表達(dá)分泌金葡菌腸毒素蛋白的重組bcg活菌菌株、活菌疫苗及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】表達(dá)分泌金葡菌腸毒素蛋白的重組BCG活菌菌株、活菌疫苗及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明的目的在于提供一種新型的能夠用于預(yù)防和治療人類腫瘤疾病的活菌疫苗。本發(fā)明首先提供了一種重組BCG活菌菌株，是將編碼野生型金葡菌腸毒素蛋白的野生型金葡菌腸毒素基因序列或者編碼突變型金葡菌腸毒素蛋白的突變型金葡菌腸毒素基因序列導(dǎo)入BCG活菌菌株后得到的重組菌株；本發(fā)明還提供了該重組菌株的構(gòu)建方法以及由其得到的活菌疫苗。該活菌菌株能夠在細(xì)胞中表達(dá)分泌出金葡菌腸毒素蛋白，動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，將其作為疫苗接種機(jī)體后，可以起到預(yù)防和治療癌癥的作用。
【專利說明】表達(dá)分泌金葡菌腸毒素蛋白的重組BCG活菌菌株、活菌疫苗及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種利用基因工程技術(shù)構(gòu)建獲得的能夠表達(dá)分泌金葡菌腸毒素蛋白的重組BCG活菌菌株、活菌疫苗以及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是威脅人類健康和生命的殺手，每年因患惡性腫瘤致死的病例已經(jīng)上升到各種疾病的首位。目前腫瘤的主要治療手段是手術(shù)、放療和化療。盡管醫(yī)學(xué)家們不斷完善這3大治療手段，但許多癌癥患者仍然難以得到治愈。由于腫瘤本身易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，使傳統(tǒng)的手術(shù)、放療和化療效果有限。目前，腫瘤免疫治療已成為一種比較有效的治療方法。腫瘤的免疫治療包括抗體、細(xì)胞因子、疫苗和細(xì)胞治療。它是一種新型的主動(dòng)性免疫療法。隨著腫瘤免疫學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，腫瘤與機(jī)體之間的相互作用、腫瘤免疫耐受以及腫瘤抗原鑒定都取得了很大的進(jìn)展，這也促進(jìn)了腫瘤疫苗的發(fā)展。目前，很多抗腫瘤疫苗在動(dòng)物水平和臨床試驗(yàn)已取得令人鼓舞的效果。作為一種高效、無明顯毒副作用的腫瘤免疫療法已經(jīng)成為了人類預(yù)防和治療腫瘤疾病的必然趨勢(shì)。
[0003]金黃色葡萄球菌腸毒素是由金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,以下簡(jiǎn)稱金葡菌)分泌產(chǎn)生的外毒素，腸毒素是金葡菌在宿主體內(nèi)導(dǎo)致疾病的主要原因。目前，已有超過17種金葡菌腸毒素獲得鑒定，包括典型的腸毒素(SEA、SEB、SECs、SED和SEE)以及新發(fā)現(xiàn)的多種腸毒素蛋白(Letertre C，et al.J.Appl.Microbiol.2003, 95 (I): 38-43.)。
[0004]超抗原(Superantigen, SAg)是指一類只需極低濃度(l-lOng/ml)就可以激活大量的T細(xì)胞活化，產(chǎn)生極強(qiáng)的免疫應(yīng)答的抗原因子。超抗原的作用途徑不需要呈遞細(xì)胞的加工處理，而是以完整的蛋白質(zhì)形式呈遞給T細(xì)胞，其一端與APC膜上的MHC II類分子的非多態(tài)區(qū)外側(cè)結(jié)合形成超抗原MHC復(fù)合物，另一端直接與TCR的V β片段外側(cè)結(jié)合，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)。
