Tert啟動子的單核苷酸多態(tài)性序列的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明TERT啟動子的單核苷酸多態(tài)性序列，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。所述單核苷酸多態(tài)性序列為：TERT啟動子chr5,1,295,228位為C或T的堿基多態(tài)性序列；TERT啟動子chr5,1,295,242-1,295,243位為CC或TT的堿基多態(tài)性序列；TERT啟動子chr5,1,295,250位為C或T的堿基多態(tài)性序列。本發(fā)明的優(yōu)點在于首次在泌尿系腫瘤中發(fā)現(xiàn)TERT啟動子的高頻突變，為泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤預后和監(jiān)測的提供一種新的生物標志物。
【專利說明】TERT啟動子的單核苷酸多態(tài)性序列
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及TERT啟動子的單核苷酸多態(tài)性序列。
_2] 【背景技術(shù)】
膀胱癌是排在第九位的全球最常見的腫瘤。2013年，在美國有超過73000名患者被診斷為膀胱癌，其中死亡人數(shù)約15000人。其中超過90%的患者最初診斷為原發(fā)性膀胱癌，大約75%的患者目前為表淺膀胱腫瘤，20%的為浸潤性膀胱腫瘤，剩下的5%初診為轉(zhuǎn)移性腫瘤。先前的研究表明，膀胱癌有著多變的臨床表現(xiàn)和遺傳背景。最近的膀胱腫瘤研究報道了 8 個相關(guān)基因(UTX, MLL-MLL3, CREBBP-EP300，NCORl，ARID1A, CHD6)。
[0003]目前檢測“膀胱癌” 采用的腫瘤標記物主要有以下幾種，但是各腫瘤標志物都存在不同的缺點:
(1)、膀胱腫瘤抗原(BTA):BTA試劑分為BTA stat和BTA test兩種；首先，這兩種試劑都不能獨立用于確診膀胱癌；另外，BTA試劑價格昂貴，目前尚難以全面推廣使用；
(2)、LewisX抗原檢測:Lewis X是一種ABO血型相關(guān)抗原，在正常尿路上皮中不存在該抗原；而5%~89%的移行細胞癌可檢出Lewis X,但Lewis X與腫瘤的分級無關(guān)；
(3)、核基質(zhì)蛋白22(nuclear matrix protein22,NMP22):NMP22是核有絲分裂器蛋白，診斷膀胱癌的敏感性為48%~90%，特異性為70%~92%，NMP22對高級，高期膀胱癌敏感性較高；
(4)、纖維蛋白/纖維蛋白降解產(chǎn)物(fibrindegradation products, FDP):用快速免疫檢測法測定尿中FDP診斷膀胱癌的敏感性為68%，對T2~T4期膀胱癌的敏感性更是高達100% ；
(5)、玻璃酸酶檢測hyaluronidase,HAase:玻璃酸酶是一種細胞外降解基質(zhì)透明質(zhì)酸的內(nèi)源性糖苷酶，在腫瘤進展中起重要作用，應用凝膠技術(shù)檢測G2，G3級膀胱癌尿液中玻璃酸酶活性，敏感性達92%~100% ；
(6)、端粒酶活性(telomerase):端粒是位于染色體末端的保護性結(jié)構(gòu)，隨細胞分裂逐步縮短，直至細胞死亡，端粒酶的作用就是延長端粒，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細胞中端粒酶活性增強，該法診斷包括低級，低期腫瘤在內(nèi)的膀胱癌，敏感性可達91%。
[0004]然而，導致膀胱腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵點仍未完全闡明，同時由于這些個體標記的靈敏性較低以至于未被應用于臨床實踐中，這表明需要新的靈敏性高的生物標記。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]在本發(fā)明的試驗過程中，在超過85%的人類腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT, TERT通過Human Genome Browser獲取NCBI發(fā)布版本37的人類基因組序列:Feb.2009 (GRCh37/hgl9 ) ；>hgl9_ensGene_ENST00000310581_0 range=chr5:1295163-
1296562 5’pad=400 3’pad=0 strand=- repeatMasking=none)活躍，我們認為是一個人類腫瘤發(fā)生的重要機制。TERT是端粒酶的催化部分，位于5號染色體短臂，在人類腫瘤中調(diào)節(jié)端粒酶活性。最近人們應用全基因組測序在黑素瘤中發(fā)現(xiàn)TERT啟動子突變。人們在一些膀胱癌樣本中證實了高頻率的TERT啟動子突變。一些研究發(fā)現(xiàn)，具有活性的端粒酶或TERT表達增加與腫瘤的病理分期以及臨床分期是相關(guān)聯(lián)的。然而，人們還未獲得TERT基因拷貝，TERT的表達或活性對膀胱癌的臨床影響仍然是有爭議的。在本發(fā)明中，我們通過試驗得到TERT啟動子的高頻突變位點，并進行了相關(guān)的體外功能分析試驗來證實:這些啟動子的突變可提高ETRT活性，是導致惡性腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵點所在，這些突變對泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的診斷和預后具有重要的意義。
