cell, 79:779，1994
[0047]【非專利文獻19】Re' em-Kalma 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA，92:12141，1995
[0048]【非專利文獻2O】Zimmerman 等人，Cell,86:599,1996
[0049]【非專利文獻21】Piccolo 等人，Cell,86:589，1996
[0050]【非專利文獻22】Gratsch & O' Shea, Dev.Biol., 245:83, 2002
[0051]【非專利文獻23】Schultheiss 等人，Genes Dev.，11:451,1997
[0052]【非專利文獻24】Sparrow 等人，Mech.Dev.,71:151,1998
[0053]【非專利文獻25IMonzen 等人，Mol.Cell.Biol.，19:7096,1999

【發(fā)明內容】

[0054]【發(fā)明要解決的課題】
[0055]本發(fā)明以提供將未分化的干細胞高效率而且有選擇性地分化誘導為心肌細胞的方法，通過該方法得到的心肌細胞和將該細胞進行以心臟病為靶的細胞移植、注入以及在其它治療中使用的方法等作為課題。
[0056]【用于解決課題的手段】
[0057]本發(fā)明主要涉及到以下內容。
[0058](I)由干細胞分化誘導心肌細胞的方法，其特征是在抑制BMP信號傳導物質存在下，對干細胞進行分化誘導的培養(yǎng)。
[0059](2)上述⑴所述的方法，其中，用于分化誘導的干細胞的培養(yǎng)包括進行懸浮凝集培養(yǎng)、使胚狀體形成的工序。
[0060](3)上述⑴所述的方法，其中，包括用于分化誘導的干細胞的培養(yǎng)與飼養(yǎng)細胞進行共培養(yǎng)的工序。
[0061](4)上述(I)所述的方法，其中，包括用于分化誘導的干細胞的培養(yǎng)在培養(yǎng)容器上進行平面培養(yǎng)的工序。
[0062](5)上述⑴~(4)任一項所述的方法，其中，只在分化誘導期的最初數(shù)日內添加抑制BMP信號傳導的物質。
[0063](6)上述(I)~(4)任一項所述的方法，其中，包括預先用抑制BMP信號傳導的物質對分化誘導期前的干細胞進行處理的工序。
[0064](7)上述(I)~⑷任一項所述的方法，其中，包括預先用抑制BMP信號傳導的物質對分化誘導期前的干細胞進行處理的工序，而且只在分化誘導期的最初數(shù)日內添加抑制BMP信號傳導的物質。
[0065](8)上述⑴~(7)任一項所述的方法，其中，抑制BMP信號傳導的物質是BMP拮抗劑。
[0066](9)上述⑶所述的方法，其中，BMP拮抗劑是從頭蛋白、索蛋白、胎球蛋白、抑濾泡素、sclerostin、DAN、Cerberus、gremlin、和Dante,以及它們的相關蛋白質中選出的I個或多個。
[0067](10)上述(1)~(9)任一項所述的方法，其中，干細胞是具有在試管內培養(yǎng)下可向心肌細胞分化能力的來自哺乳動物的細胞。
[0068](11)上述(10)所述的方法，其中，具有可向心肌細胞分化能力的來自哺乳動物的細胞是多能性干細胞或來自該細胞的細胞。
[0069](12)上述(11)所述的方法，其中，多能性干細胞是胚胎干細胞、具有類似于胚胎干細胞形態(tài)的細胞、胚胎生殖細胞或成人型多能性干細胞。
[0070](13)上述(12)所述的方法，其中，多能性干細胞是胚胎干細胞。
[0071](14)上述⑴~(13)所述的方法，其中，干細胞來自人。
[0072](15)包括上述(1)~(14)任一項所述的方法的心肌細胞制造方法。
[0073](16)通過上述(1)~(14)任一項所述的方法得到的心肌細胞。
[0074](17)心臟病的治療方法，是在起因于心肌細胞衰弱、功能停止或死亡的心臟病治療方法中，將上述(16)所述的心肌細胞投給(移植)到心肌細胞衰弱、功能停止或死亡的部位或其周邊。
[0075](18)篩選方法，是在起因于心肌細胞衰弱、功能停止或死亡的心臟病治療方法中，使測試物質與上述(16)所述的心肌細胞接觸，對該細胞向心肌細胞的分化效率或其細胞功能的質的或量的變化進行測定。
[0076](19)起因于心肌細胞衰弱、功能停止或死亡的心臟病治療用的醫(yī)藥組合物或支持體，作為有效成分含有上述(16)所述的心肌細胞。
[0077]本發(fā)明人等就使用多能性干細胞，特別是最頻繁使用的ES細胞作為制備心肌細胞的干細胞源，向心肌細胞或其前體細胞的分化誘導條件不斷進行了各種研究，結果發(fā)現(xiàn)通過在培養(yǎng)時的某一期間，向培養(yǎng)基中添加抑制骨形成因子(Bone Morphogenic Protein ；BMP)信號傳導的物質，被證實為具有搏動能力的心肌細胞的細胞比以往方法更有選擇性、而且更有效發(fā)育，另外還發(fā)現(xiàn)如添加過量的BMP，通過抑制BMP信號傳導的物質處理產生的心肌分化誘導效果明顯降低，結果表明BMP信號的抑制促進誘導多能性干細胞向心肌細胞的分化，直至完成本發(fā)明。
[0078]在本發(fā)明中，所謂抑制BMP信號傳導的物質指的是具有阻礙或阻斷BMP的信號傳導作用的物質，例如，BMP拮抗劑或抗BMP家族分子的特異的中和抗體、可溶化型(細胞膜非結合型)BMP受體分子等。另外的例子，如抑制或停止BMP家族分子或其受體基因的功能性基因產物的表達、或抑制或停止規(guī)定BMP信號傳導途徑的反式激活(作用)性成分的基因表達的基因表達載體、特異的反義寡核苷酸、核酶、RNA干涉用反義RNA、低分子化合物等。
[0079]通過本發(fā)明的方法由多能性干細胞制備的搏動性細胞是具有“心肌細胞”特征的細胞，可以確認例如GATA- 4，TEF-1，Tbx-5，MEF2和MLC_2v等心肌特異的轉錄因子基因表達以及作為心肌特異標志的肌節(jié)/肌球蛋白、肌鈣蛋白1、α-輔肌動蛋白、ANP等蛋白表達。
[0080]另外，在本發(fā)明中，作為多能性干細胞的分化誘導法，不僅一般常用的懸浮凝集培養(yǎng)法，而且懸滴(hanging drop)培養(yǎng)法以及使用飼養(yǎng)細胞的共培養(yǎng)法中的任一種方法也都可得到同樣的效果。
[0081]另外，在研究抑制BMP信號傳導的物質的添加時期和期間時，使多能性干細胞分散為由單一細胞或少數(shù)細胞構成的細胞塊，通過懸浮凝集培養(yǎng)或與飼養(yǎng)細胞的共培養(yǎng)等方法誘導分化時，如果預先將多能性干細胞用BMP拮抗劑進行預處理、或只是在剛開始進行分化誘導培養(yǎng)后數(shù)日間添加、或將兩者組合更有效。而當在與懸浮細胞或飼養(yǎng)細胞共培養(yǎng)等實施期間使BMP拮抗劑恒定存在時，顯示由多能性干細胞向心肌細胞的分化誘導效率非常低下。
