豬流行性腹瀉病毒的熒光定量pcr引物和探針的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬流行性腹瀉病毒的熒光定量PCR引物和探針，其中上、下游引物如SEQIDNO:1~2所示，探針P1：SEQIDNO:3，探針P2：SEQIDNO:4，且探針1和探針2序列的3’端結(jié)合熒光淬滅基團(tuán)，探針P1和探針P2序列的5’端結(jié)合不同的熒光報(bào)告基團(tuán)。該引物特異性和靈敏度都較高，且能夠檢測(cè)出變異的PEDV，可以對(duì)各種臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)、鑒別，從而可以快捷地對(duì)流行的PEDV毒株進(jìn)行區(qū)分，操作簡(jiǎn)單、實(shí)用。
【專利說(shuō)明】豬流行性腹瀉病毒的熒光定量PCR引物和探針【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種可以區(qū)分變異和經(jīng)典豬流行性腹瀉病毒的雙重?zé)晒舛縋CR引物和探針。
【背景技術(shù)】
[0002]豬流行性腹灣(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由套式病毒目冠狀病毒科、冠狀病毒屬的豬流行性腹?寫病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一種豬腸道傳染病，以水樣腹?寫、嘔吐和脫水為特征(Takahashi K，Okada K，OhshimaK.An outbreak of swine diarrhea of a new type associated with coronavirus-1ikeparticles in Japan[J].Vet Sci, 1983, 45:829-832; Murphy FA, Fauquet C M.smithReport of the ICTV[J], Archives virology suppl, 1995, 10: 407-409.;殷震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[Μ].2版.北京:科學(xué)出版社，1997.681-688.)。各種日齡的豬均可感染，哺乳仔豬、斷奶仔豬的發(fā)病率可達(dá)100%，尤其哺乳仔豬受害最為嚴(yán)重，此病多發(fā)生于寒冷季節(jié)。20世紀(jì)70年代最初發(fā)現(xiàn)于英國(guó)(李連敏，裴愛(ài)民.秋冬季謹(jǐn)防豬流行性腹瀉病[J].南方養(yǎng)豬，2006，209: 44.;林初文，莊金秋，謝印乾.我國(guó)主要豬病毒性腹瀉疾病的特點(diǎn)及其防治對(duì)策[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2007，34 (5): 121-122.)。隨后，許多國(guó)家如比利時(shí)、德國(guó)、加拿大、法國(guó)、日本等國(guó)也都出現(xiàn)了 PED流行的報(bào)道(蔡寶祥.介紹幾種新近發(fā)現(xiàn)的豬傳染病[J].畜牧與獸醫(yī)，1982，5: 218-221.；Pensaert M B, de Bouck P.A newcoronavirus-1ike particle associated with diarrhea in swine[J].Arch Viorl,1978，58:237-243.)，我國(guó)從20世紀(jì)80年代初開始陸續(xù)有本病的流行報(bào)道，并且給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的損失(倪艷秀，林繼煌，何孔旺等.豬流行性腹瀉研究概況〔J].畜牧與獸醫(yī)，2001，33 (I): 38-40.)。
[0003]PEDV屬于冠狀病毒屬I群，是RNA病毒，基因組為單股正鏈，不分節(jié)段?；蚪M包含6個(gè)開放讀框(ORF)，從5’到3’順序依次為ORFl (20346 nt) ；S基因(4152 nt)；0RF3 基因(675 nt)；E 基因(231 nt)；M 基因(681 nt)和 N 基因(1326 nt) (Kocherhanset al., Completion of the porcine epidemic diarrhoea coronavirus (PEDV) genomesequence[J].Virus Genes.2001, 23(2): 13-144.; Brian et al., Coronavirusgenome structure and replication.Curr Top Microbiol Tmmunol.2005, 287:1~30.)。
