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G6PDH基因在提高黑根霉對甾體C11α-羥基化能力中的應用及菌株的制作方法

文檔序號:522352閱讀:355來源:國知局
G6PDH基因在提高黑根霉對甾體C11α-羥基化能力中的應用及菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了G6PDH基因在提高黑根霉對甾體C11α-羥基化能力中的應用,以及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因工程菌的構(gòu)建方法和構(gòu)建后篩選獲得的菌株。本發(fā)明通過分子生物學方法將G6PDH克隆至黑根霉中,改造菌種,擬在改造后的黑根霉細胞內(nèi)實現(xiàn)G6PDH催化NADPH再生,向細胞色素P450酶系催化的反應提供所需要的輔酶,改善黑根霉對甾體C11α-羥基化的能力。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:按照本發(fā)明方法構(gòu)建的基因工程菌,用于轉(zhuǎn)化沃氏氧化物C11α-羥基化生產(chǎn)霉菌氧化物,相比出發(fā)菌株,生長快,原料利用率高,轉(zhuǎn)化率和轉(zhuǎn)化效率高,在甾體藥物的開發(fā)和利用過程中具有深遠的理論意義和較高的應用價值。
【專利說明】G6PDH基因在提高黑根霉對留體Cl 1 α -羥基化能力中的應用及菌株
(-)【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及G6TOH基因在提高黑根霉對甾體Cll α -羥基化能力中的應用,以及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因工程菌的構(gòu)建方法,以及構(gòu)建并篩選獲得的一株留體Cll α -羥基化較高的菌株-黑根霉(Rhizopus nigericans) Pie。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]氧化還原酶催化合成的產(chǎn)物被廣泛應用于醫(yī)藥、食品、農(nóng)藥等領域,酶催化過程中輔酶不足是限制大多數(shù)氧化還原酶進行生物催化合成產(chǎn)物的主要因素。因此,輔酶循環(huán)再生對于酶催化過程顯得非常重要,進而在醫(yī)藥食品等相關的產(chǎn)品生產(chǎn)中體現(xiàn)重大的價值。文獻報道輔酶的再生方法包括酶法、光化學、電化學等再生方法,其中尤以酶法再生受到廣泛重視。常用于輔酶再生的酶有醇脫氫酶(ADH)、甲酸脫氫酶(FDH)、葡萄糖脫氫酶(⑶H)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)、亞磷酸脫氫酶(PTDH)等,其中FDH和⑶H的研究和應用較多,例如,Sheldon 研究 E.coli JM109 (pGDA2)過量表達來自于 Bacillus megateriumIWG3葡萄糖脫氫酶基因,當提供NADP+和葡萄糖時,E.coli JM109 (pGDA2)能夠作為NADPH的再生系統(tǒng)。ZhinanXu將Bacillus megaterium ASl.223中的葡萄糖脫氫酶基因gdh223通過克隆構(gòu)建pQE30-gdh223表達載體,并在大腸桿菌中表達,實現(xiàn)由4-氯乙酰乙酸乙酯到(R) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯的轉(zhuǎn)化。相對于FDH和⑶H,G6PDH用于輔酶再生的報道相對較少。
[0003]葡萄糖_6_ 憐酸脫氧酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH,ECl.1.1.49)是戊糖磷酸途徑(PPP)氧化階段中催化第一步反應的酶和PPP代謝途徑調(diào)控中的一個關鍵調(diào)控酶。G6PDH廣泛存在于包括細菌、植物、動物等各種生物細胞中,其催化的反應產(chǎn)生大量的還原型輔酶NADPH,NADPH作為負氫離子供體提供還原力,滿足許多細胞代謝過程的需要,如脂肪酸固醇類的合成,光合作用中由CO2合成葡萄糖,核酸合成,維持紅細胞中還原型谷胱甘肽水平等,因而G6TOH所催化的反應在還原性生物合成中具有重要的作用。此外,G6TOH還與細胞生長發(fā)育,溶血性貧血癥、植物脅迫應答、心血管疾病,腫瘤等許多人類疾病有關。