[0082]即，本發(fā)明涉及以在抑制BMP信號傳導的物質的短暫刺激下進行培養(yǎng)為特征的將多能性干細胞分化誘導為心肌細胞的方法和制備心肌細胞的方法。
[0083]本發(fā)明中所謂具有心肌分化能力的干細胞指的是在試管內培養(yǎng)下具有可向心肌細胞分化能力的細胞，例如，多能性干細胞、間充質干細胞、CMG細胞和SPoC細胞等。而所謂多能性干細胞指的是通過試管內培養(yǎng)仍保持未分化狀態(tài)，幾乎可進行持續(xù)不斷的或長期間的細胞增殖，呈現(xiàn)正常的核(染色體)型，在適當條件下具有分化為三胚層(外胚層、中胚層和內胚層)所有譜系細胞的能力的細胞，例如，ES細胞、ES類似細胞、EG細胞和MAPC等。
[0084]在另外的實施方式中，本發(fā)明涉及到通過分化誘導多能性干細胞制備的表現(xiàn)出心肌細胞的形態(tài)學、生理學和/或免疫學上特征的細胞。對生理學和/或免疫學的特征雖然沒有特別限定，但利用本發(fā)明方法制備的細胞能表達對于被識別為心肌細胞的心肌細胞特異的I個或I個以上的標志即可。
[0085]本發(fā)明涉及到為了鑒定可促進心肌細胞發(fā)育以及分化誘導、再生、存活等的新的因子或可能的化學治療劑，使用通過本發(fā)明方法制備的細胞的篩選方法。
[0086]本發(fā)明還涉及到用于將多能性干細胞分化誘導為具有心肌前體細胞或心肌細胞形態(tài)學、生理學和/或免疫學特征的細胞的試劑盒。這樣的試劑盒對于實施本發(fā)明的方法有用。
[0087]在另外的實施方式中，本發(fā)明涉及到以使用本發(fā)明方法制備的細胞為特征的治療處于心臟病狀態(tài)的心臟的方法以及以用本發(fā)明方法制備的細胞作為有效成分的心臟病治療藥。
[0088]本發(fā)明這些優(yōu)點以及其它優(yōu)點和特征在以下適合的實施方式的詳細說明中進行了充分描述。
[0089]另外，在本發(fā)明的實施中，有關使用多能性干細胞的細胞培養(yǎng)和發(fā)育、細胞生物學實驗的一般方法，實施者可參照該領域的標準參考書籍。其中包括Guide to Techniquesin Mouse Development (Wasserman等人編，Academic Press, 1993) ；Embryonic Stem CellDifferent iation in vitro(Μ.V.Wiles, Meth.Enzymol.,225:900,1993) !Manipulatingthe Mouse Embryo:A laboratory manual (Hogan等人編，Cold SpringHarbor LaborayoryPress, 1994) ；Embryonic Stem Cells (Turksen 編，Humana Press, 2002)。在本說明書中可參照的用于細胞培養(yǎng)、發(fā)育和細胞生物學實驗的試劑和試劑盒類可以從Invitrogen /GIBCO公司或Sigma公司等銷售商買到。
[0090]發(fā)明的效果
[0091]通過使用本發(fā)明方法，可以由干細胞有效且有選擇性地生產心肌前體細胞和心肌細胞。這樣制備的心肌(前體)細胞可在對心臟病治療有效的藥劑的探索、開發(fā)中利用的同時，還有可能適用于對嚴重心臟病的心肌移植治療。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0092]【圖1A】在使用懸浮培養(yǎng)法的ES細胞(EB3)的心肌分化誘導系中，頭蛋白(500ng / mL)的添加對搏動性EB出現(xiàn)的影響。
[0093]【圖1B】在使用懸滴培養(yǎng)法的ES細胞(EB3)的心肌分化誘導系中，頭蛋白(500ng / mL)的添加對搏動性EB出現(xiàn)的影響。
[0094]【圖2】頭蛋白添加濃度不同對搏動性EB出現(xiàn)率的影響。算出由ES細胞(EB3細胞和Rl細胞)形成EB，懸浮培養(yǎng)后第10日的搏動性EB的出現(xiàn)率。
[0095]【圖3】頭蛋白添加對心肌特異標志基因表達的影響。在懸浮培養(yǎng)后第0、5、10、15日后回收EB(來自EB3細胞)，研究各基因的表達。TEF-1:轉錄增強因子-1 (transcri ptionenhancer factor-1), MEF_2c:肌肉增強因子-2c (muscle enhancement factor-2c)，a -MHC: a -肌球蛋白重鏈(a -myosin heavy chain)，MLC_2v:肌球蛋白輕鏈 ~2v (myosinlight chain-2v)，GAPDH:甘油醒-3-憐酸脫氫酶(glycera ldehyde-3-phosphatedehydrogenase)
[0096]【圖4】對從懸浮培養(yǎng) 后第10日的頭蛋白⑴組EB(來自EB3細胞)分離、回收的心肌細胞進行免疫染色的結果。a:肌原纖維節(jié)和肌球蛋白，b:肌鈣蛋白I，c: α -輔肌動蛋白，d =ANP
[0097]【圖5】對懸浮培養(yǎng)后第10日的頭蛋白⑴組和頭蛋白㈠組EB(來自EB3細胞)內的心肌細胞進行免疫染色的結果。a、b:肌原纖維節(jié)和肌球蛋白，C、d:肌鈣蛋白I，e、f:α-輔肌動蛋白，g、h:ΑΝΡ
[0098]【圖6】ΒΜΡ對頭蛋白的心肌分化誘導作用的阻礙效果。
[0099]【圖7Α】頭蛋白處理在使用飼養(yǎng)細胞的心肌分化誘導系中的效果。將ES細胞(Rl)接種在ST2飼養(yǎng)細胞上，研究其心肌分化。在接種第8日使用抗肌原纖維節(jié)和肌球蛋白抗體(MF20)的染色照片。η>5?！?對頭蛋白(_)組ρ〈0.01
[0100]【圖7Β】頭蛋白處理在使用飼養(yǎng)細胞的心肌分化誘導系中的效果。將ES細胞(Rl)接種到ST2飼養(yǎng)細胞上，研究其心肌分化。在接種第8日的MF20陽性集落的出現(xiàn)率。η>5。^:對頭蛋白(-)組p〈0.01
[0101]【圖7C】頭蛋白處理在使用飼養(yǎng)細胞的心肌分化誘導系中的效果。將ES細胞(Rl)接種到ST2飼養(yǎng)細胞上，研究其心肌分化。接種第12日的搏動性集落的出現(xiàn)率。η>5?！?對頭蛋白(-)組Ρ〈0.01
