miR-126轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了miR-126轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株的制備方法，包括以下步驟：①親代細(xì)胞培養(yǎng)：人卵巢粘液性囊腺癌細(xì)胞株SKOV3進(jìn)行傳代培養(yǎng)；②miR-126準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染：利用慢病毒技術(shù)，取步驟①所得的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKOV3細(xì)胞，接種于6cm培養(yǎng)皿，加2ml全培養(yǎng)基培養(yǎng)，24小時(shí)后待細(xì)胞長(zhǎng)至80％～90％融合時(shí)，用2ml無(wú)血清培養(yǎng)基洗細(xì)胞一次，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染；③設(shè)置轉(zhuǎn)染miR-126過(guò)表達(dá)組。轉(zhuǎn)染miR-126過(guò)表達(dá)組具有如下用途：觀察miR-126轉(zhuǎn)染后卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的變化；研究miR-126在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中的作用，尋找卵巢癌臨床治療的新靶點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】miR-126轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種選擇人卵巢癌細(xì)胞株SK0V3為親代細(xì)胞，利用慢病毒載體制備miR-126轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤，現(xiàn)多數(shù)已經(jīng)處于晚期階段，已廣泛轉(zhuǎn)移至腹腔、盆腔臟器，手術(shù)、化療、放療只是最大限度延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，就現(xiàn)在的醫(yī)療發(fā)展水平來(lái)說(shuō)很難徹底治愈。由于卵巢癌惡性程度和復(fù)發(fā)率均較高，再加上容易發(fā)生耐藥，其5年生存率只有20%左右。因此，研究卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制并找尋其治療的靶點(diǎn)是臨床所迫切需要的。MicroRNA在腫瘤發(fā)生過(guò)程中起著十分重要的作用,miR-126是microRNA家族中的一員，有大量文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)miR-126與肺癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤密切相關(guān)，但其在卵巢癌中的表達(dá)及作用尚不明確。
[0003]我們期望能制備一種miR-126轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株，以期觀察miR-126轉(zhuǎn)染后卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的變化，及其對(duì)卵巢癌耐藥的影響，進(jìn)一步研究miR-126在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中的作用，尋找卵巢癌臨床治療的有效途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種miR-126轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株的制備方法。
[0005]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種miR-126轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株的制備方法，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒序列為: [0006]①LV3-has-miR-126 序列(5，to3，):TCGTACCGTGAGTAATAATGCG,
[0007]②LV3-has-miR-126inhibitor 序列(5，to3，):CGCATTATTACTCACGGTACGA,
[0008]③LV3NC 序列(5，to3，):TTCTCCGAACGTGTCACGT?
[0009]作為本發(fā)明的miR-126轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株制備方法的改進(jìn)，依次包括以下步驟:
[0010]①、親代細(xì)胞培養(yǎng):
[0011]人卵巢粘液性囊腺癌細(xì)胞株SK0V3，在37°C，體積比5% CO2條件下培養(yǎng)于含10%FBS、l%Ant1-Anti的DMEM高糖培養(yǎng)液中，然后用含0.25%胰酶和0.02%EDTA的PBS消化、傳代，2~3天傳代I次；
[0012]②、miR-126準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染:
[0013]利用慢病毒技術(shù)，取步驟①所得的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SK0V3細(xì)胞，接種于6cm培養(yǎng)皿，每孔細(xì)胞數(shù)為3 X IO5個(gè)，加2ml全培養(yǎng)基培養(yǎng)，24小時(shí)后待細(xì)胞長(zhǎng)至80%~90 %融合時(shí)，用2ml無(wú)血清培養(yǎng)基洗細(xì)胞一次，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染；
[0014]所述全培養(yǎng)基為:FBS與DMEM高糖培養(yǎng)液按照1:9的體積比混合而得；
[0015]所述無(wú)血清培養(yǎng)基為:DMEM高糖培養(yǎng)液；
[0016]③實(shí)驗(yàn)分組及處理；[0017]轉(zhuǎn)染miR-126 過(guò)表達(dá)組(SK0V3/LV3-has_miR-126 組):
[0018]Iml DMEM 高糖培養(yǎng)液+45ul LV3-has_miR-126 慢病毒原液(濃度為 I X IO8 個(gè)/ml)+lul5ug/ul polybrene。
[0019]作為本發(fā)明的miR-126轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟③的實(shí)驗(yàn)分組還包括以下組別:
[0020]轉(zhuǎn)染miR-126 抑制表達(dá)組(SK0V3/LV3-has_miR-126inhibitor 組):
[0021]Iml DMEM 高糖培養(yǎng)液+45ul LV3-has_miR-126inhibitor 慢毒原液(濃度為 I X IO8個(gè)/ml)+lul5ug/ul polybrene ；
[0022]轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組(SK0V3/LV3NC組):
