April基因實時熒光pcr檢測引物和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種APRIL基因實時熒光PCR檢測的引物，正向引物（SEQ?ID?NO.1）：5-GTGATTTAAGAGGACT-3；反向引物（SEQ?ID?NO.2）：5-TGGAGAGGGTGCGAAC-3；和利用上述引物對APRIL基因進行實時熒光PCR檢測的試劑盒和檢測方法。本發(fā)明采用SYBR?Green?I實時熒光PCR檢測方法，對APRIL基因進行鑒定，具有檢測實時性和高效性，并可以對早期APRIL基因表達進行檢測。
【專利說明】APRIL基因實時熒光PCR檢測引物和試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術檢測領域，尤其是涉及APRIL基因實時熒光PCR檢測引物和試劑盒。
【背景技術】
[0002]一種誘導增殖配體(a proliferation inducing ligand, APRIL),和 BAFF(B-cel 1-activating factor)同屬于腫瘤壞死因子超家族成員，主要由DC,巨卩遼細胞,T和B細胞分泌。APRIL對免疫調節(jié)的功能定義的較少。最近研究表明APRIL可能作為初始B和T細胞的共刺激因子，誘導外周血B細胞產生IgM[G.Yu, T.Boone, J.Delaneyet al, NatImmunol, 2000, I (3):252-256; J.V.Stein, M.Lopez-Fraga, F.A., J Clin Invest, 2002, 109(12): 1587-1598]，影響胸腺依賴性B細胞應答。與BAFF相同，APRIL促進B細胞增殖和增加激活T細胞的數量。
[0003]APRIL不僅可以結合BAFF的共受體BCMA和TACI，然且APRIL可以結合獨自受體一硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans, HSPG)。APRIL可以結合腫瘤細胞表達的HSPG，參與腫瘤的維持和生長，利用肝素(Heparin)可以抑制APRIL與HSPG的結合，降低其對腫瘤的促生長作用；在裸鼠注射ARPIL轉染的腫瘤細胞比對照組增殖更加迅速，抑制APRIL對腫瘤生長有明顯的抑制作用。在原發(fā)性膽汁性肝硬化(Primarybiliary cirrhosis, PBC)，一種自身免疫性肝病，病人BAFF和APRIL的血清濃度明顯增加[P.Rennert, P.Schneider, T.G.Cacheroet al., J Exp Med, 2000, 192 (11):1677_1684]。ARPIL也成為治療自身免疫性疾病和腫瘤的新興藥物靶點。
[0004]目前，在APRIL的檢測方法上，還是普遍采用抗體直接檢測定量技術；但是，對于目前病人的個性化治療和疾病發(fā)展檢測方面，這技術定性和定量周期較長，花費較大，不適合大范圍的使用。

【發(fā)明內容】

[0005]為了解決上述現有技術的不足，本發(fā)明目的是提供一種APRIL基因實時熒光PCR檢測引物和試劑盒。
[0006]本發(fā)明所采用的技術方案如下:
[0007]APRIL基因PCR檢測的引物，
[0008]正向引物:5-GTGATTTAAGAGGACT-3；
[0009]反向引物:5-TGGAGAGGGTGCGAAC-3；
[0010]利用引物對進行檢測的試劑盒:
[0011]試劑盒包括一種檢測溶液，其檢測溶液含有含SYBR Premix Ex Taq(2X)、正向引物 10 μ M、反向引物 10 μ M、Rox Dye (50Χ )；
[0012]利用本試劑盒進行檢測的步驟如下:
[0013]I)提取待檢測樣品的RNA，并反轉錄cDNA溶液。[0014]2)反應體系:取2ul步驟I)中所得的DNA溶液，并與上述試劑盒中的檢測溶液14ul進行混合，并加入無菌超純水至反應體積20ul ;加入到實時熒光反應管中，進行離心；
[0015]3)將步驟2)的反應體系按照下述條件進行實時熒光PCR檢測:
[0016]預變性950C /100s，I 次循環(huán)；變性 95°C /30s，延伸 66°C /120s, 40 次循環(huán)。