[0004]目前針對(duì)PEDV的實(shí)驗(yàn)室診斷方法有病原學(xué)方法、基于病毒抗原或抗體的免疫學(xué)方法和針對(duì)病毒RNA核酸檢測(cè)技術(shù)(鄧小紅，呂立新，陶慶園等.豬病毒性腹瀉病的實(shí)驗(yàn)室診斷[J].畜禽業(yè)，2004，165 (I): 49-50.)。傳統(tǒng)的病原學(xué)方法主要通過(guò)細(xì)胞進(jìn)行病毒的分離，耗時(shí)、耗力。用免疫學(xué)檢測(cè)抗體可以了解病毒感染以及疾病發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程，然而，由于抗體只有在病毒感染至一定時(shí)期后才會(huì)出現(xiàn)，因此抗體檢測(cè)在作為快速防控的方法時(shí)存在一定局限性。熒光定量PCR以特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快的諸多優(yōu)點(diǎn)成為分子生物學(xué)研究中的重要工具。[0005]目前，PEDV在中國(guó)大陸仍然存在大規(guī)模發(fā)生的情況，給中國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大損失。有學(xué)者對(duì)此次流行的PEDV毒株以及其基因變異情況進(jìn)行了詳細(xì)的分析(Pan Y et al.，Isolation and characterization of a variant porcine epidemic diarrhea virus inChina [J], Virol J.2012, Sep 12; 9:195.)，發(fā)現(xiàn)變異毒株和經(jīng)典PEDV毒株之間S基因有較大的不同，可以作為區(qū)分兩種毒株的特征基因，但目前還未有針對(duì)此的熒光定量鑒別診斷方法出現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述問(wèn)題，通過(guò)對(duì)豬流行性腹瀉病毒S基因的分析，設(shè)計(jì)引物和兩個(gè)不同報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記的探針(變異PEDV為FAM，經(jīng)典PEDV為HEX)，并建立了熒光定量PCR方法，可以對(duì)變異和經(jīng)典豬流行性腹瀉病毒進(jìn)行快速的鑒別區(qū)分。
[0007]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的:
一種豬流行性腹瀉病毒的熒光定量PCR引物和探針，序列如下:
上游引物 F:GTTCTTTTCAAAATTTAATGTKCAGG (SEQ ID NO:1);
下游引物 R:CTTGCGAAATGCCAATCTCA (SEQ ID NO:2);
探針 Pl:CTTGGTACTGTGCTGGCCAACATCC (SEQ ID N0:3)；
探針 P2:TCTTCTAGCTGGTACTGTGGCACAGGC (SEQ ID N0:4)；
其中，探針I(yè)和探針2序列的3 ’端結(jié)合熒光淬滅基團(tuán)，探針I(yè)和探針2序列的5’端結(jié)合不同的突光報(bào)告基團(tuán)。
[0008]根據(jù)NCBI登陸的豬流行性腹瀉病毒基因組序列，登錄號(hào):變異毒株(JN825712，JX088695, JX188454, JX489155, JX261936, JX112709, JX524137, JQ282909)和經(jīng)典毒株(AF353511，EF185992，Z25483，JQ023161, JN547228)提供的信息，經(jīng)過(guò)比對(duì)分析，設(shè)計(jì)了以上定量PCR的引物和探針，使用上述引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，可以通過(guò)擴(kuò)增曲線鑒別經(jīng)典和變異豬流行性腹瀉病毒，省去測(cè)序的步驟，節(jié)省了時(shí)間和成本。
[0009]提取待檢測(cè)樣品中的RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后使用引物F、R和探針P1、P2進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。如果探針Pl的熒光報(bào)告基團(tuán)有擴(kuò)增曲線出現(xiàn)的即是變異PEDV，探針P2的熒光報(bào)告基團(tuán)有擴(kuò)增曲線出現(xiàn)的即是經(jīng)典PEDV，若是均無(wú)擴(kuò)增曲線產(chǎn)生，則說(shuō)明樣品中不含PEDV0其中擴(kuò)增曲線CT值小于35的判斷為陽(yáng)性，CT值大于35而小于40的判斷為可疑，需重復(fù)試驗(yàn)。第二次CT值仍在這個(gè)范圍的判斷為陽(yáng)性。
[0010]作為優(yōu)選方案，上述豬流行性腹瀉病毒的熒光定量PCR引物和探針，所述熒光淬滅基團(tuán)為TAMRA (6-羧基四甲基羅丹明)。
[0011]作為優(yōu)選方案，上述豬流行性腹瀉病毒的熒光定量PCR引物和探針，所述探針I(yè)序列5’端結(jié)合的突光報(bào)告基團(tuán)為FAM (6-羧基突光素),探針2序列5’端結(jié)合的突光報(bào)告基團(tuán)為HEX (六氯-6-甲基熒光素)。
[0012]本發(fā)明還提供了上述豬流行性腹瀉病毒的熒光定量PCR引物和探針在制備檢測(cè)經(jīng)典豬流行性腹瀉病毒和/或變異豬流行性腹瀉病毒的試劑中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明還提供了一種豬流行性腹瀉病毒的檢測(cè)試劑盒，包括以上所述的豬流行性腹瀉病毒的熒光定量PCR引物和探針。
