一種表達(dá)脂肪酶的黑曲霉菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種黑曲霉突變菌株黑曲霉WLlip1（Aspergillus?Niger?WLlip1），已于2013年10月18日保藏于中國(guó)武漢武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏管理中心，保藏編號(hào)為CCTCC?NO:M2013478。本發(fā)明提供的黑曲霉突變菌株能高效重組表達(dá)脂肪酶，其蛋白表達(dá)量比突變前菌株提高了約40%，其發(fā)酵液的脂肪酶酶活高達(dá)5482U/mL，比突變前提高了78%，且突變后重組表達(dá)的脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)并未因突變發(fā)生變化，最適作用pH均為9.5，最適作用溫度均為35℃。WLlip1突變株重組表達(dá)的脂肪酶對(duì)皮質(zhì)類污垢具有很強(qiáng)的去污效果，因此可廣泛應(yīng)用于洗滌劑領(lǐng)域。
【專利說明】一種表達(dá)脂肪酶的黑曲霉菌株
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種高效重組表達(dá)脂肪酶的黑曲霉突變菌株。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肪酶(E.C.3.1.1.3)又名甘油酯水解酶、三?；视王；饷?，是指水解羧酸甘油三酯中酯鍵的酶。脂肪酶能催化甘油三酯來生成甘油二脂、單甘脂、脂肪酸和甘油。脂肪酶具有催化疏水性的油脂變成水溶性的脂肪酸和甘油的生物功能，在無機(jī)溶劑中能保持高催化活力和極強(qiáng)穩(wěn)定性。另外，脂肪酶對(duì)底物的廣譜性/特殊專一性，賦予了脂肪酶在食品油脂加工工業(yè)、洗滌劑工業(yè)、酯鍵化合物的合成和手性藥物合成等工業(yè)的巨大應(yīng)用價(jià)值。脂肪酶已經(jīng)成為蛋白酶、淀粉酶之后的第三大工業(yè)用酶。
[0003]脂肪酶是生物體內(nèi)一類重要的代謝酶，從催化特性看，它具有高度的化學(xué)選擇性和立體異構(gòu)性，且反應(yīng)不需輔酶，反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少。脂肪酶的另外一個(gè)特征是可以在異相系統(tǒng)(如油、水界面)或有機(jī)相中起作用，在水相中，脂肪酶通常催化水解反應(yīng)的進(jìn)行；而在有機(jī)相中，它卻能催化多種合成反應(yīng):如酯化、酯交換、酯的醇解、酯的酸解等。月旨肪酶的這些特性使其成為在手性化合物合成中重要的生物催化劑，多被用來催化一些酯類合成和轉(zhuǎn)化反應(yīng)，在食品增香、脫脂加工、污水處理及化工產(chǎn)品中有著廣泛的應(yīng)用。然而，目前脂肪酶的生產(chǎn)效率仍然較低且生產(chǎn)成本也較高，因此需要對(duì)現(xiàn)有的脂肪酶的種類及生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)。
[0004]脂肪酶廣泛存在于動(dòng)物組織、植物種子和微生物體中。由于微生物種類多、繁殖快、易發(fā)生遺傳變異，因此微生物來源的脂肪酶比動(dòng)植物來源的脂肪酶具有更廣的作用pH、作用溫度范圍；以及高穩(wěn)定性、高活性和底物專一性。而且微生物脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，適合于工業(yè)化大生產(chǎn)和獲得高純度樣品。已經(jīng)公布的適用于甘油三酯加工的不同來源的脂肪酶有33種，其中18種來自霉菌。但是，用來表達(dá)脂肪酶的重組菌株一直存在表達(dá)效率低下的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，提供了一種黑曲霉突變菌株，所述黑曲霉突變菌株是由構(gòu)建得到的黑曲霉工程菌經(jīng)紫外誘變獲得的，其能大幅度提高脂肪酶的表達(dá)量，且不影響重組脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用效果。
[0006]本發(fā)明首先提供一種黑曲霉重組菌株，所述的重組菌株用于表達(dá)序列為SEQ IDNO:2的脂肪酶；
[0007]所述的黑曲霉重組菌株中轉(zhuǎn)入了攜帶有序列為SEQ ID NO:1的表達(dá)質(zhì)粒；
[0008]本發(fā)明一方面提供了一種黑曲霉突變菌株黑曲霉WLlipl (Aspergillus NigerWLlipl)，已于2013年10月18日保藏于中國(guó)武漢武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏管理中心，保藏編號(hào)為CCTCC N0:M2013478o[0009]本發(fā)明的黑曲霉突變株用于生產(chǎn)脂肪酶。