[0005]金葡菌腸毒素蛋白分子作為典型的超抗原物質(zhì)，對(duì)宿主免疫系統(tǒng)具有強(qiáng)烈的免疫刺激作用。因此，腸毒素很早就開始作為新的抗腫瘤蛋白分子進(jìn)行研究。腸毒素蛋白分子對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷分子機(jī)制包括= (I)SAg依賴性細(xì)胞毒(SDCC)作用和SAg抗體依賴性細(xì)胞毒(SADCC)作用。由于SAg不需要抗原呈遞細(xì)胞(APC)的處理，能以完整的蛋白質(zhì)分子形式，一端在抗原結(jié)合溝外與APC上的MHC類分子連接，另一端僅與T細(xì)胞受體(Τ cell receptor, TCR)的νβ片段連接，不需APC處理，也不受MHC的限制，在APC外形成MHC類分子-SAg-TCR-v β復(fù)合物，在極低的摩爾濃度(10_12數(shù)量級(jí))下便可刺激存在TCRvP序列的T淋巴細(xì)胞大量增殖，能夠在短時(shí)間內(nèi)直接激活具有很強(qiáng)殺傷力的CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocyte, CTL)和與⑶4+相關(guān)的輔助性T細(xì)胞產(chǎn)生，以TCR-vβ-SAg-MHC-1I類分子的方式以及MHC-1I類分子相關(guān)的腫瘤細(xì)胞相偶聯(lián)后產(chǎn)生強(qiáng)力的殺滅作用，對(duì)表達(dá)具有MHC-1I類分子有關(guān)的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行直接殺滅(Kuge S，et al.JImmunol.1995，154(4):1777-1785.)。(2)細(xì)胞因子的直接和間接殺傷作用。超抗原活化的于CD4+相關(guān)的T淋巴細(xì)胞能分泌包括TNF-α、TNF-β、INF1、IL_2、IL-6和IL-12等多種足量的細(xì)胞因子。它們不僅能通過直接作用或間接作用的方式殺傷腫瘤細(xì)胞，而且可以促使腫瘤細(xì)胞增加表達(dá)MHC類抗原分子，進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的刺激作用(Matsushita K, et al.Br J Cancer.1996，73 (5): 644-648.)。(3)超抗原刺激 T 細(xì)胞后，T細(xì)胞釋放的IL-2、INF-gamma和IL-12等細(xì)胞因子，可產(chǎn)生廣譜抗腫瘤的淋巴因子激活殺傷細(xì)胞(LAK),進(jìn)一步產(chǎn)生 LAK 樣細(xì)胞毒作用(Lando P, et al.Cancer Tmmunol Immunother.1991，33(4):231-237.)。
[0006]BCG (Bacillus Calmette_Gu6rin)作為預(yù)防結(jié)核病的疫苗已經(jīng)得到廣泛的使用。BCG作為重組疫苗載體具有其他疫苗載體不可比擬的優(yōu)越性。BCG在全世界范圍內(nèi)應(yīng)用最廣泛，它是一種耐熱活疫苗，生產(chǎn)成本低，且應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人體并發(fā)癥少。因此，把BCG作為活菌疫苗載體，是目前構(gòu)建重組疫苗的理想選擇。
[0007]金葡菌腸毒素是典型的超抗原物質(zhì)，極低的濃度就可以刺激機(jī)體大量T細(xì)胞活化，產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)，在腫瘤疾病免疫治療過程中具有巨大的潛能。因此，如果能夠使用BCG作為疫苗載體構(gòu)建金葡菌腸毒素蛋白的活菌疫苗，將其接種機(jī)體后使之持續(xù)分泌表達(dá)金葡菌腸毒素蛋白，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)使其殺傷腫瘤細(xì)胞，將有望達(dá)到高效預(yù)防和治療人類腫瘤疾病的發(fā)生的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種新型的能夠用于預(yù)防和治療人類腫瘤疾病的活菌疫苗，特別是提供一種能夠胞外表達(dá)野生型金葡菌腸毒素蛋白或者突變型金葡菌腸毒素蛋白的重組BCG活菌疫苗。
[0009]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供了一種重組BCG活菌菌株，其特征在于:是將編碼野生型金葡菌腸毒素蛋白的野生型金葡菌腸毒素基因序列或者編碼突變型金葡菌腸毒素蛋白的突變型金葡菌腸毒素基因序列導(dǎo)入BCG活菌菌株后得到的重組菌株，所述野生型金葡菌腸毒素基因序列是指野生型金葡菌腸毒素SEA、SEB、SEC2、SED、SEE基因序列，所述突變型金葡菌腸毒素基因序列是指采用PCR的方法引入突變位點(diǎn)對(duì)SEA的D227A，SEC2的T20L、T20L/G22E、G22E/N23A和T20L/G22E/N23A進(jìn)行定點(diǎn)突變改造后所獲得的編碼低毒或無毒的金葡菌腸毒素蛋白的突變型金葡菌腸毒素A227、C20、CTG、CGN、C3基因序列。
