一種熒光rt-pcr檢測(cè)異育銀鯽tlr9基因相對(duì)表達(dá)量的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種熒光RT-PCR檢測(cè)異育銀鯽TLR9基因相對(duì)表達(dá)量的方法。通過(guò)異育銀鯽TLR9基因特異性上、下游引物：TLR9－qF:5’–TCCAGAGTCATTGGCTGGTGTT–3’;TLR9－qR:5’–CATAGAGATGCTTCAGGAGGGG–3’，獲得異育銀鯽TLR9基因的140bp產(chǎn)物。TLR9基因的表達(dá)豐度在一定程度上反映了異育銀鯽免疫系統(tǒng)的活度，可以作為異育銀鯽疾病防治中的免疫監(jiān)測(cè)指標(biāo)。通過(guò)檢測(cè)異育銀鯽TLR9基因表達(dá)量的變化，可以提早判斷異育銀鯽是否感染了病原，及時(shí)采取有效的預(yù)防治療措施，避免疾病的嚴(yán)重發(fā)展造成不可挽回的巨大損失。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種熒光RT-PCR檢測(cè)異育銀鯽TLR9基因相對(duì)表達(dá)量的方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及用于檢測(cè)異育銀鯽TLR9基因表達(dá)的特異性引物， 更具體地說(shuō)是涉及一種熒光RT-PCR檢測(cè)異育銀鯽TLR9基因相對(duì)表達(dá)量的方法。主要用于異育銀鯽TLR9基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理研究和免疫學(xué)功能研究，以及異育銀鯽早期病原感染的監(jiān)測(cè)?！颈尘凹夹g(shù)】[0002]隨著世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量大幅增加，水產(chǎn)品的跨國(guó)貿(mào)易及水產(chǎn)苗種的跨區(qū)域交流也日益頻繁，極大增加了水產(chǎn)動(dòng)物病原微生物的傳播幾率。此外，水產(chǎn)養(yǎng)殖的高密度集約化、漁業(yè)水環(huán)境的惡化以及各種抗菌抗生素類(lèi)漁藥的濫用，也會(huì)引發(fā)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體的免疫系統(tǒng)受到抑制。正是這些因素的相互影響，導(dǎo)致魚(yú)病頻發(fā)，給漁業(yè)發(fā)展造成了不可估量的損失。運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)作為水產(chǎn)養(yǎng)殖的技術(shù)支撐，掌握疾病的免疫防御技術(shù)是漁業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展所必須解決的問(wèn)題。在對(duì)疾病防治途徑進(jìn)行探索的過(guò)程中，人們逐漸認(rèn)識(shí)到免疫防病技術(shù)的優(yōu)越性，近年來(lái)國(guó)際上魚(yú)類(lèi)免疫學(xué)的研究逐漸受到重視。[0003]1996年，Science雜志發(fā)表了題為“天然免疫對(duì)獲得性免疫應(yīng)答的指導(dǎo)作用” 一文，首次明確地將天然免疫提高到如此重要的地位。1997年Current Opinion In Immunology刊文提出模式識(shí)別受體(pattern-recognizing receptors, PRRs)和病原相關(guān)的分子模式(pathog en-associated molecular patterns, PAMPs)的概念，論證 PRRs 的模式識(shí)別作用賦予免疫系統(tǒng)識(shí)別“自己” “非己”的能力，標(biāo)志著天然免疫研究進(jìn)入了一個(gè)嶄新的階段。魚(yú)類(lèi)是獲得性免疫(特異性免疫)和天然免疫(非特異性免疫)并存的脊椎動(dòng)物， 但與哺乳動(dòng)物相比，魚(yú)類(lèi)獲得性免疫機(jī)制還不完善，在抵御病原微生物時(shí)主要依賴(lài)天然免疫發(fā)揮作用。[0004]Toll樣受體(Tol 1-1 ike receptors,TLRs)家族是動(dòng)物識(shí)別入侵病原體的主要“模式識(shí)別受體”(PRRs)，幾乎可以識(shí)別所有病原微生物的高度保守的結(jié)構(gòu)基序“病原相關(guān)的分子模式”(PAMPs)，在啟動(dòng)機(jī)體產(chǎn)生天然免疫應(yīng)答上起著非常關(guān)鍵的作用。PAMPs包括各種細(xì)菌細(xì)胞壁成分，如脂多糖、多肽糖、胞壁酸等，以及病毒的RNA，酵母細(xì)胞壁上的甘露糖， 還有鞭毛蛋白、細(xì)菌DNA等。在人類(lèi)中已經(jīng)證明具有病毒識(shí)別功能的有TLR2、TLR3、TLR4、 TLR7、TLR8和TLR9。與在人類(lèi)等高等哺乳動(dòng)物研究相比，TLRs在魚(yú)類(lèi)及其他低等脊椎動(dòng)物中的研究還比較少，但通常認(rèn)為T(mén)LR1、2、4、5和6主要參與細(xì)菌成分的識(shí)別，而TLR3、7和8 主要特異性地識(shí)別病毒性成分，TLR9對(duì)這二者均能夠識(shí)別。