一種特異性納米金dna探針的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種特異性納米金DNA探針的制備方法。該方法包括制備13nm納米金顆粒AuNPs和將特異性探針連接到13nm納米金顆粒AuNPs上兩大步驟，該特異性探針包括16SrRNA保守序列的互補(bǔ)序列、夾著16SrRNA保守序列的互補(bǔ)序列的互補(bǔ)的兩段互補(bǔ)的發(fā)夾序列、以及夾著16SrRNA保守序列的互補(bǔ)序列和兩段互補(bǔ)的發(fā)夾序列的熒光分子FAM及其淬滅基團(tuán)BHQ1。使用該方法制備的特異性納米金DNA探針在對尿液樣本進(jìn)行檢測時，顯示出了相較于尿液樣本傳統(tǒng)細(xì)菌檢測方法，更加顯著、快速、靈敏和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種特異性納米金DNA探針的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及核酸檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種特異性納米金DNA探針的制備方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]細(xì)菌性感染是全球泛發(fā)性疾病，比如肺炎、肺結(jié)核、尿路感染等等疾病都是由細(xì)菌引起，對人類的正常工作學(xué)習(xí)帶來了極大的困擾。其中細(xì)菌性尿路感染是組織系統(tǒng)的第二大泛發(fā)細(xì)菌性感染疾病。每一年約有七百萬病患，超過一百萬的人需要住院治療。每年用于治療該疾病的費(fèi)用巨大，這對國家的經(jīng)濟(jì)發(fā)展、社會生產(chǎn)力都造成了極大的影響，并且有很大一部分費(fèi)用用于細(xì)菌的檢測，但是尿液樣本的傳統(tǒng)細(xì)菌檢測最主要的缺點(diǎn)就是耗時長，從樣品收集到獲得檢測結(jié)果約需兩天左右，培養(yǎng)克隆細(xì)菌是主要的耗時過程。在臨床上，因?yàn)闆]有及時獲得細(xì)菌檢測結(jié)果，僅憑經(jīng)驗(yàn)給藥，常在臨床上出現(xiàn)使用藥物不當(dāng)產(chǎn)生的不良反應(yīng)和細(xì)菌耐藥性。目前，發(fā)展起來的分子檢測技術(shù)及PCR技術(shù)的應(yīng)用，具有一定的優(yōu)勢，但均需要擴(kuò)增目標(biāo)序列，不夠方便快捷(l、Journal ofclinical microbiology2009,47(8)，2405-10.2、Journal of clinical microbiology2009，47 (7)，2067-78.)。免疫印跡技術(shù)，所需要的步驟更加繁瑣(3、Genome biology2007,8 (5), R93.)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種能快速、便捷、準(zhǔn)確且檢測步驟簡單的檢測尿路感染病原菌的載體的制備方法。為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種特異性納米金DNA探針的制備方法，用于制備能夠檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針。該制備方法包括制備13nm納米金顆粒AuNPs和將特異性探針連接到13nm納米金顆粒AuNPs上兩個步驟。
[0004]制備13nm納米金顆粒AuNPs的步驟包括:步驟1-1取9.8ml ddH20加熱煮沸；步驟1-2加入200 μ I預(yù)冷的50mM HAuC14并伴隨晃動；步驟1-3加入Iml預(yù)冷的38.8mM 二水合檸檬酸三納并伴隨晃動；步驟1-4煮沸IOmin并伴隨晃動；步驟1_5在室溫超聲30min。
[0005]將特異性探針連接到13nm納米金顆粒AuNPs上的步驟包括:步驟2_1取30μ 120μΜ的DNA探針加入到新鮮制備的30μ 150mM三(2-羧乙基)膦TCEP中，并取10 μ 10.5Μ NaOH 調(diào)節(jié) PH 到 5 ;步驟 2_21h 后加入 10nM13nm AuNPs 100 μ I ;步驟 2_31h 后加入50mM PBS33y I,并在室溫下超聲10s，之后在50°C下加熱IOmin ;步驟2_4在室溫下連接1211，之后加入4(^ 150mM TCEP ;步驟2_51h后，加入0.01% SDS和8 μ 13Μ NaCl，并在室溫下超聲10s，之后在50°C下加熱IOmin ;步驟2_6經(jīng)過6h后，再次加入8 μ 13M NaCl，室溫下超聲10s，之后在50°C下加熱IOmin ;步驟2_7重復(fù)步驟2_6 ;步驟2_8在室溫下靜置連接48h。