[0010]本發(fā)明提供的黑曲霉突變菌株能高效重組表達(dá)脂肪酶，其蛋白表達(dá)量比突變前菌株提高了約40%，其發(fā)酵液的脂肪酶酶活高達(dá)5482U/mL，比突變前提高了 78%，且突變后重組表達(dá)的脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)并未因突變發(fā)生變化，最適作用PH均為9.5，最適作用溫度均為35°C。WLlipl突變株重組表達(dá)的脂肪酶對(duì)皮質(zhì)類污垢具有很強(qiáng)的去污效果，因此可廣泛應(yīng)用于洗滌劑領(lǐng)域。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1:黑曲霉XUJ-2菌株發(fā)酵液SDS-PAGE電泳圖；
[0012]其中，箭頭所指32kD附近可以看到清晰的蛋白條帶，即為重組脂肪酶。
[0013]圖2:黑曲霉突變株WLlipl發(fā)酵液SDS-PAGE電泳圖；
[0014]其中，泳道I為對(duì)照組XUJ-2菌株的脂肪酶表達(dá)情況，泳道2為突變株WLlipl的脂肪酶表達(dá)情況；箭頭所指32kD附近可以看到清晰的蛋白條帶，即為重組脂肪酶。
[0015]圖3:顯微鏡下觀察黑曲霉菌株形態(tài)變化；
[0016]其中，A為對(duì)照XUJ-2菌絲形態(tài)，B為突變株WLlipl菌絲形態(tài)。
[0017]圖4:本發(fā)明突變前后黑曲霉菌株發(fā)酵液中脂肪酶相對(duì)酶活-pH變化曲線。
[0018]圖5:本發(fā)明突變前后黑曲霉菌株發(fā)酵液中脂肪酶相對(duì)酶活-溫度變化曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā) 明的方法做進(jìn)一步說明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常可按常規(guī)條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運(yùn)行。本領(lǐng)域相關(guān)的技術(shù)人員可以借助實(shí)施例更好地理解和掌握本發(fā)明。但是，本發(fā)明的保護(hù)和權(quán)利要求范圍不僅限于所提供的具體案例，而應(yīng)包括本領(lǐng)域技術(shù)人員在本說明書基礎(chǔ)上，不需經(jīng)過創(chuàng)造性勞動(dòng)就能擴(kuò)展的保護(hù)范圍。
[0020]實(shí)施例1:重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0021]根據(jù)NCBI公布的脂肪酶基因序列SEQ ID NO:1 (GeneBank AF054513)，在其起始密碼子ATG前增加9個(gè)堿基CTTAAGAGG(下劃線所示為AflII酶切位點(diǎn))，在其終止密碼子TGA后增加AGGTCTAGA(下劃線所示為XbaI酶切位點(diǎn))，然后將此序列交由上海生工根據(jù)黑曲霉密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化,并由上海生工合成。
[0022]用限制性內(nèi)切酶AfIII和XbaI (Fermentas)對(duì)脂肪酶基因進(jìn)行酶切；同時(shí)，用限制性內(nèi)切酶AflII和XbaI對(duì)質(zhì)粒pGm進(jìn)行酶切。使用凝膠純化試劑盒將酶切產(chǎn)物純化，并用T4DNA連接酶(Fermentas)將上述兩個(gè)酶切產(chǎn)物連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)Trans5 α大腸桿菌(Transgen),用氨節(jié)青霉素進(jìn)行選擇。為確保準(zhǔn)確,對(duì)若干克隆進(jìn)行測(cè)序(Invitrogen)。
[0023]使用質(zhì)粒小量制備試劑盒(Axygen)從測(cè)序結(jié)果正確的大腸桿菌克隆中純化質(zhì)粒。獲得I個(gè)重組質(zhì)粒，測(cè)序結(jié)果顯示獲得的DNA序列為SEQ ID NO: 1，其編碼的蛋白序列為SEQ ID Ν0:2。從而說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pGm-Lip。
[0024]實(shí)施例2:黑曲霉工程菌株的構(gòu)建
[0025]吸取黑曲霉Gl孢子懸浮液于CMA平板，待菌落長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿，切1/4大小的培養(yǎng)基于200mL CMA液體培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm下培養(yǎng)14~16h。
[0026]用無菌Miracloth濾布收集菌絲體,并用溶液A清洗一次,在無菌條件下將清洗過的菌絲體轉(zhuǎn)移到40mL原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化溶液中，在30°C、200rpm的條件下溫浴I~2h,用顯微鏡觀察原生質(zhì)體。