[0005]異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)是利用三倍體的方正銀鯽為母本、二倍體的興國(guó)紅鯉為父本，通過(guò)人工雜交的方法誘使方正銀鯽的卵進(jìn)行雌核發(fā)育而培育的鯽魚(yú)養(yǎng)殖新品種，由于其具有生長(zhǎng)速度快、適應(yīng)范圍廣、肉味鮮美等特點(diǎn)，已成為國(guó)內(nèi)大力推廣養(yǎng)殖的優(yōu)良品種之一。近年來(lái)，由于水環(huán)境的惡化、養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大、漁藥使用的不規(guī)范等因素，異育銀鯽病害發(fā)生率不斷攀升，尤其是2011年8月在我國(guó)異育銀鯽主要養(yǎng)殖區(qū)江蘇省出現(xiàn)重大疫情“鯽魚(yú)病毒性出血病，”短時(shí)間內(nèi)疫病迅速蔓延，發(fā)病面積超過(guò)10萬(wàn)畝，死亡率高達(dá)90-100%，造成經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)億元。本研究室國(guó)家大宗淡水魚(yú)類(lèi)病毒學(xué)類(lèi)崗位科學(xué)家曾令兵研究員帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì)成員第一時(shí)間迅速介入，通過(guò)病原分離、電鏡觀察、回歸感染以及PCR擴(kuò)增等技術(shù)確定異育銀鯽病毒性出血病的病原為“鯉皰疹病毒II型”(Cyrinidherpesvirus-2, Cy HV_2)。由于異育銀鯽的病毒性出血病在國(guó)內(nèi)是首次發(fā)現(xiàn)，缺乏相關(guān)的前期研究基礎(chǔ)，而且對(duì)于異育銀鯽的免疫機(jī)理和機(jī)制了解較少，所以目前對(duì)于該病毒病尚無(wú)有效的免疫防治技術(shù)和治療方法。
[0006]TLRs是宿主免疫的必需分子，通過(guò)感知入侵的病原微生物，識(shí)別病原相關(guān)分子模式，活化細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，來(lái)激活宿主的天然免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，進(jìn)而抵御病原微生物的感染。TLR9作為T(mén)LRs家族的重要成員，參加魚(yú)類(lèi)的免疫調(diào)節(jié)，在一定程度上反映了魚(yú)類(lèi)的免疫能力，因此可以作為魚(yú)類(lèi)疾病防治中免疫監(jiān)測(cè)的指標(biāo)。有關(guān)異育銀鯽TLR9基因的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究室利用RACE技術(shù)首次從異育銀鯽中克隆得到了 TLR9基因的全長(zhǎng)cDNA序列，其Genbank序列號(hào)為KC816577。
[0007]實(shí)時(shí)突光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR)是在常規(guī) PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù)。與常規(guī)PCR相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有特異性高、靈敏度高、可定量、有效解決PCR污染問(wèn)題及自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，保證了結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域。隨著實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的進(jìn)一步研發(fā)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在水產(chǎn)動(dòng)物疫病診斷中也得到了廣泛的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供了一種熒光RT-PCR檢測(cè)異育銀鯽TLR9基因相對(duì)表達(dá)量的方法。與常規(guī)PCR相比，該方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、時(shí)間短、重復(fù)性好優(yōu)點(diǎn)。
`[0009]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0010]一種熒光RT-PCR檢測(cè)異育銀鯽TLR9基因相對(duì)表達(dá)量的方法，步驟如下:
[0011](I)針對(duì)異育銀鯽TLR9基因設(shè)計(jì)的引物序列如下:
[0012]TLR9-qF:5 ’ - TCCAGAGTCATTGGCTGGTGTT - 3’
[0013]TLR9-qR:5 ’ - CATAGAGATGCTTCAGGAGGGG - 3’
[0014]根據(jù)鯽魚(yú)β-actin基因cDNA序列(JX413519)，設(shè)計(jì)一對(duì)適用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的內(nèi)參基因特異性引物，引物序列如下:
[0015]β -actin-qF: 5 ’ - CACCACGGCCGAAAGAGAAATT - 3’
[0016]β -actin-qR: 5 ’ - AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGAG - 3 ’ ；