[0010]進(jìn)一步地，所述突變型金葡菌腸毒素A227、C20、CTG、CGN、C3基因序列分別具有如SEQ ID N0:6-10所示的核苷酸序列。
[0011 ] 進(jìn)一步地，所述重組BCG活菌菌株是將所述野生型金葡菌腸毒素基因序列或者所述突變型金葡菌腸毒素基因序列克隆到BCG-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體上后導(dǎo)入BCG活菌菌株中得到的重組菌株。
[0012]進(jìn)一步地，所述BCG-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體上還連接有核苷酸序列如SEQIDNO: 11所示的BCG分泌信號(hào)肽基因序列。
[0013]本發(fā)明還提供了上述重組BCG活菌菌株的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟:
[0014](I)利用限制性內(nèi)切酶和鏈接酶將核苷酸序列如SEQ ID NO: 1-10所示的基因序列中的任一個(gè)以及核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示的BCG分泌信號(hào)肽基因序列克隆到BCG-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli TOPlO中，獲得正確的重組轉(zhuǎn)化子;
[0015](2)將上述在大腸桿菌中構(gòu)建好的穿梭表達(dá)載體導(dǎo)入到BCG活菌菌株中獲得重組BCG活菌菌株，并通過抗生素篩選、PCR鑒定、酶切鑒定和測(cè)序鑒定陽性轉(zhuǎn)化子；
[0016](3)將上述獲得的重組BCG活菌菌株經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液上清，上清液經(jīng)超濾管適當(dāng)濃縮后進(jìn)行Western blot鑒定表達(dá)的金葡菌腸毒素蛋白情況。
[0017]進(jìn)一步地，上述構(gòu)建方法中所使用的BCG-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體為P麗234穿梭表達(dá)載體。
[0018]本發(fā)明還提供了一種活菌疫苗，其特征在于:所述活菌疫苗中含有上述重組BCG活菌菌株。
[0019]本發(fā)明還提供了上述重組BCG活菌菌株在制備預(yù)防和治療人類腫瘤疾病的藥物中的應(yīng)用，其應(yīng)用方法是將該重組BCG活菌菌株輔以藥學(xué)上可接受的佐劑制備成疫苗，該疫苗可單獨(dú)使用也可聯(lián)合其他藥物或者放療化療一起使用，使用時(shí)經(jīng)皮內(nèi)注射，注射量以BCG活菌個(gè)數(shù)計(jì)為IO6CFU/人，可一次注射，也可分多次注射。
[0020]有益效果:
[0021]本發(fā)明成功將野生型和突變型金葡菌腸毒素基因?qū)隑CG活菌菌株中得到了能夠在BCG細(xì)胞中表達(dá)分泌出野生型和突變型金葡菌腸毒素蛋白的重組BCG活菌菌株。動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，將該重組BCG活菌菌株作為疫苗接種機(jī)體后，可持續(xù)分泌表達(dá)金葡菌腸毒素蛋白，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)使其殺傷腫瘤細(xì)胞，使癌癥患者獲得強(qiáng)大的免疫治療，從而達(dá)到治療癌癥的目的。本方法為野生型和突變型金葡菌腸毒素蛋白BCG重組抗癌疫苗的生產(chǎn)及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。`【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是金葡菌腸毒素CTG基因的重組穿梭表達(dá)分泌載體pMN- a -CTG的物理圖譜；
[0023]圖2是本發(fā)明重組BCG胞外表達(dá)突變型金葡菌腸毒素SEC2蛋白的Western blot鑒定圖；