[0102]【圖8】在使用懸滴培養(yǎng)法的ES細胞(Rl)的心肌分化誘導系中，索蛋白(500ng/mL)的添加對搏動性EB出現(xiàn)的影響與添加頭蛋白(500ng / mL)時比較的結果。培養(yǎng)天數(shù)為開始懸滴培養(yǎng)之后的天數(shù)。n=8。※:對未添加組(_)，p〈0.01
[0103]【圖9】在使用懸浮培養(yǎng)法的ES細胞(Rl)的心肌分化誘導系中，索蛋白(500ng/mL)的添加對搏動性EB出現(xiàn)的影響。C:添加索蛋白，N:添加頭蛋白(150ng / mL)，(-):沒有添加。將EB形成前的處理與EB形成后的處理用“預處理”一“后處理”表示形式表示。
[0104]【圖10】在使用懸浮培養(yǎng)法的ES細胞(Rl)的心肌分化誘導系中，各種BMP拮抗蛋白質(各150ng / mL)的添加對搏動性EB出現(xiàn)的影響。
【具體實施方式】
[0105]本內容中，所謂“心肌細胞”包括將來具有可成為功能性心肌細胞的能力的心肌前體細胞以及胎兒型心肌細胞、發(fā)育成熟型心肌細胞的所有分化階段的細胞，定義為通過以下所述的至少I個、最好是多個方法能夠確認至少I個、最好是多個標志或基準的細胞。 [0106]心肌細胞中特異的各種標志的表達可通過以往的生物化學或免疫化學的手法進行檢測。該方法雖然沒有特別限定，但最好是使用免疫組織化學的染色法或免疫電泳法那樣的免疫化學的手法。在這些方法中，可以使用與心肌前體細胞或心肌細胞結合的標志特異的多克隆抗體或單克隆抗體。以各個特異的標志作為靶的抗體已經有商品銷售，容易使用。心肌前體細胞或心肌細胞中特異的標志，例如肌球蛋白重鏈/輕鏈或α-輔肌動蛋白、肌鈣蛋白 1、ANP、GATA-4、Nkx2.5、MEF_2c 等。
[0107]或者，心肌前體細胞或心肌細胞特異的標志的表達通過稱之為利用逆轉錄酶的聚合酶鏈式反應(RT-PCR)或雜交分析的用于對編碼任意標志蛋白質的mRNA進行擴增、檢測、解析的以往經常使用的分子生物學方法可以確認，但對其手法沒有特別限制。編碼心肌前體細胞或心肌細胞中特異的標志(例如，肌球蛋白重鏈/輕鏈和α-輔肌動蛋白、肌鈣蛋白
1、ANP、GATA-4、Nkx2.5、MEF-2c)蛋白質的核酸序列已知，可利用基因庫(GenBank)那樣的公共數(shù)據庫，容易決定作為引物或探針使用的必需的特異標志的序列。
[0108]另外，為了確認多能性細胞向心肌細胞的分化，也可進一步使用生理學的基準。即，來自多能性細胞的細胞具有自立的搏動性以及表達各種離子通道，能夠對電生理刺激反應等都成為其有用的指標。
[0109]作為本發(fā)明使用的多能性干細胞，可舉出已廣泛作為培養(yǎng)細胞使用的來自小鼠、猴、人等哺乳動物的ES細胞、EG細胞、MAPC等，但不包括從人類胚胎分離的干細胞。作為來自小鼠ES細胞的具體例子，可舉出EB3細胞、E14細胞、D3細胞、CCE細胞、Rl細胞、129SV細胞、Jl細胞等。另外有關ES細胞、EG細胞、MAPC的制備、傳代、保存法已經確立了標準的程序，實施者通過參照前面列舉的參考書籍以及很多參考文獻(Masui等人，Cell, 70:841，1992 ；Shamblott 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,95:13726,1998 ;美國專利第 6090622號Jiang等人，Nature，418 =41,2002 ;國際專利公開01 / 11011)，能夠容易使用這些多能性干細胞。不過，不包含從人胚胎分離的干細胞。
[0110]另外，本發(fā)明中可以使用的細胞不限于上述3種，包括來自哺乳動物的胚或胎兒、臍帶血、或發(fā)育成熟臟器或骨髓等發(fā)育成熟組織、血液等的所有多能性干細胞。不過，不包含從人胚胎分離的干細胞。作為具體例子，可舉出毛根鞘細胞或表皮細胞經5-氮雜胞(嘧唳核)苷等藥劑處理后得到的干細胞(Sharda & Zahner,國際專利公開第02 / 051980號)或單核球細胞經CR3 / 43抗體處理后得到的干細胞(Abul jadayel, Curr.Med.Res.0pinion, 19:355, 2003),以及來自發(fā)育成熟內耳細胞的干細胞(Li等人，Nature Med.,Advance online pubIicat ion)等具有與ES細胞類似形態(tài)的干細胞。此時所謂的與ES細胞類似的形態(tài)可以相據ES細胞中具有特異的細胞生物學性質來定義，例如ES細胞中特異的表面(抗原)標志的存在、或ES細胞特異基因的表達、或具有畸胎瘤(teratoma)形成能力或具有嵌合小鼠形成能力。
[0111]另外，即使是不具有與ES細胞類似形態(tài)的細胞或不是多能性干細胞的細胞，只要是具有至少在試管內培養(yǎng)下可分化為具有心肌細胞那樣形態(tài)的細胞性質的細胞，就可以使用本發(fā)明所述的方法。作為這樣細胞的例子，如來自于骨髓細胞的骨髓間充質干細胞(Bruder 等人，美國專利第 5736396 號；Pittenger 等人，Science, 284:143，1999)和 CMG 細胞(Makino 等人，J.Clin.1nvest.，103 =697,1999 ;國際專利公開第 01 / 048151 號)，來自肌肉組織的Spoc細胞(國際專利公開第03 / 035382號)。
[0112]在本發(fā)明中，作為由多能性干細胞制備心肌細胞的培養(yǎng)法，只要是適合心肌細胞分化誘導的方法，可以使用任一種方法，例如使用ES細胞時，可舉出懸浮凝集培養(yǎng)法、懸滴(hanging drop)培養(yǎng)法、與支持細胞的共培養(yǎng)法、旋轉培養(yǎng)法、軟瓊脂培養(yǎng)法、微載體培養(yǎng)法等。作為具體方法的例子，例如使用懸浮凝集培養(yǎng)法時，將成為單一細胞狀態(tài)(通過實施酶消化等，細胞之間沒有粘連的各個細胞在液相中分散的狀態(tài))的ES細胞優(yōu)選按照濃度為10細胞/ mL~I X IO7細胞/ mL，更優(yōu)選100細胞/ mL~I X IO6細胞/ mL細胞密度那樣懸浮于培養(yǎng)基中，接種到培養(yǎng)板后，4~30日，優(yōu)選6~15日，于37°C、通5%的二氧化碳的CO2條件下進行培養(yǎng)的方法。