[0014]一種豬流行性腹瀉病毒的檢測(cè)試劑盒，包括:(O反轉(zhuǎn)錄部分:
RT預(yù)混液1:隨機(jī)引物和dNTP mix (dNTP混合物)；
RT預(yù)混液2:5倍反轉(zhuǎn)錄緩沖液，RNA酶抑制劑，反轉(zhuǎn)錄酶，不含RNA酶的雙蒸水；
(2)熒光定量PCR部分:
預(yù)混酶體系，以上所述的豬流行性腹瀉病毒的熒光定量PCR引物和探針，無(wú)菌雙蒸水。所述的預(yù)混酶體系是指LifeTechnologies公司的產(chǎn)品Universal Master Mix ;所述的5倍反轉(zhuǎn)錄緩沖液是將本領(lǐng)域常用的反轉(zhuǎn)錄緩沖液稀釋5倍得到的，更具體的可以為TaKaRa公司的產(chǎn)品PrimeScirpt Buffer經(jīng)5倍稀釋后得到。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明提供了一組雙重?zé)晒舛縋CR的引物和探針，該引物特異性和靈敏度都較高，且能夠檢測(cè)出變異的PEDV，可以對(duì)各種臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)、鑒別，從而可以快捷地對(duì)流行的PEDV毒株進(jìn)行區(qū)分，操作簡(jiǎn)單、實(shí)用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為本發(fā)明對(duì)樣品擴(kuò)增的曲線，其中箭頭I為變異株，箭頭2為經(jīng)典株；
圖2為本發(fā)明特異性檢驗(yàn)結(jié)果。其中箭頭I為變異株，箭頭2為經(jīng)典株。3-8分別為豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒、豬圓環(huán)病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒；
圖3為檢測(cè)變異株探針靈敏度結(jié)果，1、2、3、4、5代表的拷貝數(shù)分別為3.94X 104、3.94X 103、3.94Χ ΙΟ2』.94Χ1θ\3.94 ；
圖4為檢測(cè)經(jīng)典株探針靈敏度結(jié)果，1、2、3、4、5代表的拷貝數(shù)分別為2.99XlO4,2.99Χ 103、2.99Χ 102、2.99Χ1θ\2.99。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行解釋，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能更好地理解本發(fā)明并能予以實(shí)施，但實(shí)施例并不作為對(duì)本發(fā)明的限定。
[0018]實(shí)施例1
(I)待檢樣品RNA提取:200μ?細(xì)胞培養(yǎng)液(感染自主分離毒株CHGD-OI，該毒株經(jīng)鑒定為變異的PEDV，也可以使用其它變異毒株)、200μ?細(xì)胞培養(yǎng)液(感染自主分離毒株ShQT，該毒株經(jīng)鑒定為經(jīng)典PEDV，也可以使用其它經(jīng)典毒株)、IOOmg的腸道病料和IOOmg糞便(病料和糞便未知是否感染病毒)以及DMEM (細(xì)胞培養(yǎng)基，不含PEDV，為陰性對(duì)照)作為待檢樣品，分別進(jìn)行以下操作:
加入ImL PBS緩沖液進(jìn)行充分研磨，-20°C反復(fù)凍融3次,8000 rpm離心10 min,取上清液200 μ L，加入0.2mL氯仿，震蕩混勻15s后在室溫下(15°C~30°C )放置2~3min后，12000g (2°C~8°C)離心15min ;取上層水相置于新EP管中，加入0.5mL異丙醇，在室溫下(15°C~30°C)放置lOmin，12000g (2V~8°C)離心IOmin ;棄上清，加入ImL 75%乙醇進(jìn)行洗滌，渦旋混合，7500g (2°C~8°C )離心5min，棄上清；讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥后加入20μ? RNase-Free H2O溶解，即為RNA模板。提取的RNA放于_80°C保存。
[0019](2)提取的RNA加入到反轉(zhuǎn)錄預(yù)混反應(yīng)液(RT預(yù)混液)中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA模板。
[0020]反轉(zhuǎn)錄體系及過(guò)程:8 μ L的RNA與2 μ L RT預(yù)混液I混勻，65°C反應(yīng)5min，然后迅速置于冰上2min。此反應(yīng)混合溶液再加入到RT預(yù)混液2中，混勻后置于PCR儀上，按如下條件反應(yīng):30°C IOmin ；42°C 60min ；70°C 15min (無(wú)循環(huán))。