[0027]用無菌Miracloth濾布過濾上述溫浴液體，所得濾液即為原生質(zhì)體溶液。將原生質(zhì)體溶液分裝于兩個(gè)50mL無菌的一次性離心管中，并將每管的體積用溶液B定容至45mL,在4000rpm條件下離心8min以獲得沉淀并棄去上清液。用20mL溶液B再清洗沉淀兩次。將沉淀重懸浮于IOmL溶液B中，并用血球計(jì)數(shù)板對(duì)原生質(zhì)體計(jì)數(shù)。將原生質(zhì)體再次離心并棄去上清液，根據(jù)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)結(jié)果，加入適量溶液B重懸沉淀，使得原生質(zhì)體數(shù)目在I X IO7 個(gè)/mL。
[0028]在冰上，將100 μ L上述原生質(zhì)體溶液加入預(yù)冷的無菌15mL離心管中，每個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)用I管，再加入10 μ g重組質(zhì)粒pGm-Lip, 12.5 μ L溶液C,溫和混勻后再冰上放置20min。
[0029]將麗SA頂層瓊脂試管熔化并保持在55°C。從冰中移出上述15mL離心管，并向管中加入ImL溶液C和2mL溶液B，溫和混勻各管，所得混合物即為原生質(zhì)體混合物。向3個(gè)頂層瓊脂試管中的每一個(gè)中加入ImL上述原生質(zhì)體混合物，并立即傾倒與MMSA平板上，并將平板在30°C下培養(yǎng)7~10d。
[0030]溶液A:2.5mLlM K2HPO4, 2.5mLIM KH2PO4,48.156g MgSO4，加入 dlH20 至終體積500mL,用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0031]溶液B:5mLlM Tris (pH7.5),2.77g CaCl2,109.32g 山梨醇，加入 dlH20 至終體積500mL,用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0032]溶液C:250g PEG4000,2.77g CaCl2, 5mLlM Tris (ρΗ7.5)，加入 dlH20 至終體積500mL,用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
`[0033]CMA培養(yǎng)基:20g葡萄糖，20g麥芽浸出物，Ig蛋白胨，15g瓊脂，加入dlH20至終體積1000mL,高壓蒸氣滅菌。
[0034]實(shí)施例3:黑曲霉工程菌株驗(yàn)證
[0035]將培養(yǎng)IOd后的轉(zhuǎn)化子接種于30mL TSB發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C，200rpm的條件下培養(yǎng)5d ; 14000 X g，離心lOmin，收集上清液；SDS_PAGE電泳驗(yàn)證脂肪酶基因是否表達(dá)。結(jié)果如圖1所示，在32kD附近可以看到清晰蛋白條帶，說明黑曲霉工程菌株構(gòu)建成功，命名為黑曲霉 XUJ-2 (Aspergillus niger XUJ-2)。
[0036]實(shí)施例4:黑曲霉工程菌株XUJ-2誘變篩選
[0037]將黑曲霉工程菌株XUJ-2接種于CMA斜面，30°C培養(yǎng)3_4d，使用0.l%Tween-80洗孢子懸浮液，稀釋至6 X IO6個(gè)/mL，紫外燈(40W)照射2_10min，距離約22cm，致死率達(dá)到90%以上，涂布平板。30°C培養(yǎng)40h。
[0038]實(shí)施例5:黑曲霉突變株驗(yàn)證及酶活測(cè)定
[0039]挑選小菌落按照實(shí)施例2所述方法進(jìn)行發(fā)酵，以XUJ-2菌株為對(duì)照。SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果如圖2所示，與突變前的XUJ-2菌株相比，突變后的菌株中重組脂肪酶的表達(dá)量明顯增加，將該突變菌株命名為黑曲霉WLlipKAspergillus niger
WLlipDo
[0040]采用考馬斯亮藍(lán)方法檢測(cè)上述菌株中的蛋白含量，對(duì)照組XUJ-2菌株中蛋白含量為1.19g/L，而突變株WLlipl菌株中蛋白含量為1.79g/L，比突變前蛋白表達(dá)量提高約40%。
[0041]根據(jù)《GB/T23535脂肪酶制劑》所述方法檢測(cè)黑曲霉發(fā)酵液酶活。結(jié)果顯示，對(duì)照組XUJ-2菌株發(fā)酵液酶活為3083U/mL，而突變株WLlipl的發(fā)酵液酶活高達(dá)5482U/mL，比突變前提高了約78%。結(jié)果表明同樣的發(fā)酵條件下，突變株WLlipl中目的脂肪酶的表達(dá)量明顯提聞。
[0042]將上述突變菌株黑曲霉WLlipl (Aspergillus Niger WLlipl)于 2013 年 10月18日保藏于中國(guó)武漢武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏管理中心，菌株編號(hào)為CCTCCN0:M2013478。
[0043]實(shí)施例6:黑曲霉突變株重組表達(dá)脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)與菌絲形態(tài)分析