[0113]而作為另外的實施方式，當使用與支持細胞的共培養(yǎng)法時，作為支持細胞雖然沒有特別限定，優(yōu)選具有間充質細胞性質的細胞，更優(yōu)選ST2細胞、0P9細胞、PA6細胞等具有骨髓基質細胞那樣形態(tài)的細胞。通過對這些支持細胞進行高密度培養(yǎng)、絲裂霉素C處理、或放射線照射等方法做成飼養(yǎng)層，然后以懸浮的單一細胞狀態(tài)將ES細胞接種于培養(yǎng)基，使ES細胞達到I細胞/ mL~IX IO6細胞/ mL、優(yōu)選100細胞/ mL~1父105細胞/ mL、更優(yōu)選I X IO3細胞/ mL~IX IO4 細胞/ mL細胞密度后，于37°C、通5%的二氧化碳的CO2條件下培養(yǎng)4~30日、優(yōu)選6~15日。
[0114]在本發(fā)明中，所謂抑制BMP信號傳導的物質指的是具有阻礙或阻斷BMP的信號傳導的作用的物質，例如，BMP拮抗劑或抗BMP家族分子的特異的中和抗體、可溶化型(非細胞膜結合型)BMP受體分子等。作為另外的例子，如抑制或停止BMP家族分子或其受體基因的功能性基因產物的表達、或抑制或停止規(guī)定BMP信號傳導途徑的反式激活(作用)性成分的基因表達的基因表達載體、特異的反義寡核苷酸、核酶、RNA干涉用反義RNA、低分子化合物等。
[0115]而所謂BMP拮抗劑被定義為與BMP家族分子(例如BMP-2、BMP-4、BMP-7等)結合、阻礙或抑制BMP分子與細胞表面上的BMP受體結合的物質、或通過結合BMP受體引起B(yǎng)MP信號傳導的抑制或阻斷的物質。作為本發(fā)明中優(yōu)選的BMP拮抗劑，例如，可舉出頭蛋白和索蛋白等，另外，如與該蛋白質在氨基酸序列上具有80%以上、更優(yōu)選90%以上同源性，而且具有BMP拮抗劑活性的頭蛋白相關蛋白質或索蛋白相關蛋白質，另外通過由與編碼頭蛋白或索蛋白的堿基在嚴格條件(例如，2x SSC)進行雜交的堿基編碼的頭蛋白相關蛋白質或索蛋白相關蛋白質也同樣包括在內。
[0116]本發(fā)明以在短暫抑制BMP信號的物質刺激下對多能性干細胞進行培養(yǎng)為特征，作為該刺激方法雖然沒有特別限定，但優(yōu)選如在培養(yǎng)基中添加純化重組蛋白質的方法。此外，只要是表現(xiàn)出與將抑制BMP信號的物質作為純化重組蛋白質添加到培養(yǎng)基中的方法同樣效果的方法，可以使用任一種方法。例如，添加從生體組織提取、純化的頭蛋白等BMP拮抗劑的方法；將頭蛋白等BMP拮抗劑的基因表達載體導入多能性干細胞自身的方法；將頭蛋白等BMP拮抗劑基因表達載體導入支持細胞，該導入細胞作為共培養(yǎng)細胞使用的方法；或使用該導入細胞的培養(yǎng)上清等細胞產生物的方法等，任一種在培養(yǎng)基中添加了 BMP拮抗劑的實施方式都包括本發(fā)明的方法中。
[0117]在本發(fā)明的實施中，使用的抑制BMP信號的物質的蛋白質和基因優(yōu)選是來自與多能性干細胞來自種類同種的動物的蛋白質和基因，例如，用小鼠多能性干細胞實施本發(fā)明時，將小鼠的頭蛋白cDNA與免疫球蛋白恒定(Fe)區(qū)cDNA連接的融合基因導入小鼠細胞，使其表達制備的純化重組蛋白質(Recombinant Mouse Noggin / Fe Chimera ；R & Dsystems公司，Genzyme Technology公司)在市場已有銷售,可以很容易用作為來自小鼠的頭蛋白。另外，也可以使用來自異種動物的頭蛋白，將人的頭蛋白cDNA導入大腸桿菌，使其表達制備的純化重組蛋白質(P印roTech公司銷售)作為代用。另外也可以使用來自豬、羊、馬、或鳥類(例如，雞等)、或兩棲類(例如，非洲爪蟾等)的頭蛋白。對于索蛋白和其它的BMP拮抗劑也同樣可以使用類似的蛋白質.另外，編碼這些因子的基因的堿基序列可利用美國Nationa 1 Center for Biotechno logy (NCB I)等公共的DNA數(shù)據庫，只要是本領域技術人員，就可以獲取、使用該基因的cDNA。例如，頭蛋白和索蛋白基因已經通過人或小鼠鑒定，人的頭蛋白、小鼠的頭蛋白、人的索蛋白、以及小鼠的索蛋白的堿基序列已經分別以access 登記號:NM#005450、NM#008711、NM#073411、NM#009893 記錄在 NCBI 的數(shù)據庫。
[0118]作為本發(fā)明的BMP拮抗劑，只要是與BMP家族分子(例如BMP-2、BMP-4、BMP-7等)結合，阻礙或抑制BMP分子與細胞表面上的BMP受體結合的物質、或通過結合BMP受體，引起B(yǎng)MP信號傳導的抑制或阻斷的物質就可以，作為典型例子，如頭蛋白(Re' em-Kalma等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,92:12141,1995 ;Zimmerman 等人，Cell,86:599,1996)、以及索蛋白(Piccolo 等人，Cell，86:589，1996 ;De Robertis 等人，美國專利第 5679783號；LaVallie等人，美國專利第5846770號；Lavallie等人，美國專利第5986056號)。作為其它的BMP拮抗劑的具體例子，已知有抑濾泡素(follistatin)、胎球蛋白(fetuin)、sclerostin、以及屬于DAN / Serberus家族的分子等,作為該分子已知有DAN、cerberus、gremlin、Dante 等(Balemans & Hul,Dev.Biol.，250:231, 2002)?；蛘?，天然存在的 BMP 拮抗劑的合成或重組類似物也可用在實施本方法上。
[0119]另外在發(fā)明的實施中，作為處理多能性干細胞的方法，不限于只使用頭蛋白等BMP拮抗劑的方法，只要是產生與BMP拮抗劑同樣的效果，即引起B(yǎng)MP信號傳導抑制的方法都可以使用。作為引起B(yǎng)MP信號傳導抑制的方法的具體例子，可舉出使用抗BMP家族分子的特異的中和抗體的方法、使用可溶化型(非細胞膜結合型)BMP受體分子的方法等。其它的例子，可舉出將抑制或停止BMP家族分子或其受體基因的功能性基因產物的表達、或抑制或停止規(guī)定BMP信號傳導途徑的反式激活(作用)性成分的基因表達的基因表達載體、特異的反義寡核苷酸、核酶、RNA干涉用反義RNA、低分子化合物等導入細胞內的方法。
[0120]在本發(fā)明的實施中，對多能性干細胞使用抑制BMP信號傳導的物質(例如，頭蛋白、索蛋白等的BMP拮抗劑)時，使這些因子作用的期間可以分為2個時期。即，使多能性干細胞分散為由單一細胞或少數(shù)細胞構成的細胞塊，進行懸浮凝集培養(yǎng)或與支持細胞共培養(yǎng)等時刻的前和后，以下，將之前的時期稱為預處理期，后面的時期稱為分化誘導期。
[0121]對于預處理期的多能性干細胞，使抑制BMP信號傳導的物質作用的期間優(yōu)選是分化誘導期開始的前I~2日，優(yōu)選前3日以上。