[0006]本發(fā)明進(jìn)一步限定的技術(shù)方案是:[0007]前述的特異性納米金DNA探針的制備方法，特異性探針包括16SrRNA保守序列的互補(bǔ)序列、夾著16SrRNA保守序列的互補(bǔ)序列的互補(bǔ)的兩段互補(bǔ)的發(fā)夾序列，夾著16SrRNA保守序列的互補(bǔ)序列和兩段互補(bǔ)的發(fā)夾序列的熒光分子FAM及其淬滅基團(tuán)BHQ1。
[0008]前述的特異性納米金DNA探針的制備方法，發(fā)夾序列為:5' -ACCGAGCHT和5' -GCTCGGT-3'。
[0009]前述的特異性納米金DNA探針的制備方法，特異性探針還包括連接序列 -GAGGTC-Si，并通過連接序列Y -GAG GTCHV與13nm納米金顆粒AuNPs相連。
[0010]前述的特異性納米金DNA探針的制備方法，特異性探針為U -/FAM/ACCG AGCCATCGT TTA CGG CGT GGA CTA CCA GGG GCT CGGT/BHQ1/GAG GTC-3'，其中 5' -CAT CGTTTACGG CGT GGA CTA CCA GGG-3'為16S rRNA保守序列的互補(bǔ)序列。
[0011]用這種方法制備的特異性納米金DNA探針，用于檢測尿路感染病原菌，在自然狀態(tài)下由于兩段互補(bǔ)的發(fā)夾序列特異性結(jié)合，特異性納米金DNA探針的特異性探針呈環(huán)狀，熒光分子FAM及其淬滅基團(tuán)BHQl相互靠近，使得熒光分子FAM淬滅，整個特異性納米金DNA探針。當(dāng)溫度升高時，特異性納米金DNA探針的環(huán)狀結(jié)構(gòu)打開，此時遇到16SrRNA保守序列，當(dāng)溫度再下降時16SrRNA保守序列的互補(bǔ)序列會與16SrRNA保守序列特異性結(jié)合，特異性納米金DNA探針的熒光分子FAM及其淬滅基團(tuán)BHQl相互遠(yuǎn)離，特異性納米金DNA探針發(fā)出熒光，達(dá)到檢測的目的。
[0012]本發(fā)明的有益效果是:(I)本發(fā)明的特異性納米金DNA探針的制備方法簡單宜行，且部分制備環(huán)節(jié)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商業(yè)化，便于批量生產(chǎn)并投入實(shí)際運(yùn)用；(2)使用本發(fā)明方法制備的特異性納米金DNA探針使用方便，在RTPCR儀上即可實(shí)現(xiàn)檢測；(3)利用本發(fā)明方法制備的特異性納米金DNA探針，在對尿路感染病原菌檢測時，相較于尿液樣本的傳統(tǒng)細(xì)菌檢測方法，更具顯著、快速、 靈敏和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
圖1為本發(fā)明的特異性探針結(jié)構(gòu)示意圖 圖2為本發(fā)明的檢測原理示意圖 圖3為本發(fā)明的單個DNA探針檢測大腸桿菌極限值圖像 圖4為本發(fā)明的納米金DNA探針檢測大腸桿菌極限值圖像
【具體實(shí)施方式】
[0013]實(shí)施例1
[0014]本實(shí)施例提供了一種特異性納米金DNA探針的制備方法，用于檢測尿路感染病原菌。該特異性納米金DNA探針的結(jié)構(gòu)為:在13nm納米金顆粒AuNPs上結(jié)合一個以上特異性探針，該特異性探針為 5' -/FAM/ACCG AGC CAT CGT TTA CGG CGT GGA CTA CCA GGGGCTCGGT/BHQ1/GAG GTC-3 ;。其中FAM為一種熒光分子，BHQl為熒光分子FAM的淬滅基團(tuán)，二者靠近后FAM熒光分子不發(fā)光，遠(yuǎn)離后FAM熒光分子發(fā)光。如圖1所示，圖中以全黑圓形示意FAM熒光分子，以全黑矩形示意BHQl淬滅基團(tuán)，5' -ACCG AGCXV和V -GCTCGGT-3'是兩段互補(bǔ)的發(fā)卡序列，其作用是使得該特異性探針在未檢測到目標(biāo)序列時呈環(huán)狀，F(xiàn)AM熒光分子及其淬滅基團(tuán)BHQl互相靠近不發(fā)熒光。