[0044]1、最適作用pH值
[0045]分別配制pH值為7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖
液。將黑曲霉XUJ-2和WLlipl的發(fā)酵液分別用上述緩沖液稀釋至合適的濃度，然后按照GB/T23535所述方法測(cè)定發(fā)酵液中重組脂肪酶的酶活力。以發(fā)酵液原始酶活為100%，計(jì)算不同pH條件下重組脂肪酶的相對(duì)酶活。結(jié)果如圖4所示，黑曲霉XUJ-2和WLlipl發(fā)酵液中重組脂肪酶相對(duì)酶活-pH變化曲線相同，最適作用pH均為9.5。
[0046]2、最適作用溫度
[0047]將黑曲霉XUJ-2和WLlipl的發(fā)酵液用上述pH9.5的緩沖液稀釋至合適的濃度，按照制造商的說明書，分別在25°C、30 V、35°C、40 V、45°C、50 V、55°C、60 V條件下，按照GB/T23535所述方法測(cè)定發(fā)酵液中脂肪酶的酶活力。以發(fā)酵液原始酶活為100%，計(jì)算不同溫度條件下重組脂肪酶的相對(duì)酶活。結(jié)果如圖5所示，黑曲霉XUJ-2和WLlipl發(fā)酵液中重組脂肪酶相對(duì)酶活-溫度變化曲線相同，其最適作用溫度均為35°C。
[0048]綜上所述，突變后的黑曲霉重組表達(dá)的脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)與突變前相同，最適作用pH均為9.5，最適作用溫度均為35°C。
[0049]3、黑曲霉菌絲形態(tài)變化
[0050]通過顯微鏡觀察黑曲霉XUJ-2和WLlipl的菌絲形態(tài)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照菌XUJ-2相比，突變株WLlipl的菌絲分支較多，并且明顯變短，突變株的這種菌絲形態(tài)更有利于后期進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)。
[0051]實(shí)施例7:重組脂肪酶在洗滌劑中的應(yīng)用測(cè)試
[0052]對(duì)比測(cè)試加與不加XUJ-2、WLlipl菌株重組表達(dá)脂肪酶的洗衣液對(duì)國(guó)標(biāo)皮脂污布(JB-03)的去污效果。
[0053]1、實(shí)驗(yàn)方法:參照GB/T13174-2008《衣料用洗滌劑去污力及循環(huán)洗滌性能的測(cè)定》中的方法進(jìn)行。
[0054]2、脂肪酶測(cè)試樣品:
[0055]I)脂肪酶XUJ-2，為本發(fā)明構(gòu)建的黑曲霉工程菌XUJ-2重組表達(dá)的脂肪酶，酶活10000U/mL ；
[0056]2)脂肪酶WLlipl，為黑曲霉突變株WLlipl重組表達(dá)的脂肪酶，酶活10000U/mL。
[0057]3、實(shí)驗(yàn)條件:
[0058]洗滌設(shè)備:RHQL-1II型立式去污機(jī)(中國(guó)日用化學(xué)工業(yè)研究院)
[0059]轉(zhuǎn)速:120轉(zhuǎn)/分[0060]洗滌試驗(yàn)溫度:分別為30oC (國(guó)標(biāo)洗滌溫度)
[0061]洗滌實(shí)驗(yàn)水硬度:250ppm(Ca27Mg2+=3/2)
[0062]浸泡/洗滌時(shí)間:放污布前預(yù)先溶解20分鐘/洗滌時(shí)間20分鐘
[0063]白度計(jì)型號(hào):WSD_3C (北京康光儀器有限公司)
[0064]R457藍(lán)光白度:Wr (不含熒光白度)
[0065]污布種類JB-03 (國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T13174-2008附錄D)
[0066]4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
【權(quán)利要求】
1.一種黑曲霉重組菌株，所述的重組菌株用于表達(dá)序列為SEQ ID N0:2的脂肪酶。
2.如權(quán)利要求1所述的黑曲霉重組菌株，其特征在于，所述的黑曲霉重組菌株中轉(zhuǎn)入了攜帶有序列為SEQ ID NO:1的表達(dá)質(zhì)粒。
3.一種黑曲霉突變菌株，所述的突變菌株是由權(quán)利要求1所述的重組菌株突變獲得的。
4.如權(quán)利要求3所述的黑曲霉突變菌株，其保藏編號(hào)為CCTCCN0:M2013478。
5.權(quán)利要求4所述的黑曲霉突變菌株在生產(chǎn)序列為SEQID N0:2的脂肪酶中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/15GK103555596SQ201310512640
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年10月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月25日
【發(fā)明者】王華明, 徐娟, 閆真, 黃亦鈞 申請(qǐng)人:青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司