[0122]另外，在預處理期，為了將ES細胞維持在未分化狀態(tài)，最好是根據該ES細胞的動物種類，在通常使用的條件下進行培養(yǎng)。即，對于小鼠ES細胞，最好是在培養(yǎng)基中添加100 ~10000U / mL,優(yōu)選 500 ~2000U / mL濃度的白血病抑制因子(Leukemia inhibitoryfactor:LIF)。
[0123]作為使抑制BMP的信號傳導的物質作用的期間，不需要整個培養(yǎng)期間都使該物質存在，例如，作為抑制BMP的信號傳導的物質使用頭蛋白或索蛋白等的BMP拮抗劑時，在BMP拮抗劑以具有活性狀態(tài)存在的培養(yǎng)基中的培養(yǎng)優(yōu)選在分化誘導期最初的5日以內，更優(yōu)選3日以內。但使抑制BMP的信號傳導的物質作用的期間可以根據使用的細胞來自的動物種類、使用的細胞株、使用的分化誘導以及使用的抑制BMP的信號傳導的物質等條件不同來改變最適合的天數(shù)。
[0124]在本發(fā)明的實施中，作為抑制BMP信號的物質使用BMP拮抗劑(例如，頭蛋白、索蛋白等)時，在將舊的培養(yǎng)基在無菌下除去后，最好用含有Ing / mL~2yg / ml,優(yōu)選5ng / mL~1000ng / mL,更優(yōu)選IOng / mL~500ng / mL濃度的頭蛋白、或用索蛋白的培養(yǎng)基取代，再繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)日。使用其它的抑制BMP信號的物質時，可以根據物質種類來變更為最適合的濃度后使用。
[0125]接下來，運用上述方法從以ES細胞為首的多能性干細胞分化誘導的心肌細胞通過使用公知方法中的細胞回收、分離、純化法，可以有效、且大量獲得高純度的心肌細胞。以下將這樣得到的心肌細胞稱之為根據本發(fā)明制備的心肌細胞。
[0126]心肌細胞的純化方法可以使用任一種已公知的細胞分離純化方法，作為具體例子，可舉出流式細胞儀、磁珠、淘篩法等根據抗原-抗體反應的方法(Monoc 1nalAnti bodies !principles and practice, Third Edition(Acad.Press,1993) ；AntibodyEngineering:APract ical Approach(IRL Press at Oxford Univers i ty Press,1996)以及通過使用蔗糖、Percoll等載體的密度梯度離心的細胞分級法。而作為其它的心肌細胞篩選法，可舉出在起始的ES細胞等多能性干細胞的基因上預先加上人為的修飾，通過賦予耐藥性或異地性蛋白質的表達能力，回收具有作為心肌細胞形態(tài)的細胞的方法。例如，F(xiàn)ield和共同研究者通過將在α型肌球蛋白重鏈啟動子的調控下可表達新霉素(G418)耐性基因的基因序列組導入小鼠ES細胞，構建了該ES細胞在添加了 G418培養(yǎng)基中可存活的體系，在該體系中ES細胞可分化為心肌細胞、同時僅伴隨著分化表達α型肌球蛋白重鏈基因，通過該方法以99%以上概率確認選作G418耐性細胞的細胞是心肌細胞(美國專利第6015671 號 J.Clin.1nvest.,98:216，1996)。
[0127]通過本發(fā)明制備的心肌細胞可用于各種生理活性物質(例如，藥物)和功能未知的新的基因產物等藥理評價和活性評價。例如，可以用于與由ES細胞等多能性干細胞向心肌細胞的分化調控有關的物質或藥劑的篩選、或與心肌細胞的功能調解有關的物質或藥劑的篩選、以及對心肌細胞有毒性或傷害性的物質或藥劑的篩選。特別是目前現(xiàn)狀幾乎不存在人心肌細胞的篩選法，根據本發(fā)明制備的心肌細胞可成為用于實施該篩選法的有用的細胞源。在另外一種方式中，含有根據本發(fā)明制備的心肌細胞的評價試劑盒也可用于上述篩選。
[0128]作為供篩選的測試物質，只要是可添加到培養(yǎng)系的物質無論什么種類都可以，例如，低分子化合物、高分子化合物、有機化合物、無機化合物、蛋白質、肽、基因、病毒、細胞、細胞培養(yǎng)液、微生物培養(yǎng)液等。作為將基因有效地導入培養(yǎng)系的方法，可舉出使用逆轉錄病毒、腺病毒等病毒載體添加到培養(yǎng)系的方法、或封入到脂質體等人工的構造物后添加到培養(yǎng)系的方法等。 [0129]可以通過測定由ES細胞等多能性干細胞向心肌細胞的分化誘導效率以及心肌細胞功能的質的或量的變化進行測試物質的評價。例如，測試物質的心肌分化誘導效率通過對使用本發(fā)明所述方法培養(yǎng)的多能性干細胞，在培養(yǎng)開始后第5~15日，優(yōu)選第7~12日時候，利用生物化學的或免疫化學的手法對在心肌細胞中特異的各種標志的表達進行檢測而測定。作為生物化學的或免疫化學的手法沒有特別限定，最好是使用象免疫組織化學的染色法或免疫電泳動法那樣的免疫化學的手法。在這些方法中，可以使用結合心肌細胞的標志特異的多克隆抗體或單克隆抗體。以各個特異的標志為靶的抗體有銷售商品，容易使用。心肌細胞中特異的標志，例如肌球蛋白重鏈/輕鏈或α -輔肌動蛋白、肌鈣蛋白Ι、ΑΝΡ、GATA-4、Nkx2.5、MEF_2c 等。
[0130]另外，作為評價測試物質的指標的心肌細胞功能，可舉出心肌細胞的存活性作為一例。具體來說，將通過本發(fā)明所述的方法制備的心肌細胞以合適的細胞密度接種到培養(yǎng)板，用不含有血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)時，可以誘導細胞死亡(凋亡)，而此時向培養(yǎng)基中添加適當量的測試物質，可以測定心肌細胞的存活率或死亡率。作為心肌細胞的存活率或死亡率的測定方法，可以使用以臺盼藍等色素摻入作為指標通過肉眼觀察的方法，也可以使用以脫氫酶的活性(還原活性)作為指標的方法，以及以凋亡細胞特異的半胱天冬酶活性或膜聯(lián)蛋白V的表達作為指標的方法。利用該機制的試劑盒,作為S i gma公司和Clohetech公司、Promega公司等許多丁家的利用該機制的試劑盒都有銷售，可輕易使用。
[0131]通過這樣的篩選方法得到的物質或藥劑由于具有心肌細胞的分化誘導作用和功能調解作用，可作為例如心肌梗塞、局部缺血心臟病、充血性心力衰竭、肥大型心肌病、擴張型心肌病、心肌炎、慢性心力衰竭等心臟病予防藥或治療藥使用。這些化合物可以是新的化合物，也可以是眾所周知的化合物。