[0017]本發(fā)明采用SYBR Green I實時熒光PCR檢測方法，對APRIL基因進行鑒定，具有檢測實時性和高效性，并可以對早期APRIL基因表達進行檢測，針對APRIL基因表達的胞外區(qū)RNA為檢測對象進行設計引物，檢測早期APRIL分泌形式的基因表達，用于早期判斷自身免疫性疾病，另外可以對病人進行個性診斷和治療過程中，APRIL的基因表達情況的檢測，并判斷自身免疫性疾病病人復發(fā)和加重病情的可能性及其對于腫瘤患者中APRIL標的相關性。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是實施例1的檢測樣品實時熒光PCR檢測曲線；
[0019]圖2是實施例1的檢測樣品和對照實時熒光PCR檢測比較圖；
[0020]圖3是實施例2的檢測樣品和對照進行ELISA驗證比較圖。
【具體實施方式】
[0021 ] 根據實施例和附圖對本發(fā)明申請做進一步的說明。
[0022]設計APRIL基因PCR檢測的引物，根據編碼APRIL的胞外區(qū)cDNA進行設計
[0023]正向引物:5-GTGATTTAAGAGGACT-3
[0024]反向引物:5-TGGAGAGGGTGCGAAC-3；
[0025]另外試劑盒包括一種檢測溶液，其檢測溶液含有含SYBR Premix Ex Taq(2X)、正向引物 10 μ M、反向引物 10 μ Μ, Rox Dye (50X)；
[0026]實施例1
[0027]I)離心待檢測樣品和陰性對照血液，提取下層血細胞的RNA，并反轉錄cDNA溶液，低溫保存?zhèn)溆?；其中檢測樣品取自系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人血液(1、2、3)和原發(fā)性膽汁性肝硬化病人血液(4);正常人血清(5、6)作為陰性對照。
[0028]2)反應體系:取2ul步驟I)中所得的DNA溶液，并與上述試劑盒中的檢測溶液14ul進行混合，并加入無菌超純水至反應體積20ul ;加入到實時熒光反應管中，進行離心；同時以無菌水作為空白對照
[0029]3)將步驟2)的反應體系按照下述條件進行實時熒光PCR檢測:
[0030]預變性950C /100s，I 次循環(huán)；變性 95°C /30s，延伸 66°C /120s, 40 次循環(huán)。
[0031]附圖1為本實施例的實時熒光PCR擴增曲線，其中1-3為系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人樣品，4為原發(fā)性膽汁性肝硬化病人樣品；5、6為陰性對照。其中樣品I和3曲線分別高于2和4，樣品2的曲線高于樣品3 ;并表現出良好的特異性。
[0032]附圖2為進行檢測樣品和對照樣品的曲線熒光進行比較；樣品1-4明顯高于陰性對照;其中***，為P〈0.01。
[0033]實施例2
[0034]利用ELISA進行對檢測樣品中血清APRIL的濃度，采用酶標儀進行檢測所得OD值進行分析；及實時熒光PCR檢測結果相符性；所用的APRIL抗體購自為Santa Cruz公司，貨號為 APRIL (F-5)。
[0035]ELISA的檢測結果與利 用實時熒光PCR所得出的APRIL表達趨勢相符。
【權利要求】
1.APRIL基因實時熒光PCR檢測的引物，其特征是: 正向引物(SEQ ID N0.1):5-GTGATTTAAGAGGACT-3 反向引物(SEQ ID N0.2):5-TGGAGAGGGTGCGAAC-3o
2.APRIL基因實時熒光PCR檢測的試劑盒，其特征是: 試劑盒包括一種檢測溶液，其檢測溶液含有含SYBR Premix Ex Taq(2X)、正向引物10 μ M、反向引物 10 μ M、Rox Dye (50Χ )； 上述正反引物如權利要求1所述。
3.APRIL基因實時熒光PCR檢測方法，其特征是，具體步驟是: 1)提取待檢測樣品和陰性對照的RNA，并反轉錄cDNA溶液； 2)反應體系:取2ul步驟I)中所得的DNA溶液，并與權利要求2所述的試劑盒中的檢測溶液14ul進行混合，并加入無菌超純水至反應體積20ul ;加入到實時熒光反應管中，進?Τ尚心; 3)將步驟2)的反應體系按照下述條件進行實時熒光PCR檢測: 預變性950C /100s，I次循`環(huán)；變性950C /30s，延伸66°C /120s, 40次循環(huán)。
【文檔編號】C12Q1/68GK103484559SQ201310493575
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年10月17日 優(yōu)先權日:2013年10月17日
【發(fā)明者】于惠, 李艷麗, 管淑紅 申請人:于惠