[0004]甾體化合物具有抗炎、抗真菌、免疫抑制、利尿、避孕等作用[76],臨床應用廣泛,需求量大,已成為醫(yī)藥行業(yè)中僅次于抗生素的第二大類藥物,甾體羥基化中C11 α -羥基化是極其重要的留體反應之一,通過C11C1-羥基化引入高生理活性基團,可以顯著提高留體藥物的療效,減少副作用,改變作用的專屬性等。1952年Peterson和Murry等首次利用黑根霉一步轉(zhuǎn)化實現(xiàn)孕酮C11 α -羥基化生成C11 α -羥基孕酮,促進了可的松藥物的的產(chǎn)業(yè)化,隨后,微生物轉(zhuǎn)化留體在留體藥物的生產(chǎn)中越來越受到重視。經(jīng)過近幾十年的研究,黑根霉生物轉(zhuǎn)化留體Cll α -羥基化工藝和技術(shù)已相對較成熟,通過誘變育種改善了菌株轉(zhuǎn)化能力,所以在現(xiàn)有菌株和工藝基礎上很難繼續(xù)提高轉(zhuǎn)化率,如何采用新的方法進一步改進菌株的生產(chǎn)能力就成為該領域人員尤為關注的問題。(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的是通過分子生物學方法將G6PDH克隆至黑根霉中,改造菌種,擬在改造后的黑根霉細胞內(nèi)實現(xiàn)G6TOH催化NADPH再生,向細胞色素P450酶系催化的反應提供所需要的輔酶,改善黑根霉對甾體Cll α -羥基化的能力。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0007]葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)基因在提高黑根霉對留體Cll α -羥基化能力中的應用。
[0008]具體的,所述應用為:構(gòu)建含有G6PDH基因的表達載體,將其導入黑根霉中,篩選陽性克隆,獲得對留體Cll α -羥基化能力提高的基因工程菌。
[0009]具體的,所述G6H)H基因序列如SEQ ID N0.1所示:
[0010]ATGTCGCATGAGGATTATATCCAACGTATCACTCAATATATCAAGGTGCAAGACCCTGAAAAGTTGGAAGCATTCAAACAGATGACATCTTATGTCTCTGGTCAATATGATGAAGATGCCTCTTTCCAAAAGCTGAACGAGGCCATCGAAGCATCTGAAAAGGAAAGAAAGGCCGAAAAGAAAAATCGCGTGTATTATATGGCCCTGCCTCCTTCCGTCTTTATTCCCGTAGCACAAGGATTGAAACGCAATGTGTACACGCCAGAGGGAAGTAACAGGCTGGTGGTCGAGAAACCGTTCGGGATGGACTCTGAATCCTCTGATCATTTAGGTCGTGAATTGGGTGCTCTCTTTACTGAAAATGAGATTTATCGTATTGATCATTATCTCGGTAAAGAGATGGTGAAGAACATCATGAACCTTCGTTTTGCTAATGTCTTACTTGGACATGCCTGGAGTCGTACTTATGTTGATAACGTTCAGATCACGTTCAAGGAACCTTTTGGCACAGAAGGACGGGGTGGTTATTTTGATGAATTTGGCATCATTCGTGATATCATTCAAAACCATTTACTTCAAGTCCTTTCCTTGATTGCTATGGAAAGACCTATCTCTACTGACTCTGAAGCCATTCGTGATGAAAAAGTCAAGGTGTTGAAGTGTATCTCTCCCATTCGTATCGAAGATACCTTGTTGGGTCAAT ATGTTGCTGCTGATGGTAAGCCTGGCTATCTTGAAGATGAAACGCTCAAGAACAAGGACAGTTTGACCCCTACTTTTGCTGCTACTGTTTGTTATGTGAATAATGAACGTTGGGAAGGCGTACCCTTTATCTTGAAGGCAGGTAAGGCCTTGAATGAAGCCAAGGTCGAAGTTCGTCTGCAATTCCACCATGTGGCCGGTAATCTGTTTAGCGGGTCCCCTCGTAATGAGCTCGTCATTCGTATTCAACCCAAAGAGGCTGTGTATTTAAAATTCAACAACAAACAACCTGGTTTGTCCTACGAAACCATTCAGACCGATCTCGACTTGACTTATCACGAACGTTATACTGACCTTGCTATCCCTGACGCTTATGAATCTCTCATCTTGGATGTCTTGCGTAATGATCATTCAAACTTTGTAAGAGATGATGAACTTCAGGCTGCCTGGAAGATCTTTACACCTCTGCTTCACAAGATTGACAAGCATGATTCCGATGTGGATATCAAGACATATGCTTATGGTTCTCGTGGTCCAAAGGAATTGGATGAATTCGTAAAGAAGCATGGTTATCACCGTGATACGAATGGTTACACTTGGCCTGTACAAAATGTAAATCCTTCTTCCAACAAGCTTTAAo
[0011]本發(fā)明還涉及一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因工程菌的構(gòu)建方法,所述方法包括:
[0012](I)從米根霉克隆得到其G6PDH基因,將其與質(zhì)粒PMD19_TSimple連接并轉(zhuǎn)化,得到重組質(zhì)粒 PMD19-TSimple/G6PDH ;
[0013](2)重組質(zhì)粒PMD19-TSimple/G6PDH經(jīng)雙酶切后,與質(zhì)粒PCB1004連接并轉(zhuǎn)化,得到表達載體PCB1004-G6PDH ;