[0021]其中，RT預(yù)混液 1:Ramdom 9 mer (50M-M)和 dNTP mix (IOmM)各 IKL ；RT 預(yù)混液2:5 XPrimeScirpt Buffer 4M-L, RNase Inhibitor (40U/M-L) 0.5M-L, PrimeScript ReverseTranscriptase (200U/M-L) 1M-L, RNase free H2O 4.5ML,均購(gòu)自大連 TaKaRa 公司。
[0022](3)將2 μ L cDNA模板加入到定量PCR預(yù)混液中，配制20μ?反應(yīng)體系，并混合均勻。其中定量PCR預(yù)混液(即預(yù)混酶體系)！Universal Master Mix (AmpliTaq Gold?DNAPolymerase, UP (Ultra Pure) ；Uracil-N glycosylase (UNG) ；dNTPs with dUTP ；R0X ?Passive Reference ；Optimized buffer components)10M-L, ^ [=| Life Technologies 公司；F 和 R (均為 20pmol)各 0.2 μ?，探針 Pl (20pmol)0.1 μ?，探針 P2 (20pmol)0.1 μ?，由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成，Pl的5’端和3’端分別標(biāo)記FAM和TAMRA ；Ρ2的5’端和3’端分別標(biāo)記HEX和TAMRA ;無(wú)菌雙蒸水7.4 μ?,自制。
[0023](4)將步驟(3)的PCR管置于ABI公司7500 Fast定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增條件為:50°C，保持 2min ;95°C，保持 IOmin ;95°C，15s，60°C，lmin，共 40 個(gè)循環(huán)。
[0024](5)結(jié)果判定:報(bào)告基團(tuán)FAM有擴(kuò)增曲線出現(xiàn)的即是變異PEDV，報(bào)告基團(tuán)HEX有擴(kuò)增曲線出現(xiàn)的即是經(jīng)典PEDV，若是均無(wú)擴(kuò)增曲線產(chǎn)生，則說(shuō)明樣品中不含PEDV。其中擴(kuò)增曲線CT值小于35的判斷為陽(yáng)性，CT值大于35而小于40的判斷為可疑，需重復(fù)試驗(yàn)。第二次CT值仍在這個(gè)范圍的判斷為陽(yáng)性。檢測(cè)結(jié)果見表1。
[0025]表1待檢樣品檢測(cè)結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種豬流行性腹瀉病毒的熒光定量PCR引物和探針，其特征在于，序列如下: 上游引物F:SEQ ID NO:1 ； 下游引物R:SEQ ID NO:2 ；
探針 Pl:SEQ ID NO:3 ；
探針 P2:SEQ ID NO:4 ； 其中，探針I(yè)和探針2序列的3’端結(jié)合熒光淬滅基團(tuán)，探針Pl和探針P2序列的5’端結(jié)合不同的突光報(bào)告基團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒的熒光定量PCR引物和探針，其特征在于，所述熒光淬滅基團(tuán)為TAMRA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬流行性腹瀉病毒的熒光定量PCR引物和探針，其特征在于，所述探針Pl序列5’端結(jié)合的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，探針P2序列5’端結(jié)合的熒光報(bào)告基團(tuán)為 HEX。
4.權(quán)利要求1~3任一所述的豬流行性腹瀉病毒的熒光定量PCR引物和探針在制備檢測(cè)經(jīng)典豬流行性腹瀉病毒和/或變異豬流行性腹瀉病毒的試劑中的應(yīng)用。
5.一種豬流行性腹瀉病毒的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1~3任一所述的豬流行性腹瀉病毒的熒光定量PCR引物和探針。
6.一種豬流行性腹瀉病毒的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括: 反轉(zhuǎn)錄部分: RT預(yù)混液1:隨機(jī)引物和dNTP mix ； RT預(yù)混液2:5倍反轉(zhuǎn)錄緩沖液，RNA酶抑制劑，反轉(zhuǎn)錄酶，不含RNA酶的雙蒸水； (2)熒光定量PCR部分: 預(yù)混酶體系，權(quán)利要求1~3任一所述的豬流行性腹瀉病毒的熒光定量PCR引物和探針，無(wú)菌雙蒸水。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103509882SQ201310511288
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2013年10月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月28日
【發(fā)明者】王東東, 宋延華, 周慶豐, 潘永飛, 李春梅, 田小艷, 盧圍, 廖承球 申請(qǐng)人:廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司