[0132]另外通過本發(fā)明制備的心肌細胞可作為心肌再生藥或心臟疾患治療藥使用。心臟病如心肌梗塞、局部缺血心臟病、充血性心力衰竭、肥大型心肌病、擴張型心肌病、心肌炎、慢性心力衰竭等。作為心肌再生藥或心臟疾患治療藥，只要是含有根據本發(fā)明制備的高純度心肌細胞的藥，加工成使細胞懸浮于培養(yǎng)基等水性載體、將細胞包埋于生體分解性基質等支持體、或單層或多層心肌細胞層(Shimizu等人，Circ.Res.,90:e40, 2002)的形態(tài)等，無論什么樣形狀的藥都可以使用。
[0133]作為將上述治療藥輸送到損傷部位的方法，可舉出開胸，用注射器直接注入心臟的方法、通過外科手術將心臟的一部切開之后進行移植的方法、以及通過使用導管通過血管的方法進行移植的方法等(Murry 等人，Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.,67:519,
2002；Menasche, Ann.Thorac.Surg.,75:S20, 2003 ；Dowell 等人，Cardiovasc.Res.,58:336，2003)，沒有特別限定。據報道通過這樣方法，將從胎兒心臟回收的心肌細胞移植到心臟損傷動物的心臟，表現(xiàn)出非常好的治療效果(Menasche, Ann.Thorac.Surg.,75:S20,2003；ReffeImann 等人，Heart Fail.Rev.，8:201,2003)。來自 ES 細胞的的心肌細胞呈現(xiàn)出與來自胎兒心臟的心肌細胞非常類似的形態(tài)(MaltseV等人，Mech.Dev.,44 =41,1993 ；Circ.Res.,75:233，1994)。另外，還確認實際上在將來自ES細胞的心肌細胞移植到發(fā)育成熟心臟的動物實驗例中，與移植胎兒心肌的例子幾乎沒有什么變化，表現(xiàn)出非常高的生長率(Klug等人，J.Clin.1nvest.,98:216，1996)。因此，在起因于心肌細胞的破壞以及脫落的上述心臟病中，通過將根據本發(fā)明所述方法制備的心肌細胞補充性地移植到病的心臟組織，預期可以促進心臟功能的改善。
[0134]【實施例】
[0135]以下給出實施例對本發(fā)明進行更具體的說明，以下的實施例只不過是給出的本發(fā)明的示例，對本發(fā)明的范圍并沒有任何限定。
[0136](實施例1:通過頭蛋白處理的來自ES細胞的心肌細胞的出現(xiàn)增強效果)
[0137]使ES細胞通過懸浮凝集培養(yǎng)(以下，在本申請實施例中簡單記為懸浮培養(yǎng))形成EB，使用分化誘導心肌細胞的實驗系，在培養(yǎng)基中添加頭蛋白對心肌細胞的出現(xiàn)率的影響進行研究。
[0138]在以下實驗中，作為ES細胞，使用EB3細胞(丹羽仁史博士 [理科學研究所]惠贈)、R1細胞(Andrew Nagy博士 [Mount Sinai病院；加拿大]惠贈)、和129SV細胞(從大日本制藥株式會公司購入)，總的說來，沒有看到由于ES細胞種類不同導致的實驗結果的差別。這些ES細胞使用在含有10%胎牛血清、0.1mM MEM非必需氨基酸液、2mML_谷氨酰胺、和 0.lmM2_ 疏基乙醇的 Glasgow Minimum Essential Medium(GMEM ;Sigma 公司)培養(yǎng)基中添加了 2000U / mL 白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor:LIF) (ESGRO ；Chemicon公司)的培養(yǎng)基，根據Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual (Hogan等人編，Cold Spring Harbor Laborayory Press,1994) ；Embryonic Stem Cells:Methods andProtocols (Turksen編 ,Humana Press, 2002)等所述的方法，在保持未分化形態(tài)的同時進行傳代培養(yǎng)后供實驗用。
[0139]開始懸浮培養(yǎng)3日前，將用上述條件培養(yǎng)形成集落的ES細胞用PBS清洗2次后，通過用含有ImM EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液進行處理，形成單一細胞狀態(tài)，使用在含有10%胎牛血清、0.1mM MEM非必需氨基酸液、2mM L-谷氨酰胺和0.lmM2_巰基乙醇的a -modified Minimum Essential Medium( a MEM ;Sigma 公司)培養(yǎng)基(以下，稱為“分化培養(yǎng)基”)中添加了 2000U / mL LIF的培養(yǎng)基，制備2.5X IO5細胞/ mL的細胞懸濁液。向該懸池液中添加、或不添加500ng / mL重組.頭蛋白-Fe嵌合蛋白質(Recombinant MouseNoggin / Fe Chimera ；R & D systems公司)(以下,簡單稱為“頭蛋白”)后,對于飼養(yǎng)非依賴性ES細胞株EB3細胞，接種在明膠包被的市售的細胞培養(yǎng)用板(T75f Iask5Greiner公司制)上。另一方面，對于飼養(yǎng)依賴性ES細胞株Rl細胞和129SV細胞，預先制備在明膠包被的板上接種了絲裂霉素處理過的初代小鼠胚成纖維細胞(大日本制藥公司)的板，將細胞懸濁液接種在飼養(yǎng)細胞層上。
[0140]象以下那樣進行由ES細胞形成EB的懸浮培養(yǎng)。將在添加、或沒有添加頭蛋白的分化培養(yǎng)基培養(yǎng)了 3日的ES細胞用PBS清洗2次后，通過用含有ImM EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液進行處理，形成單一細胞狀態(tài)，然后以I X IO2細胞/ mL、或2X105細胞/ mL濃度接種在用分化培養(yǎng)基鋪滿的市售的細胞粘附性弱的細菌用板(直徑100mm ；Valmalk公司制)上。此時，向開始懸浮培養(yǎng)的3日前添加了頭蛋白的細胞組的培養(yǎng)基添加500ng / mL頭蛋白。然后，細胞在保持不粘附板的狀態(tài)下進行4~14日的懸浮培養(yǎng)。在本實驗條件下從剛懸浮培養(yǎng)后確認ES細胞開始凝集，并形成EB，從懸浮培養(yǎng)后第7~8日，已經在一部分的EB中觀察到自發(fā)搏動性。