[0014](3)將表達載體?081004_66?0!1溶于溶液4中,使其濃度達到I~5μ g/μ 1,得到質(zhì)粒溶液;溶液A組成如下:50mM CaCl2,0.3M甘露醇,溶劑為IOmM MOPS (ρΗ6.3);
[0015](4)每100 μ L黑根霉原生質(zhì)體溶液加入10 μ L質(zhì)粒溶液和10 μ L PEG溶液,冰上放置30min后,再加入1.25ml PEG溶液,室溫放置30min,得到轉(zhuǎn)化液;所述PEG溶液組成如下:50mM CaCl2,40 ~60% (w/w) PEG4000,溶劑為 IOmM MOPS (ρΗ6.3);
[0016](5)轉(zhuǎn)化液加入至MYG液體再生培養(yǎng)基,28°C靜置培養(yǎng)5~IOh后,所得培養(yǎng)液涂布至MYG固體平板,28°C培養(yǎng)直至出現(xiàn)菌落,轉(zhuǎn)接到含有200~300 μ g/mL潮霉素B的MYG固體平板上,28°C培養(yǎng),篩選具有潮霉素抗性的陽性克隆,提取轉(zhuǎn)化子基因組,進行PCR確定目的基因片段是否整合到黑根霉基因組中,鑒定正確后保存。
[0017]所述MYG液體再生培養(yǎng)基組成如下:麥芽糖5g/L,酵母粉5g/L,葡萄糖10g/L溶劑為水;所述MYG固體平板組成如下:麥芽糖5g/L,酵母粉5g/L,葡萄糖10g/L,瓊脂15g/L,溶劑為水。
[0018]具體的,上述步驟(1)中,所述G6TOH基因序列如SEQ ID N0.1所示。
[0019]本發(fā)明還涉及按照上述方法構(gòu)建并篩選獲得的一株留體Cll α -羥基化較高的菌株——黑根霉(Rhizopus nigericans)PIe,該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,地址:中國,武漢,武漢大學,郵編:430072,保藏編號為=CCTCC No:M2013436,保藏日期為:2013年9月18日。
[0020]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:按照本發(fā)明方法構(gòu)建的基因工程菌,用于轉(zhuǎn)化沃氏氧化物C11 α -羥基化生產(chǎn)霉菌氧化物,相比出發(fā)菌株,生長快,原料利用率高,轉(zhuǎn)化率和轉(zhuǎn)化效率高,在留體藥物的開發(fā)和利用過程中具有深遠的理論意義和較高的應用價值。
(四)【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為米根 霉RNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜;M:DL2000DNA Marker ; Lane 1:米根霉RNA ;
[0022]圖 2 為 PCR 擴增的 G6PDH 基因片段;M:DNA Marker ; Lane I:G6PDH ;
[0023]圖3為TA克隆的轉(zhuǎn)化子菌落PCR ;M:DNA Marker ;Lane 1-5:5個轉(zhuǎn)化子菌落PCR ;
[0024]圖4 為 PMD19-TSimple-G6PDH 質(zhì)粒及酶切驗證;M:DNA Marker ;Lane I ~5:5 個轉(zhuǎn)化子菌落PCR ;
[0025]圖5 為測序結(jié)果比對;M:DNA Marker ;Lane 1:PMD19_T Simple_G6PDH 質(zhì)粒;Lane2:BamH I 單酶切;Lane3:Apa I 單酶切;Lane4:BamH I 和 Apa I 雙酶切;
[0026]圖6為PCB1004-G6PDH真菌整合表達載體構(gòu)建過程;
[0027]圖7為表達載體構(gòu)建中轉(zhuǎn)化子菌落PCR ;M:DNA Marker ; Lane I~5:5個轉(zhuǎn)化子菌落 PCR;
[0028]圖8為表達載體及其雙酶切驗證;M:DNA Marker ; Lane I:PCB1004質(zhì)粒;Lane2:PCB1004-G6PDH質(zhì)粒;Lane3:PCB1004 質(zhì)粒 BamH I 單酶切驗證;Lane4:PCB1004 質(zhì)粒 Apa I單酶切驗證;Lane5:PCB1004 質(zhì)粒 BamH I 和 Apa I 雙酶切驗證;Lane6:PCB1004-G6PDH質(zhì)粒BamH I單酶切驗證;Lane7:PCB1004-G6PDH質(zhì)粒Apa I單酶切驗證;Lane8:PCB1004-G6PDH質(zhì)粒BamH I和Apa I雙酶切驗證;
[0029]圖9為潮霉素抗性篩選的轉(zhuǎn)化子;A:RG3轉(zhuǎn)化子;B:RG12轉(zhuǎn)化子;
[0030]圖10 為出發(fā)菌株和轉(zhuǎn)化子基因組 DNA ;Μ: λ -Hind III digest DNA Marker ; Lane 1:出發(fā)菌株基因組DNA ;Lane2:RG3轉(zhuǎn)化子基因組DNA ;Lane3:RG12轉(zhuǎn)化子基因組DNA ;