5^ -CAT CGT TTA CGG CGT GGACTA CCAGGG-3'為16SrRNA保守序列的互補(bǔ)序列，16SrRNA基因是細(xì)菌上編碼rRNA相對應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌的基因組中。5' -GAG GTC-3'是連接序列，特異性探針通過它連接到13nm的納米金顆粒AuNPs上。[0015]上述用于檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針的檢測原理如圖2所示，當(dāng)細(xì)菌上的16SrRNA保守序列與加熱后打開環(huán)狀結(jié)構(gòu)的特異性納米金DNA探針發(fā)生特異性結(jié)合，再回到常溫時也無法形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，則FAM熒光分子發(fā)光。如若沒有16SrRNA保守序列參與，則特異性納米金DNA探針加熱后環(huán)狀結(jié)構(gòu)打開，再回到常溫下又重新形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，F(xiàn)AM熒光分子不發(fā)光。
[0016]上述用于檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針的特異性探針設(shè)計好以后，交由市場化運(yùn)作的公司生產(chǎn)，所以在制備該特異性納米金DNA探針時，首先，制備13nm納米金顆粒AuNPs。制備所需器皿均需要多次超聲清洗，徹底去除金屬離子。具體制備過程: (I)取9.8ml ddH20加熱煮沸(目的是去除O2) ； (2)加入200 μ I預(yù)冷的50mM HAuCl4 (加入過程中伴隨晃動);(3)加入Iml預(yù)冷的38.8mM 二水合檸檬酸三納(加入過程中伴隨晃動);(4)煮沸IOmin (煮沸過程中伴隨晃動);(5)在室溫超聲30min。通過在透射電子顯微鏡(Transmission electron microscope,TEM)下觀察制備的金粒子形貌，可以判定制備的納米金顆粒大小約13nm。其次,將特異性探針連接到13nm納米金顆粒AuNPs上。具體連接過程:⑴取30 μ 120 μ M的DNA探針加入到新鮮制備的30 μ 150mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)中，并取 10 μ 10.5MNa0H 調(diào)節(jié) PH 到 5 ； (2) Ih 后加入 10nM13nmAuNPsl00 μ I ； (3) Ih后加入50mM PBS33y 1，并在室溫下超聲10s，之后在50°C下加熱IOmin ; (4)在室溫下連接12h，之后加入40μ 150mM TCEP ; (5) Ih后，加入(λ 01 % SDS和8 μ 13M NaCl，并在室溫下超聲10s，之后在50°C下加熱IOmin ; (6)經(jīng)過6h后，再次加入8 μ 13M NaCl，室溫下超聲10s，之后在50°C下加熱IOmin ； (7)重復(fù)步驟(6)；⑶在室溫下靜置連接48h。
[0017]大腸桿菌占尿道感染病原菌的80 %，為驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果，培養(yǎng)大腸桿菌DH5CI，并收集菌液，進(jìn)行檢測，以驗(yàn)證該探針的靈敏性和特異性。取培養(yǎng)的大腸桿菌菌液收集Iml離心，加入10 μ I裂解液和10 μ 10.5Μ NaOH破裂細(xì)胞，釋放16SrRNA，加入探針，制備RTPCR20 μ I反應(yīng)體系，其中PBS終濃度為10mM。檢測過程在RTPCR儀中進(jìn)行，設(shè)置程序80°C，3min，每20s降低1°C，從80°C降低到40°C。分析熒光值，納米金DNA探針在高于自身Tm值，環(huán)狀結(jié)構(gòu)全部打開，隨著溫度的下降，在沒有目標(biāo)序列存在的情況下，探針重新形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)被淬滅，沒有熒光信號出現(xiàn)；當(dāng)出現(xiàn)目標(biāo)序列，目標(biāo)序列結(jié)合到探針上，探針不再形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，在RTPCR儀中可以檢測到熒光，對熒光值進(jìn)行統(tǒng)計分析，以此來判斷是否存在特異性序列，整個實(shí)驗(yàn)過程可控制在Ih以內(nèi)。結(jié)合圖3和圖4，對DNA探針和納米金DNA探針檢測菌液結(jié)果進(jìn)行對比，表明連接納米金的DNA探針靈敏度是單獨(dú)DNA探針的IO3倍，證明使用該方法制備的納米金探針與傳統(tǒng)檢測方法相比確實(shí)具有快速，靈敏度高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。