[0141]另外，作為由ES細胞形成EB的其它的方法，懸滴培養(yǎng)如以下那樣進行。將在添加、或沒有添加頭蛋白的分化培養(yǎng)基培養(yǎng)了 3日的ES細胞用PBS清洗2次后，通過用含有ImMEDTA的0.25%胰蛋白酶溶液進行處理，形成單一細胞狀態(tài)。然后，制備在分化培養(yǎng)基15 μ L中含有500個細胞的液滴，將液滴滴在培養(yǎng)板的頂蓋，培養(yǎng)4日。此時，在從開始懸滴培養(yǎng)的3日前添加了頭蛋白的細胞組的培養(yǎng)基中添加500ng / mL頭蛋白。懸滴培養(yǎng)后，將懸滴中形成的EB接種在用分化培養(yǎng)基鋪滿的市售細胞培養(yǎng)用平皿(4孔多孔平皿；Nunc公司制)上，然后進行粘附培養(yǎng)，誘導向心肌細胞分化。粘附培養(yǎng)后，每隔2日，將一半培養(yǎng)基換成新鮮培養(yǎng)基。在本實驗條件下，與懸浮培養(yǎng)法同樣，從剛懸滴培養(yǎng)后確認ES細胞開始凝集，并形成EB，從對回收的EB開始粘附培養(yǎng)的第3~4日(懸滴培養(yǎng)后第7~8日)時間，已經在來自一部分EB的集落觀察到自發(fā)搏動性。
[0142]作為心肌細胞從ES細胞分化、發(fā)育的一個指標，對呈現(xiàn)自發(fā)搏動性的EB的出現(xiàn)率進行經時研究。作為ES細胞，使用EB3細胞，以I X IO2個/ mL的細胞濃度進行懸浮培養(yǎng)時，在來自沒有進行頭蛋白處理的(頭蛋白(_)組)ES細胞的EB中，即使在懸浮培養(yǎng)后第14日也幾乎沒有觀察到搏動性(圖1A)。而在來自進行了頭蛋白處理的(頭蛋白(+)組)ES細胞的EB中，從懸浮培養(yǎng)后第7日開始觀察到出現(xiàn)搏動性的EB，在第14日，80%以上的EB可確認搏動性。在以2X105個/ mL細胞濃度進行懸浮培養(yǎng)時也看到同樣的傾向，在頭蛋白㈠組EB中，最終只有在不到10%的EB中確認搏動，相反在頭蛋白⑴組EB中，懸浮培養(yǎng)后第10日30%以上，第1490%以上的EB表現(xiàn)出搏動性。另外，在頭蛋白㈠組EB中，搏動的區(qū)域限定于EB的一部分，但在頭蛋白(+)組EB中，令人驚奇的是能夠觀察到幾乎遍布EB表層整個區(qū)域的細胞 都在搏動。
[0143]即使在懸滴培養(yǎng)條件下，在頭蛋白(+)組ES細胞中的心肌分化能力與頭蛋白(_)組ES細胞相比也顯著高，在分化誘導后第7日(粘附培養(yǎng)后第3日)看到40%以上，在第10日看到80%以上，而在第14日幾乎在所有的來自EB的集落中都看到搏動(圖1B)。另外，與在懸浮培養(yǎng)條件下觀察同樣，在頭蛋白(_)組中，只在使EB粘附在培養(yǎng)平皿形成的集落的一部分區(qū)域的細胞看到搏動性，相反在頭蛋白(+)組中，確認在來自EB的遍布整個集落的所有細胞都在搏動。
[0144]另外,在兩個培養(yǎng)系中，在與頭蛋白處理同樣的條件下,將例如ICF(insulin-likegrowth factor)-1、FGF(fibroblast growth factor)-2, BMP-2 等各種增殖因子類或細胞因子類的重組蛋白質添加到培養(yǎng)基中，不能確認呈現(xiàn)出與頭蛋白同樣、或超過頭蛋白的心肌誘導活性。
[0145]接下來，進行了關于頭蛋白的添加濃度不同對由ES細胞向心肌細胞的分化誘導的影響的研究。圖2示出了除了添加的頭蛋白的濃度為0.5~1500ng / mL以外，其它完全與圖1條件同樣進行懸浮培養(yǎng)的結果。EB3細胞和Rl細胞都表現(xiàn)出幾乎同樣的濃度依賴性，通過添加5ng / mL~1500ng / mL濃度的頭蛋白，確認出現(xiàn)了比頭蛋白(-)組有意義高的搏動性EB。特別是通過添加50ng / mL~150ng / mL濃度的頭蛋白看到非常好的搏動性EB的出現(xiàn)。
[0146](實施例2:通過頭蛋白處理進行分化誘導的來自ES細胞的心肌細胞的形態(tài))
[0147]就像實施例1所示那樣，通過進行頭蛋白處理，由ES細胞制備的EB的搏動性有意義增高，為了確認在該搏動性EB中，該搏動性細胞是心肌細胞，對各種心肌特異的標志分子的基因表達以及蛋白質產生進行了研究。
[0148]圖3表示各種心肌細胞特異的標志基因在頭蛋白(+)組、或頭蛋白(_)組EB中的表達。對用與圖1同樣的懸浮培養(yǎng)法形成的EB進行定期回收，使用RNeaSy(Qiagen公司制)制備總RNA。然后，根據常規(guī)方法，使用SUPERSCRIPT II (Invitrogen公司制)對cDNA進行逆轉錄，通過聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction ；PCR)檢測特異的基因在心肌細胞的表達。在 GATA-4、TEF-l、Tbx-5、MEF-2c、aMHC、MLC_2v、a -cardiacactin,GAPDH的各轉錄產物的檢測中使用的引物如下。
[0149]GATA-4(正向)5' -CTGTCATCTC ACTATGGGCA-3' (SEQ ID NO:1)，
[0150]GATA-4(反向)5' -CCAAGTCCGA GCAGGAATTT-3' (SEQ ID NO:2)；
[0151]TEF-1 (正向)5' -AAGACGTCAA GCCCTTTGTG-3' (SEQ ID NO:3),
[0152]TEF-1 (反向)5' -AAAGGAGCAC ACTTTGGTGG-3' (SEQ ID NO:4)；
[0153]Tbx-5(正向)5' -GGAGCCTGAT TCCAAAGACA-3' (SEQ ID NO:5),
[0154]Tbx-5(反向)5' -TTCAGCCACA GTTCACGTTC-3' (SEQ ID NO:6)；
[0155]MEF-2c (正向)5' -AGCAAGAATA CGATGCCATC-3' (SEQ ID NO:7),
[0156]MEF-2c (反向)5' -GAAGGGGTGG TGGTACGGTC-3' (SEQ ID NO:8)；
[0157]a MHC(正向)5' -GGAAGAGTGA GCGGCCATCA AGG-3' (SEQ ID NO:9),
[0158]a MHC(反向)5' -CTGCTGGAGA GGTTATTCCT CG-3' (SEQ ID NO: 10);
[0159]MLC-2v(正向)5' -GCCAAGAAGC GGATAGAAGG-3' (SEQ ID NO: 11)，
[0160]MLC-2v(反向)5' -CTGTGGTTCA GGGCTCAGTC-3' (SEQ ID NO:12)；
[0161]a -cardiac act in (正向)5' -CTGAGATGTC TCTCTCTCTC TTAG-3' (SEQ ID NO:13)，
