人白細(xì)胞介素-12的編碼基因、真核宿主細(xì)胞和表達(dá)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了人白細(xì)胞介素-12的編碼基因、真核宿主細(xì)胞和表達(dá)方法。具體而言，本發(fā)明的人白細(xì)胞介素-12的編碼基因包含(a)編碼人白細(xì)胞介素-12的P35亞基的核苷酸序列SEQ?ID?NO:9或其互補(bǔ)核苷酸序列以及編碼人白細(xì)胞介素-12的P40亞基的SEQ?ID?NO:10或其互補(bǔ)核苷酸序列；或者(b)編碼人白細(xì)胞介素-12的P35亞基的核苷酸序列SEQ?ID?NO:21或其互補(bǔ)核苷酸序列以及編碼人白細(xì)胞介素-12的P40亞基的SEQ?ID?NO:22或其互補(bǔ)核苷酸序列。本發(fā)明的核苷酸序列能夠使IL-12在真核宿主細(xì)胞，特別是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)中穩(wěn)定高效表達(dá)，尤其是在無(wú)血清條件下穩(wěn)定高效表達(dá)。
【專利說(shuō)明】人白細(xì)胞介素-12的編碼基因、真核宿主細(xì)胞和表達(dá)方法
[0001]本申請(qǐng)是分案申請(qǐng)，其原申請(qǐng)的中國(guó)國(guó)家申請(qǐng)?zhí)枮?01210345021.8，申請(qǐng)日為 2012年9月17日，發(fā)明名稱為“人白細(xì)胞介素-12的編碼基因、真核宿主細(xì)胞和表達(dá)方法”。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及人白細(xì)胞介素-12 (IL-12)的編碼基因、真核宿主細(xì)胞和表達(dá)方法，具體而言，本發(fā)明涉及對(duì)人白細(xì)胞介素-12的編碼基因進(jìn)行優(yōu)化，從而能夠使IL-12在真核宿主細(xì)胞，特別是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CH0細(xì)胞)中穩(wěn)定高效表達(dá)， 尤其是在無(wú)血清條件下穩(wěn)定聞效表達(dá)。 【背景技術(shù)】
[0003]白細(xì)胞介素-12 (IL-12)于1989年和1990由Trinchieri和Gately等發(fā)現(xiàn)，起初命名為NK細(xì)胞刺激因子(NKSF)和細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞成熟因子(CLMF)，1991年統(tǒng)一命名為白介素-12。
[0004]白細(xì)胞介素-12是一種70kDa的異二聚體，由兩條共價(jià)連接的多肽鏈組成，一條為 35kDa (P35亞基)，另一條為40kDa (P40亞基)。P35亞基由多種細(xì)胞產(chǎn)生，包括T、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞和大單核細(xì)胞等，而P40鏈主要由激活的單核細(xì)胞和B細(xì)胞產(chǎn)生，P35和P40 單獨(dú)存在時(shí)均無(wú)任何IL-12的生物活性。
[0005]IL-12具有調(diào)節(jié)和參與免疫應(yīng)答細(xì)胞的活性，刺激NK細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-伽瑪(IFN-Y )，促進(jìn)Thl細(xì)胞的分化，是連接固有免疫和獲得性免疫的核心因子。同時(shí)，
[0006]IL-12可促進(jìn)造血功能的恢復(fù)，用于機(jī)體造血功能的降低導(dǎo)致的疾病，如急性放射病、放射性治療、化學(xué)治療等。另外，IL-12還具有抗腫瘤，抗病毒的效果，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
[0007]在目前報(bào)道的利用真核細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生重組IL-12的方法中，重組IL-12的表達(dá)強(qiáng)度仍不令人滿意。
[0008]以下表1列出了現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)技術(shù)的培養(yǎng)條件和最高產(chǎn)量。
[0009]
【權(quán)利要求】
1.人白細(xì)胞介素-12的編碼基因，其特征在于，所述編碼基因包含: 編碼人白細(xì)胞介素-12的P35亞基的核苷酸序列SEQ ID NO:21或其互補(bǔ)核苷酸序列以及編碼人白細(xì)胞介素-12的P40亞基的SEQ ID NO:22或其互補(bǔ)核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的編碼基因，其特征在于，所述編碼基因包含編碼P35亞基的核苷酸序列SEQ ID N0:21以及編碼P40亞基的SEQ ID N0:22。
3.—種表達(dá)人白細(xì)胞介素-12的真核宿主細(xì)胞，其特征在于，所述真核宿主細(xì)胞包含: 具有編碼P35亞基的核苷酸序列SEQ ID NO:21或其互補(bǔ)核苷酸序列的第一表達(dá)載體和具有編碼P40亞基的核苷酸序列SEQ ID NO:22或其互補(bǔ)核苷酸序列的第二表達(dá)載體。
4.如權(quán)利要求3所述的真核宿主細(xì)胞，其特征在于，所述真核宿主細(xì)胞包含具有編碼P35亞基的核苷酸序列SEQ ID NO: 21的第一表達(dá)載體和具有編碼P40亞基的SEQ ID NO: 22的第二表達(dá)載體。
5.如權(quán)利要求3或4所述的真核宿主細(xì)胞，其特征在于，所述真核宿主細(xì)胞為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，優(yōu)選為CH0-DG44或CH0-3E7細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求3或4所述的真核宿主細(xì)胞，其特征在于，所述第一表達(dá)載體為pGN-35質(zhì)粒。
7.如權(quán)利要求3或4所述的真核宿主細(xì)胞，其特征在于，所述第二表達(dá)載體為PCDNA3.1 質(zhì)粒。
8.一種人白細(xì)胞介素-12的表達(dá)方法，其特征在于，所述方法包括: 分別構(gòu)建包含編碼P35亞基的核苷酸序列SEQ ID NO:21或其互補(bǔ)核苷酸序列的pGN-35質(zhì)粒和包含編碼P40亞基的核苷酸序列SEQ ID NO:22或其互補(bǔ)核苷酸序列的PCDNA3.1 質(zhì)粒； 然后用所述PGN-35質(zhì)粒和所述pCDNA3.1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染真核宿主細(xì)胞，優(yōu)選為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，更優(yōu)選為CH0-DG44或CH0-3E7細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N15/24GK103555734SQ201310507082
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2012年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月17日
【發(fā)明者】趙毅, 李友海, 章方良, 柳振宇 申請(qǐng)人:青島康立泰藥業(yè)有限公司