[0018]除上述實(shí)施例外，本發(fā)明還可以有其他實(shí)施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種特異性納米金DNA探針的制備方法,其特征在于:包括制備13nm納米金顆粒AuNPs和將特異性探針連接到13nm納米金顆粒AuNPs上兩個步驟； 所述制備13nm納米金顆粒AuNPs的步驟包括: 步驟1-1取9.8ml ddH20加熱煮沸； 步驟1-2加入200 μ I預(yù)冷的50mM HAuC14并伴隨晃動； 步驟1-3加入Iml預(yù)冷的38.8mM 二水合檸檬酸三納并伴隨晃動； 步驟1-4煮沸IOmin并伴隨晃動； 步驟1-5在室溫超聲30min ； 所述將特異性探針連接到13nm納米金顆粒AuNPs上的步驟包括: 步驟2-1取30 μ 120 μ M的DNA探針加入到新鮮制備的30 μ 150mM三(2-羧乙基)膦TCEP 中，并取 10 μ 10.5Μ NaOH 調(diào)節(jié) PH 到 5 ；
步驟 2-21h 后加入 10nM13nm AuNPs 100 μ I ； 步驟2-31h后加入50mM PBS33 μ 1，并在室溫下超聲10s，之后在50°C下加熱IOmin ； 步驟2-4在室溫下連接12h，之后加入40 μ 150mM TCEP ； 步驟2-51h后，加入0.01% SDS和8μ 13M NaCl，并在室溫下超聲10s，之后在50°C下加熱IOmin ； 步驟2-6經(jīng)過6h后，再次加入8 μ 13Μ NaCl,室溫下超聲10s，之后在50°C下加熱IOmin ； 步驟2-7重復(fù)步驟2-6 ； 步驟2-8在室溫下靜置連接48h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性納米金DNA探針的制備方法，其特征在于:所述特異性探針包括16SrRNA保守序列的互補(bǔ)序列、夾著16SrRNA保守序列的互補(bǔ)序列的互補(bǔ)的兩段互補(bǔ)的發(fā)夾序列，夾著16SrRNA保守序列的互補(bǔ)序列和兩段互補(bǔ)的發(fā)夾序列的熒光分子FAM及其淬滅基團(tuán)BHQl。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的特異性納米金DNA探針的制備方法，其特征在于:所述發(fā)夾序列為:5' -ACCGAGC-3'和 5' -GCTCGGT-3'。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的特異性納米金DNA探針的制備方法，其特征在于:特異性探針還包括連接序列，并通過連接序列與13nm的納米金顆粒AuNPs相連。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的特異性納米金DNA探針的制備方法，其特征在于:連接序列為 5' -GAG GTC-3'。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一所述的特異性納米金DNA探針的制備方法，其特征在于:所述特異性探針為 5' -/FAM/ACCG AGC CAT CGT TTA CGG CGT GGA CTA CCA GGG GCT CGGT/BHQI/GAG GTC-3'，其中 5' -CAT CGT TTA CGG CGT GGA CTA CCA GGG-3'為 16 SrRNA 保守序列的互補(bǔ)序列。
【文檔編號】C12Q1/04GK103773756SQ201310495123
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2013年10月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月18日
【發(fā)明者】劉斐, 劉紅蕊, 曹靜 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)