[0006]本發(fā)明的目的在于公開了一種TERT啟動子的單核苷酸多態(tài)性序列。
[0007]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
一種TERT啟動子的單核苷酸多態(tài)性序列，其中，單核苷酸多態(tài)性序列為:
TERT啟動子chr5, I, 295，228位為C或T(即反鏈第chr5, I, 295，228位為G或A)的堿基多態(tài)性序列；
TERT 啟動子 chr5, 1，295，242-1，295，243 位為 CC 或 TT (即反鏈第chr5, I, 295，242-1，295，243位為GG或AA)的堿基多態(tài)性序列；
TERT啟動子chr5，1，295，250位為C或T (即反鏈第chr5，1，295，250位為G或A)的堿
基多態(tài)性序列。
[0008]本發(fā)明具有以下有益效果:
1、本發(fā)明為檢測膀胱癌提供一種新的腫瘤標志物，對發(fā)現(xiàn)膀胱癌及其相關(guān)疾病的易感人群和基因診斷有重要價值；
2、本發(fā)明中的TERT啟動子的高頻突變可能膀胱癌發(fā)生的關(guān)鍵點所在，對探索膀胱癌等疾病的發(fā)病機制有重要意義；
3、本發(fā)明為臨床生物治療提供了分子靶向，同時也開辟新的治療途徑起到重要作用。
[0009]【專利附圖】

【附圖說明】:
1、圖1為通過ABI3730 XL測序儀對PCR產(chǎn)物進行sanger測序得到的反鏈上體細胞突變位點；
2、圖2為PCR(RT-PCR)對TERT表達的分析結(jié)果，其中WT為野生型、C228T為正鏈chr5，I, 295，228C>T 突變和 C250T 為正鏈 chr5, I, 295，250 OT ；
3、圖3為蛋白免疫印記技術(shù)檢測TERT的表達分析結(jié)果，其中WT為野生型、C228T為正鏈 chr5, 1，295，228C>T 突變和 C250T 為正鏈 chr5, I, 295, 250 OT ；
4、圖4為染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)試驗檢測TERT表達分析結(jié)果，其中WT為野生型、C228T 為正鏈 chr5, 1，295，228C>T 突變和 C250T 為正鏈 chr5, I, 295, 250 OT ；
5、圖5為劃痕愈合實驗檢測TERT啟動子突變對膀胱癌細胞的侵襲能力的結(jié)果，其中WT為野生型、C228T 為正鏈 chr5, 1，295，228C>T 突變和 C250T 為正鏈 chr5, I, 295, 250 OT0
[0010]【具體實施方式】:
為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合具體試驗例對本發(fā)明一種TERT啟動子的單核苷酸多態(tài)性序列作進一步的說明。
[0011]試驗例1:一種TERT啟動子的單核苷酸多態(tài)性序列:
一、樣本來源及選擇標準:
用中國泌尿生殖系統(tǒng)癌癥基因組學協(xié)會(UCGC)會員機構(gòu)新診斷的泌尿系統(tǒng)癌癥病人的腫瘤組織作為實驗組，同時用患者的外周血或形態(tài)正常膀胱組織作為對照組。所有標本收集后用液氮快速冷凍并立即存儲在_80°C的環(huán)境中以用于更遠研究。由兩個獨立的病理學家在顯微鏡下評估由蘇木精-伊紅(HE)染色制備的癌組織切片。在本研究中，僅有腫瘤細胞超過80%的腫瘤組織被用來提取DNA和進行隨后的測序。目前研究中總共有302位泌尿生殖系腫瘤患者參與測序，包括216名膀胱癌患者，11名腎盂癌患者，24名腎細胞癌患者，21名腎上腺腫瘤患者，17名睪丸癌患者及13名前列腺癌患者。[0012]樣本的選擇標準:1、所有患者(302例)在術(shù)前都未經(jīng)放療或化療；2、患者都是由中山腫瘤中心確診的；3、樣本組織都是新鮮組織，切下后30分鐘內(nèi)放入RNAlater中，并在4° C冷藏過夜，其后-80° C低溫儲存；4、經(jīng)HE染色，腫瘤細胞超過80%的腫瘤組織；5、正常托腎組織在病理學檢查中顯示正常的腎小管和腎小球且無腫瘤細胞污染；6、年齡大于18歲。
[0013]二、主要試劑和儀器
QIAamp DNA Mini Kits (試劑盒、希爾登，德國)；Dual 96-well GeneAmp PCRSystem 9700(美國，Life Technologies公司)；ABI 3730 XL測序儀(美國應用生物系統(tǒng)公司);TAKARATaqTM Hot Start (試劑盒、大連寶生物工程有限公司)。
[0014]三、操作步驟:
(一)、按照QIAamp DNA Mini Kits試劑盒中說明書的步驟對302例樣本(癌癥患者的腫瘤組織作為實驗組，同時用患者的外周血或形態(tài)正常膀胱組織作為對照組)中的DNA進行提取:
1、切割組織樣品，確定組織的數(shù)量，對于樣本組織的取材應在25mg以內(nèi)。DNA產(chǎn)量與組織類型和大小有關(guān)，一般來說Img組織可得到大約0.2-1.2 μ g的DNA。
[0015]2、將切割下來的組織樣品切碎(step2a),研磨(step2b):
2a.將約25毫克的組織樣品切成小塊。放入一個1.5ml離心管，并添加180 μ I Buffer
ATL。
[0016]2b.在將組織樣品置于液氮中，研磨磨徹底后倒入到1.5ml離心管。加入180 μ IBuffer ATL0此過程中，液氮可以揮發(fā)，但組織不能融化。
[0017]3、加入20μ1 proteinase K,振蕩處理20s, 56°C水浴至組織完全裂解。
[0018]注:proteinase K必須使用，因為QIAGEN Protease在Buffer ATL存在的情況下活性已降低。裂解時間視組織塊大小而定，通常l_3h即可完全裂解。過夜處理是合理的，無不良影響。為保證裂解效率，應使用振蕩水浴或者振蕩臺。
[0019]4、1.5毫升微型離心機短時離心，以去除離心管蓋內(nèi)沿液體。
[0020]5、加入200 μ I Buffer AL，振蕩15S，70°C水浴lOmin。1.5毫升微型離心機短時離心，以去除離心管蓋內(nèi)沿液體。
[0021]加入Butter AL后，可能會產(chǎn)生白色沉淀物，70°C水浴中大都可以溶解。這些沉淀物對于抽提過程和后續(xù)實驗沒有影響。
[0022]6、加入200 μ I乙醇(濃度為96%_100%)，振蕩15s，1.5毫升微型離心機短時離心，
以去除離心管蓋內(nèi)沿液體。加入乙醇后，可能會產(chǎn)生白色沉淀物。這些沉淀物對于抽提過程和后續(xù)實驗沒有影響。
[0023]7、仔細的將以上所得混合液(包括沉淀物)小心加入到QIAamp Mini spincolumn中，將離心柱放入2ml收集管中。蓋緊離心管蓋，以6000X g(8000rpm)離心lmin。將離心管取出，放入一支潔凈的2ml收集管中(試劑盒提供)，丟棄舊的收集管與濾液。6000 Xg (8000rpm)離心是為了減少噪音，最大速度離心不影響DNA產(chǎn)量和純度。務必使所有溶液進入到收集管，如沒有，則需再次以更高速度離心直至所有溶液進入收集管。
[0024]8、小心加入 500 μ I Buffer AWl 到 QIAamp Mini spin column 中，蓋緊離心管蓋，以6000Xg(8000rpm)離心lmin。將離心管取出，放入一支潔凈的2ml收集管中(試劑盒提供)。丟棄收集管及其中的慮液。
[0025]9、小心加入 500μ1 Buffer AW2 到 QIAamp Mini spin column 中；蓋緊離心管蓋，以 20000 X g (14000rpm)離心 3min。
[0026]10、將QIAamp Mini spin column置入一支新的2ml收集管中(自備)，丟棄舊的收集管與濾液。全速離心lmin。此步是為了防止Buffer AW2殘留。
[0027]11、將QIAamp Mini spin column置入一支潔凈1.5ml收集管中(自備)，丟棄舊的收集管與濾液。小心在QIAamp Mini spin column中加入200 μ I Buffer AE或蒸懼水。室溫下靜置 lmin,6000Xg(8000rpm)離心 lmin。
[0028]12、重復step 11之離心操作。將收集管蓋好，保存于_20°C，此時收集管中為腫瘤和正常對照的DNA。
[0029](二)、PCR 引物設(shè)計:
針對TERT核心啟動子序列設(shè)計引物,用primer5.0設(shè)計引物:
TF: 5， -CAGCGCTGCCTGAAACTC-3，；
TR: 5’ -GTCCTGCCCCTTCACCTT-3’。
[0030](三)、進行PCR擴增:利用Dual96-well GeneAmp PCR System 9700 (美國，LifeTechnologies公司)PCR擴增儀,用步驟(二)中相同的引物擴增從步驟(一)中獲得的DNA模板，.按照TAKARATaqTM Hot Start PCR試劑盒的說明書要求擴增出啟動子片斷:
(1)、按表1中的組份配制PCR反應體系(在冰上進行反應體系的配制)。
[0031]表1PCR反應體系
【權(quán)利要求】
1.一種TERT啟動子的單核苷酸多態(tài)性序列，其特征在于，單核苷酸多態(tài)性序列為:TERT啟動子chr5，I, 295，228位為C或T的堿基多態(tài)性序列；TERT啟動子chr5，I, 295，242-1，295，243位為CC或TT的堿基多態(tài)性序列；TERT啟動子chr5，I, 295，250位為C或T的堿基多態(tài)性序列。
【文檔編號】C12Q1/68GK103540589SQ201310512895
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月28日
【發(fā)明者】蔡志明, 吳松, 黃毅, 王波, 張蒙, 楊雷 申請人:深圳市第二人民醫(yī)院