[0024]圖3是本發(fā)明活菌疫苗治療腫瘤模型的荷瘤大小比較；
[0025]圖4是本發(fā)明活菌疫苗治療腫瘤模型的荷瘤重量比較圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的解釋，本發(fā)明并不局限于以下實(shí)施例。
[0027]以下實(shí)施例中所用原料來源
[0028]菌株與載體:大腸桿菌菌株E.coli T0P10由本實(shí)驗(yàn)室保存，恥垢分支桿菌、BCG由深圳市疾病預(yù)防控制中心惠贈(zèng)。PMN234載體由北京蛋白質(zhì)組學(xué)研究中心惠贈(zèng)。
[0029]酶與試劑盒:限制性內(nèi)切酶購自Fermentas公司，連接酶為NEB公司產(chǎn)品，Taq酶購自北京全式金生物科技有限公司?；蚪M提取試劑盒為OMEGA品牌產(chǎn)品。
[0030]生化試劑:DNA序列、引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。所述所有野生型金葡菌腸毒素基因由本實(shí)驗(yàn)室前期克隆獲得。金葡菌腸毒素SEC2蛋白單克隆抗體為Santas公司產(chǎn)品。TEMED、過硫酸銨、丙烯酰胺及甲叉雙丙烯酰胺為Promega公司產(chǎn)品。[0031]培養(yǎng)基:大腸桿菌培養(yǎng)基為LB (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、l%NaCl，pH7.0 ；M7H9+ADC液體培養(yǎng)基:稱取4.79Middlebrook7H9Broth,溶于900ml去離子水中，加入
0.2%的甘油和0.05%的Tween-80,121 °C高壓滅菌30min，待冷卻至45°C加入IOOmLADCEnrichment，4i5C 保存；M7H10+0ADC 固體培養(yǎng)基:稱取 19g Middlebrook M7H10Agar，溶于900ml去離子水中，加入0.4%甘油和0.1%的Tween-80，混勻，121°C高壓滅菌30min，待冷卻至 50-55DC，加入 IOOmL OADC Enrichment，倒置平板。
[0032]實(shí)施例中其它未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法進(jìn)行，如SambiOok等人的方法，分子克隆按(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0033]實(shí)施例1
[0034]野生型金葡菌腸毒素SEA、SEC2基因脫毒突變改造
[0035]根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道(VladimirS，et al.Toxicon.2004，43:433-438.等)及抗原表位分析網(wǎng)站(http://www.epipredict.de/)預(yù)測(cè)結(jié)果，對(duì)野生型金葡菌腸毒素SEA、SEC2基因序列(GenBank登陸號(hào):NM—001126112)進(jìn)行基因改造，改造位點(diǎn)為SEA的(D227A)、SEC2的(T20L ；T20L/G22E ；G22E/N23A ；T20L/G22E/N23A)氨基酸位點(diǎn)。
[0036]1.設(shè)計(jì)引物
[0037]利用Gene Tool軟件設(shè)計(jì)相關(guān)突變引物，結(jié)果如下: [0038](I)SEA基因D227A單一位點(diǎn)突變引物
[0039]Forward:
[0040]5’-tgctatatatttatatacaagttaagtcgacaagctt-3J
[0041]Reverse:
[0042]5’-atatgcatgttttcagagttaatcgtttt-3’
[0043](2) SEC2基因T20L單一位點(diǎn)突變引物
[0044]Forward:
[0045]5’-tttaatgggtaatatgaaatatttatatgatgatca-3?
[0046]Reverse:
[0047]5’-ccagtaaactcacttgatttgtgcaactc-3’
[0048](3) SEC2基因T20L/G22E雙位點(diǎn)突變引物
[0049]Forward:
[0050]5’-tttaatggagaatatgaaatatttatatgatgatca-3?