[0031]圖 11 為 PCR 鑒定轉(zhuǎn)化子;M:DNA Marker ;Lanel:PCB1004_G6PDH 質(zhì)粒(HPH);Lane2:PCB1004-G6PDH 質(zhì)粒(G6PDH) ;Lane3:3 號轉(zhuǎn)化子基因組 DNA (HPH) ;Lane4:12 號轉(zhuǎn)化子基因組DNA (HPH) ;Lane5:3號轉(zhuǎn)化子基因組DNA (G6TOH) ;Lane6:12號轉(zhuǎn)化子基因組DNA (G6PDH) ;Lane7:純化的HPH片段;Lane8:出發(fā)菌株基因組DNA (HPH) ;Lane9:出發(fā)菌株基因組DNA (G6PDH);
[0032]圖12為底物和產(chǎn)物HPLC分析。
(五)【具體實施方式】
[0033]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述,但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此:
[0034]實施例1:相關引物設計
[0035]根據(jù)已知的米根霉G6DPH基因序列(SEQ ID N0.l^PE.coli潮霉素抗性基因序列(SEQ ID N0.2)設計引物 F-g6pdh/R-g6pdh 和引物 F_hy g/R-hyg (見表 I),引物 F_g6pdh/R-g6pdh兩端分別添加BamH I和Apa I酶切位點,引物F_hyg/R_hyg用于PCR鑒定黑根霉轉(zhuǎn)化子。
[0036]表1:本發(fā)明涉及的引物
[0037]
【權(quán)利要求】
1.葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)基因在提高黑根霉對留體Cllα -羥基化能力中的應用。
2.如權(quán)利要求1所述的應用,其特征在于所述應用為:構(gòu)建含有G6PDH基因的表達載體,將其導入黑根霉中,篩選陽性克隆,獲得對留體Clla-羥基化能力提高的基因工程菌。
3.如權(quán)利要求1或2所述的應用,其特征在于所述G6TOH基因序列如SEQID N0.1所
4.一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因工程菌的構(gòu)建方法,所述方法包括: (1)從米根霉克隆得到其G6PDH基因,將其與質(zhì)粒PMD19-TSimple連接并轉(zhuǎn)化,得到重組質(zhì)粒 PMD19-TSimple/G6PDH ; (2)重組質(zhì)粒PMD19-TSimple/G6PDH經(jīng)雙酶切后,與質(zhì)粒PCB1004連接并轉(zhuǎn)化,得到表達載體 PCBl004-G6PDH ; (3)將表達載體?081004-66?0!1溶于溶液4中,使其濃度達到I~5μg/μ 1,得到質(zhì)粒溶液;溶液A組成如下:50mM CaCl2,0.3M甘露醇,溶劑為IOmM MOPS、pH6.3 ; (4)每100μ L黑根霉原生質(zhì)體溶液加入10 μ L質(zhì)粒溶液和10 μ L PEG溶液,冰上放置.30min后,再加入1.25ml PEG溶液,室溫放置30min,得到轉(zhuǎn)化液;所述PEG溶液組成如下:.50mM CaCl2,40 ~60%PEG4000,溶劑為 IOmM MOPS、pH6.3 ; (5)轉(zhuǎn)化液加入至MYG液體再生培養(yǎng)基,28°C靜置培養(yǎng)5~IOh后,所得培養(yǎng)液涂布至MYG固體平板,28°C培養(yǎng)直至出現(xiàn)菌落,轉(zhuǎn)接到含有200~300 μ g/mL潮霉素B的MYG固體平板上,28°C培養(yǎng),篩選具有潮霉素抗性的陽性克隆,提取轉(zhuǎn)化子基因組,進行PCR確定目的基因片段是否整合到黑根霉基因組中,鑒定正確后保存。
5.如權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于所述G6PDH基因序列如SEQID N0.1所示。
6.一株甾體Clla-羥基化能力提高的黑根霉工程菌一黑根霉(Rhizopusnigericans)PIe,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,地址:中國,武漢,武漢大學,郵編:.430072,保藏編號為=CCTCC No:M2013436,保藏日期為:2013年9月18日。
【文檔編號】C12N15/80GK103627721SQ201310505530
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月22日
【發(fā)明者】陳小龍, 范永仙, 朱廷恒, 薛海龍, 張力偉, 沈寅初 申請人:浙江工業(yè)大學
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