[0017](2)總RNA的提取與純化:采用常規(guī)RNA提取和純化方法，從異育銀鯽脾臟中提取得到純化的總RNA ；
[0018](3) cDNA第一鏈的合成:以異育銀鯽脾臟總RNA為模板合成cDNA第一鏈；
[0019](4)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR:采用 Bioteke 的 Power2XSYBR Real-time PCRPremixture試劑盒進(jìn)行。以上述合成的cDNA第一鏈為模板，上述(I)中TLR9-qF、TLR9_qR和β -actin-qF、β -actin-qR為引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行管，PCR擴(kuò)增結(jié)束后所得3個(gè)平行管的Ct值取平均數(shù)。
[0020]實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系如下:
[0021]Power2 X SYBR Real-time PCR Premixture 混合物 25 μ L、20 μ mol/L 正向引物和反向引物各I μ L> cDNA第一鏈模板2 μ L、無(wú)菌雙蒸水21 μ I,總反應(yīng)體積為50 μ L。
[0022]實(shí)時(shí)突光定量PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下:
[0023]95 °C 2min ；
[0024]95°C 15s,60°C 15s,72°C 20s (共 40 個(gè)循環(huán))。
[0025](5)異育銀鯽脾臟組織中TLR9基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算:實(shí)時(shí)熒光定量PCR完成后，根據(jù)獲得的Ct值計(jì)算異育銀鯽被病毒感染后各時(shí)間段下的ACt和T (Λ Λ⑴值，計(jì)算方法如下:
[0026]Δ Ct=Ct (TLR9) -Ct ( β -actin)
[0027]Δ Δ Ct= Δ Ct (TLR9)-ACt (O 時(shí)健康異育銀鯽)
[0028]以2_ (Λ "Gt)數(shù)值表示異育銀鯽脾臟中TLR9基因相對(duì)于健康異育銀鯽TLR9基因的
表達(dá)量。
[0029]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0030](I)本發(fā)明采用的實(shí)時(shí)`熒光定量PCR技術(shù)與常規(guī)PCR相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)自動(dòng)收集熒光信號(hào)，避免了肉眼判斷的主觀性，可提高實(shí)驗(yàn)的靈敏度；實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)采用全封閉反應(yīng)，無(wú)需PCR后處理，避免污染，保證了結(jié)果的可靠性和重復(fù)性；實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)也免除了常規(guī)PCR中的電泳、定量掃描等后續(xù)繁瑣步驟，大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。
[0031](2) TLR9基因的表達(dá)豐度在一定程度上反映了異育銀鯽免疫系統(tǒng)的活度，當(dāng)TLR9基因相對(duì)表達(dá)量增高時(shí)，提示異育銀鯽可能已處于病原感染狀態(tài)，而此時(shí)憑肉眼還觀察不到異育銀鯽體表上有任何病原感染病癥。因此通過(guò)監(jiān)測(cè)異育銀鯽脾臟組織中TLR9基因相對(duì)表達(dá)量的變化，可提早得知異育銀鯽是否被病原感染，及時(shí)采取有效的預(yù)防治療措施，避免勢(shì)態(tài)的嚴(yán)重發(fā)展造成不可挽回的損失。
[0032](3)TLRs是宿主免疫的必需分子，通過(guò)感知入侵的病原微生物，識(shí)別病原相關(guān)分子模式，活化細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，來(lái)激活宿主的天然免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，進(jìn)而抵御病原微生物的感染。TLR9作為T(mén)LRs家族的成員，參加魚(yú)類(lèi)的免疫調(diào)節(jié)，TLR9可識(shí)別病毒成分，病毒感染宿主后，TLR9的表達(dá)量顯著升高。因此可以通過(guò)TLR9基因?qū)Σ《具M(jìn)行監(jiān)測(cè)，一旦發(fā)現(xiàn)表達(dá)量升高，立即采取預(yù)防措施，贏取時(shí)間并做進(jìn)一步詳細(xì)診斷和治療。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0033]圖1為異育銀鯽TLR9基因和內(nèi)參基因β-actin實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果;
[0034]從左至右的泳道依次為DL500DNA Marker,TLR9 基因(140bp)、β -actin (198bp)、DL500DNA Marker。