[0051]Reverse:
[0052]5’-atatgcatgttttcagagttaatcgtttt-3’
[0053](4) SEC2基因G22E/N23A雙位點(diǎn)突變引物
[0054]Forward:
[0055]5’-tacgatggaggcaatgaaatatttatatgatg-3J
[0056]Reverse:
[0057]5’-atatgcatgttttcagagttaatcgtttt-3’
[0058](5) SEC2基因T20L/G22E/N23A三個(gè)位點(diǎn)突變引物
[0059]Forward:[0060]5' -tttaatggaggcaatgaaatatttatatgatg-3'
[0061]Reverse:
[0062]5' -atatgcatgttttcagagttaatcgtttt-3'
[0063]以上突變引物由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成。
[0064]2.SEA、SEC2基因各位點(diǎn)基因改造
[0065]利用上述引物對(duì)腸毒素SEA、SEC2基因進(jìn)行定點(diǎn)突變PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收、連接、轉(zhuǎn)化，最終對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定。具體操作方法及步驟如下:
[0066](I) 25μ I的PCR引入突變反應(yīng)體系為:
[0067]
【權(quán)利要求】
1.一種重組BCG活菌菌株，其特征在于:是將編碼野生型金葡菌腸毒素蛋白的野生型金葡菌腸毒素基因序列或者編碼突變型金葡菌腸毒素蛋白的突變型金葡菌腸毒素基因序列導(dǎo)入BCG活菌菌株后得到的重組菌株，所述野生型金葡菌腸毒素基因序列是指野生型金葡菌腸毒素5E4、SEB、SEC2、SED、5^基因序列，所述突變型金葡菌腸毒素基因序列是指采用PCR的方法引入突變位點(diǎn)對(duì)的m2UEC2的T20L、T20L/G22E、G22E/N23A和T20L/G22E/N23A進(jìn)行定點(diǎn)突變改造后所獲得的編碼低毒或無毒的金葡菌腸毒素蛋白的突變型金葡菌腸毒素C20、CTG、CGN、C3基因序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組BCG活菌菌株，其特征在于:所述突變型金葡菌腸毒素A227, C20、CTG、CGN、C3基因序列分別具有如SEQ ID N0:6-10所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組BCG活菌菌株，其特征在于:是將所述野生型金葡菌腸毒素基因序列或者所述突變型金葡菌腸毒素基因序列克隆到BCG-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體上后導(dǎo)入BCG活菌菌株中得到的重組菌株。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組BCG活菌菌株，其特征在于:所述BCG-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體上還連接有核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示的BCG分泌信號(hào)肽基因序列。
5.一種活菌疫苗，其特征在于:含有權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的重組BCG活菌菌株。
6.權(quán)利要求4所述的重組BCG活菌菌株的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟: (1)利用限制性內(nèi)切酶和鏈接酶將核苷酸序列如SEQID NO: 1-10所示的基因序列中的任一個(gè)以及核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示的BCG分泌信號(hào)肽基因序列克隆到BCG-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌萬.coli TOPlO中，獲得正確的重組轉(zhuǎn)化子； (2)將上述在大腸桿菌中構(gòu)建好的穿梭表達(dá)載體導(dǎo)入到BCG活菌菌株中獲得重組BCG活菌菌株，并通過抗生素篩選、PCR鑒定、酶切鑒定和測(cè)序鑒定陽性轉(zhuǎn)化子； (3)將上述獲得的重組BCG活菌菌株經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液上清，上清液經(jīng)超濾管適當(dāng)濃縮后進(jìn)行Western blot鑒定表達(dá)的金葡菌腸毒素蛋白情況。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，其特征在于:所述BCG-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體為PMN234穿梭表達(dá)載體。
8.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的重組BCG活菌菌株在制備預(yù)防和治療人類腫瘤疾病的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/07GK103497927SQ201310495347
【公開日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2013年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月21日
【發(fā)明者】胡章立, 李勇 申請(qǐng)人:深圳大學(xué)