[0162]a -cardiac act in(反向)5' -ACAATGACTG ATGAGAGATG-3' (SEQ ID NO:14)；
[0163]GAPDH(正向)5' -TTCAACGGCA CAGTCAAGG-3' (SEQ ID NO:15)，
[0164]GAPDH(反向)5' -CATGGACTGT GGTCATGAG-3' (SEQ ID NO:16)。
[0165]PCR使用TaKaRa Taq (寶酒造公司制)作為耐熱性DNA聚合酶，用GeneAmp PCRSystem9600 (Perkin-Elmer公司制)進行。首先將含有cDNA的PCR反應液于94°C下加熱3分鐘后，反復進行94°C:1分鐘，-55°C: I分鐘，-72°C: I分鐘的30次加熱循環(huán)，最后于72°C下加熱5分鐘后，在4°C下冷卻。將PCR產物用3%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，用SYBR GreenI (寶酒造公司制)染色,通過Molecular Imager FX (Bio-Rad公司制)進行檢測。
[0166]結果GATA-4、TEF_l、Tbx-5、MLC-2v等基因在頭蛋白(_)組EB中從懸浮培養(yǎng)開始后第5至第10日開始看到比較弱的表達，相反在頭蛋白(+)組EB，從懸浮培養(yǎng)開始的當日(O日)開始看到表達，之后，在第5~第15日持續(xù)強的表達。MEF-2C和心肌特異的α -肌動蛋白都是從懸浮培養(yǎng)后第5日開始看到表達，其表達量，頭蛋白(+)組EB有意義地強。而，a MHC(肌球蛋白重鏈)基因，在頭蛋白(+)組ΕΒ，在第10、15日看到強表達，但在頭蛋白(_)組EB不能確認表達。以上 結果表明通過頭蛋白處理，迅速、且強烈地促進EB內的心肌細胞的分化以及發(fā)育。
[0167]另外，用免疫組織化學染色法確認在頭蛋白(+)組EB中發(fā)育的搏動性細胞產生心肌細胞特異的標志蛋白質。將用圖1同樣的懸浮培養(yǎng)法形成的蛋白(+)組EB在懸浮培養(yǎng)后第12日回收，用含有ImM EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液處理后使細胞分散。分散的細胞以個個細胞相互不粘連程度的低密度接種在明膠包被的蓋玻片上，在鋪滿分化培養(yǎng)基的市售的細胞培養(yǎng)用板內進行培養(yǎng)。翌日，將蓋玻片上的細胞用4%低聚甲醛溶液固定，依次與作為I次抗體的抗肌原纖維節(jié)和肌球蛋白抗體(MF20 ； Ameri can Type Culture Collection)、抗肌鈣蛋白I抗體(#SC_8120 ；Santa Cruz Biotechnology公司)、抗α -輔肌動蛋白抗體(#SC-15335 ；Santa Cruz 公司)、抗 ANP 抗體(#AB5490 ；Chemicon 公司)反應，再與Alexa488標記2次抗體(MoleCular Probes公司)依次反應后,在突光顯微鏡下進行觀察。
[0168]結果，作為心肌細胞中特異的標志蛋白質的肌原纖維節(jié)和肌球蛋白或肌鈣蛋白1、α -輔肌動蛋白、ANP陽性細胞多數(shù)被確認(圖4)，證實來自ES細胞的搏動性細胞是心肌細胞。
[0169]接下來，使用與上述同樣的免疫組織化學的染色法，對EB內的心肌細胞的分布和發(fā)生頻率進行確認。將懸浮培養(yǎng)后第12日回收的EB用冷凍切片制備用包埋劑(0CTCompound, Sakura Finetek USA Inc.)新鮮包埋,將于液氮下冷凍制備的冷凍標本用恒冷切片機(LEICA CM3050-S)切成薄片(5 μ m)后，貼在載玻片上。使冷凍切片與上述抗心肌細胞特異標志抗體反應，用與上述同樣的方法進行標志蛋白質陽性細胞的檢測。
[0170]檢測結果如圖5所示。在頭蛋白(_)組EB中，心肌細胞中特異的標志蛋白質的陽性細胞只在EB的極有限的區(qū)域觀察到，而相反在頭蛋白(+)組EB中，在遍布幾乎整個EB表層區(qū)域都可確認心肌標志陽性細胞。本見識與在頭蛋白(_)組EB中搏動域被限定在EB的一部分，相反在頭蛋白(+)組EB中，搏動遍布幾乎整個EB區(qū)域，與已證實的實施例1中的觀察結果完全一致。
[0171](實施例3:頭蛋白處理時間、期間不同對心肌細胞的分化誘導效果的影響)
[0172]為了研究頭蛋白處理的最適時間和期間，改變在上述懸浮培養(yǎng)系中頭蛋白的添加時期，研究改變之后對心肌分化誘導效果的影響。
[0173]結果如表1所示。
[0174]【表1】
[0175]
【權利要求】
1.由來自哺乳動物的多能干細胞分化誘導心肌細胞的方法，其特征是在(a)分化誘導期開始的前I~2日到分化誘導期，和/或 (b)分化誘導期的最初3日以內 在抑制BMP信號傳導物質的存在下，對所述干細胞進行用于分化誘導的培養(yǎng)， 其中抑制BMP信號傳導的物質選自BMP拮抗劑、針對BMP家族分子的特異的中和抗體、非細胞膜結合型的可溶化型BMP受體分子、基因表達載體、特異的反義寡核苷酸、核酶、RNA干擾用反義RNA、低分子化合物； 其中所述干細胞排除人類胚胎分離的干細胞。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，用于分化誘導的干細胞的培養(yǎng)包括選自下述工序的工序:(I)進行懸浮凝集培養(yǎng)，使胚狀體形成的工序； (2)與飼養(yǎng)細胞進行共培養(yǎng)的工序；以及 (3)在培養(yǎng)容器上進行平面培養(yǎng)的工序。
3.根據權利要求1所述的方法，其中，抑制BMP信號傳導的物質是BMP拮抗劑。
4.根據權利要求3所述的方法，其中，BMP拮抗劑是從頭蛋白、索蛋白、胎球蛋白、卵泡抑素、sclerostin、DAN、Cerberus、gremlin、和 Dante 中選出的 I 個或多個。
5.根據權利要求1所述的方法，其中，多能性干細胞是胚胎干細胞、具有類似于胚胎干細胞形態(tài)的細胞、或胚胎生 殖細胞。
6.根據權利要求1所述的方法，其中，多能性干細胞是胚胎干細胞。
【文檔編號】C12N5/077GK103602633SQ201310492188
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2004年10月4日 優(yōu)先權日:2003年10月3日
【發(fā)明者】福田惠一, 湯淺慎介, 岡野榮之, 島崎琢也, 小清水右一, 田中智文, 杉村惠二郎 申請人:福田惠一