[0035]圖2為T(mén)LR9基因在健康異育銀鯽及腹腔注射CyHV_2病毒的異育銀鯽脾臟組織中的差異表達(dá)分析?！揪唧w實(shí)施方式】[0036]下列實(shí)例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)該當(dāng)做對(duì)本發(fā)明的限制。[0037]實(shí)施例1:[0038]異育銀鯽的人工感染實(shí)驗(yàn):[0039]收集病魚(yú)(鯉皰疹病毒II型感染)的肝、脾、腎等內(nèi)臟組織于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌眼科剪剪碎，加入10倍體積(V/W)的DPBS(Sigma公司產(chǎn)品)，轉(zhuǎn)入玻璃均化器內(nèi)并在冰浴下研磨成組織勻漿液。將組織勻漿液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中(BD公司產(chǎn)品)，在280°C冷凍后于室溫再融化，如此反復(fù)凍融3次，隨后在4°C，4000r/min離心30min (Sigma, 3K215)。取上清液經(jīng)0.22 μ m濾器(Nalgene公司產(chǎn)品)過(guò)濾。獲得的組織勻漿濾液(病毒的copy數(shù)為l.eXlOYopies/yL)立即用于魚(yú)體人工感染試驗(yàn)，剩余濾液可分裝于凍存管(Corning 公司產(chǎn)品)并在_80°C保存?zhèn)溆?。[0040]人工感染試驗(yàn)在水族箱中進(jìn)行，水體體積為40L，連續(xù)充氣，水溫25°C。取近期未用過(guò)疫苗的健康異育銀鯽(體長(zhǎng)10~15cm) 60尾，每尾經(jīng)腹腔注射0.2mL上病毒懸液，作為病毒感染組；以DPBS注射作為對(duì)照組，繼續(xù)在水族箱中培養(yǎng)，分別于注射病毒后的6h、12h、 24h、48h、72h取其脾臟組織，迅速置于液氮中凍存保藏。[0041]實(shí)施例2:[0042]總RNA的提取和純化:[0043](I)取液氮凍存的脾臟組織50-100mg加入ImL Trizol后，用勻漿器徹底勻漿混勻，室溫放置5min，使其充分裂解。[0044](2)4°C, 12, 000r/min,離心IOmin,上清轉(zhuǎn)移至一新的無(wú)RNase的1.5mL離心管中，棄沉淀。[0045](3)每管加入200 μ L氯仿，振蕩混勻后室溫放置15min。[0046](4)4°C, 12, 000r/min,離心15min,吸取上層水相,轉(zhuǎn)移至一新的無(wú)RNase的1.5mL 離心管中。[0047](5)每管加入0.5mL異丙醇,輕輕混勻后,室溫放置5_10min。[0048](6) 4°C, 12，000r/min,離心 IOmin,棄上清,RNA 沉于管底。每管加入 ImL DEPC 水配制的75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。[0049](7) 4°C,8, 000r/min,離心5min,盡量棄上清,所得沉淀即為異育銀鯽脾臟組織的 RNA,室溫晾干5-10min后，加入DEPC水溶解，并于_80°C保存?zhèn)溆谩0050]實(shí)施例3:[0051]TLR9基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè):[0052](I)引物: [0053]TLR9-qF:5 ’ - TCCAGAGTCATTGGCTGGTGTT - 3’[0054]TLR9-qR:5 ’ - CATAGAGATGCTTCAGGAGGGG - 3’[0055]異育銀鯽TLR9基因的PCR產(chǎn)物預(yù)計(jì)長(zhǎng)度為140bp，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示PCR 擴(kuò)增后的產(chǎn)物長(zhǎng)度與預(yù)計(jì)長(zhǎng)度一致，且為單一條帶，說(shuō)明所設(shè)計(jì)的引物具有很強(qiáng)的特異性， 適合用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。[0056]同時(shí)根據(jù)Genbank里查找到的鯽魚(yú)β-actin基因cDNA序列(JX413519)，設(shè)計(jì)一對(duì)適用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的內(nèi)參基因特異性引物，引物序列如下:[0057]β-actin-qF:5’ - CACCACGGCCGAAAGAGAAATT - 3，
[0058]β -actin-qR:5，- AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGAG - 3，；
[0059]異育銀鯽β -actin基因的PCR產(chǎn)物預(yù)計(jì)長(zhǎng)度為198bp，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物長(zhǎng)度與預(yù)計(jì)長(zhǎng)度一致，且為單一條帶，說(shuō)明所設(shè)計(jì)的引物具有很強(qiáng)的特異性，適合用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。
[0060](2) cDNA第一鏈的合成:
[0061]以實(shí)施例2所得到的異育銀鯽脾臟總RNA作為模板，用ImProm-1I TM反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)中的01 igo(dT)作為引物,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,合成cDNA第一鏈，反應(yīng)體系的總體積為20 μ L。
[0062](3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR:
[0063]實(shí)時(shí)突光定量PCR 米用 Bioteke 的 Power2X SYBR Real-time PCR Premixture試劑盒進(jìn)行。以上述(2)中合成的cDNA第一鏈為模板，上述(I)中TLR9_qF、TLR9_qR和β -actin-qF、β -actin-qR為引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行管，PCR擴(kuò)增結(jié)束后所得3個(gè)平行管的Ct值取其平均數(shù)。
[0064]實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系如下:
[0065]Power2X SYBR Real-time PCR Premixture 混合物 25 μ L、10 μ mol/L 正向引物和反向引物各I μ L> cDNA第一鏈模板2 μ L、無(wú)菌雙蒸水21 μ I,總反應(yīng)體積為50 μ L。
[0066]實(shí)時(shí)突光定量PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下:
[0067]95 °C 2min ；`
[0068]95°C 15s,60°C 15s,72°C 20s (共 40 個(gè)循環(huán))。
[0069](4)病毒感染的異育銀鯽脾臟中TLR9基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算:
[0070]實(shí)時(shí)熒光定量PCR完成后，根據(jù)所獲得的Ct值計(jì)算異育銀鯽被病毒感染后各時(shí)間段下的Λ Ct和2_(ΛΛΜ)值，計(jì)算方法如下:
[0071]Δ Ct=Ct (TLR9) -Ct ( β -actin)
[0072]Δ Δ Ct= Δ Ct (TLR9)-ACt (O 時(shí)健康異育銀鯽)
[0073]以2_(Δ "Gt)數(shù)值表示病毒感染異育銀鯽脾臟中TLR9基因相對(duì)于健康異育銀鯽TLR9基因的表達(dá)量。
[0074]2_(Λ 數(shù)值代表了病毒感染異育銀鯽脾臟中TLR9基因相對(duì)于健康異育銀鯽TLR9基因的表達(dá)倍數(shù)。β-actin即β_肌動(dòng)蛋白，是細(xì)胞的一種重要骨架蛋白，在所有類(lèi)型的細(xì)胞中都進(jìn)行表達(dá)，且其表達(dá)水平僅受啟動(dòng)子與RNA聚合酶相互作用的影響，受環(huán)境影響因素很小，表達(dá)水平較為恒定，因此β-actin被作為公認(rèn)的內(nèi)參基因，常用做測(cè)定目標(biāo)基因表達(dá)量時(shí)的內(nèi)參照。本實(shí)驗(yàn)中2_(ΔΔΜ)數(shù)值越大，表明TLR9基因的表達(dá)量越高。
[0075]圖2為病毒感染后的不同時(shí)間段異育銀鯽脾臟組織中TLR9基因的相對(duì)表達(dá)量。從圖中可以看出，病毒感染后的12h，TLR9基因的表達(dá)量就開(kāi)始升高，表達(dá)量是健康異育銀鯽(Oh)的10.1倍；感染后的24h，TLR9表達(dá)量是健康異育銀鯽的51.3倍；72h時(shí)TLR9表達(dá)量達(dá)到最高，是健康異育銀鯽的75.7倍。以上結(jié)果表明，當(dāng)TLR9基因相對(duì)表達(dá)量增高時(shí)，即表明異育銀鯽已經(jīng)處于病原感染狀態(tài)，異育銀鯽體內(nèi)固有的免疫系統(tǒng)已經(jīng)啟動(dòng)，盡管此時(shí)從肉眼上觀察不到異育銀鯽體表上有任何感染的病癥。
[0076]表1為在不同時(shí)間段測(cè)得的TLR9基因的Ct值
【權(quán)利要求】
1.一種熒光RT-PCR檢測(cè)異育銀鯽TLR9基因相對(duì)表達(dá)量的特異性引物，其特征在于它是由符合熒光定量PCR反應(yīng)特點(diǎn)的異育銀鯽TLR9基因特異性上、下游引物:TLR9 — qF: 5’ -TCCAGAGTCATTGGCTGGTGTT - 3’；TLR9 —qR: 5’ - CATAGAGATGCTTCAGGAGGGG - 3’ ； 以及作為內(nèi)參基因的異育銀鯽β -actin基因特異性上、下游引物:β — actin — qF:5’ -CACCACGGCCGAAAGAGAA`ATT - 3，； β — actin — qR:5，- AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGAG - 3， 組成。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103498003SQ201310502471
【公開(kāi)日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2013年10月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月23日
【發(fā)明者】范玉頂, 曾令兵, 周勇, 董圣, 徐進(jìn), 張輝 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所