[0023]Iml DMEM高糖培養(yǎng)液+45ul LV3NC慢病毒原液(濃度為I X IO8個(gè)/ml)+lul5ug/ulpolybrene ；
[0024]空白對(duì)照組(NC):
[0025]Iml DMEM 高糖培養(yǎng)液+45ul 培養(yǎng)基+lul5ug/ul polybrene。
[0026]作為本發(fā)明的miR-126轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)，對(duì)上述SK0V3/LV3-has-miR-126 組、SK0V3/LV3-has-miR-126inhibitor 組、SK0V3/LV3NC 組、空白對(duì)照組分別進(jìn)行以下操作:
[0027]每組中加入步驟2)所得的準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染的SK0V3細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)的MOI值為15 ;混合均勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)，然后更換`成全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h后，取出培養(yǎng)皿，直接在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察、細(xì)胞計(jì)數(shù)并拍照，隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算有綠色熒光的細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的百分比，即為轉(zhuǎn)染效率。
[0028]作為本發(fā)明的miR-126轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株制備方法的進(jìn)一步改進(jìn):miR_126轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株(SK0V3/LV3-has-miR-126組)具有以下特征:
[0029]①miR-126轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株，狹長(zhǎng)的細(xì)胞減少，細(xì)胞骨架增加，片狀偽足減少，這均有利于抑制腫瘤細(xì)胞的遷移；
[0030]②miR-126轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株S期增殖指數(shù)降低；
[0031]③侵過(guò)基質(zhì)膠的穿膜細(xì)胞數(shù)減少。
[0032]本發(fā)明是涉及一種選擇人卵巢癌細(xì)胞株SK0V3為親代細(xì)胞，利用慢病毒載體制備miR-126轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株的培養(yǎng)方法。
[0033]采用本發(fā)明的方法制備而得的轉(zhuǎn)染miR-126過(guò)表達(dá)組(SK0V3/LV3-has_miR-126組)具有如下用途:
[0034]1、觀察miR-126轉(zhuǎn)染后卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的變化。
[0035]2、研究miR-126在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中的作用，尋找卵巢癌臨床治療的新靶點(diǎn)?！揪唧w實(shí)施方式】
[0036]實(shí)施例1、一種miR-126轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株的制備方法，依次進(jìn)行如下步驟:
[0037]I)、親代細(xì)胞培養(yǎng):
[0038]人卵巢粘液性囊腺癌細(xì)胞株SK0V3，在37°C，5% (體積％) CO2條件下培養(yǎng)于含10%FBS、l%Ant1-Anti 的 DMEM 高糖培養(yǎng)液中；
[0039]然后，用含0.25%胰酶和0.02%EDTA的PBS進(jìn)行消化、傳代，2~3天傳代I次；[0040]上述含10%FBS、l%Ant1-Anti的DMEM高糖培養(yǎng)液即為:在IL的DMEM高糖培養(yǎng)液中加入100ml的FBS (fetal calf serum,胎牛血清)以及加入IOml的Ant1-Anti(Antibiotic-Antimycotic,抗菌-抗真菌劑)。
[0041]上述含0.25%胰酶和0.02%EDTA的PBS為:在每100mlPBS緩沖液(pH7.4)中加入
0.25g胰酶+0.02g的EDTA (乙二胺四乙酸)。
[0042]備注說(shuō)明:上述傳代僅需I次，選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好、80%匯合的早期傳代細(xì)胞。
[0043]2)、miR-126 準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染:
[0044]利用慢病毒技術(shù)，取步驟I)所得的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SK0V3細(xì)胞，接種于6cm培養(yǎng)皿，每孔細(xì)胞數(shù)為3 X IO5個(gè)，加2ml全培養(yǎng)基培養(yǎng)，24小時(shí)后待細(xì)胞長(zhǎng)至80%~90%融合時(shí)，用2ml無(wú)血清培養(yǎng)基洗細(xì)胞一次，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。
[0045]備注說(shuō)明:
[0046]全培養(yǎng)基為:FBS (fetal calf serum,胎牛血清)與DMEM高糖培養(yǎng)液按照1:9的體積比混合而得；
[0047]無(wú)血清培養(yǎng)基為:DMEM高糖培養(yǎng)液。
[0048]3)、實(shí)驗(yàn)分組及處理
[0049]①、轉(zhuǎn)染miR-126 過(guò)表達(dá)組(SK0V3/LV3-has_miR-126 組):
[0050]Iml DMEM 高 糖培養(yǎng)液+45ul LV3-has_miR-126 慢病毒原液(濃度為 I X IO8 個(gè)/ml)+lul5ug/ul polybrene (聚凝胺,基因轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑)；
[0051]②、轉(zhuǎn)染miR-126 抑制表達(dá)組(SK0V3/LV3-has-miR-126inhibitor 組):
[0052]Iml DMEM 高糖培養(yǎng)液+45ul LV3-has_miR-126inhibitor 慢毒原液(濃度為 I X IO8個(gè)/ml)+lul5ug/ul polybrene ；
[0053]③、轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組(SK0V3/LV3NC組):
[0054]Iml DMEM高糖培養(yǎng)液+45ul LV3NC慢病毒原液(濃度為I X IO8個(gè)/ml)+lul5ug/ulpolybrene ；
[0055]④、空白對(duì)照組(SK0V3組):
[0056]Iml DMEM 高糖培養(yǎng)液+45ul 培養(yǎng)基+lul5ug/ul polybrene ；
[0057]每組中加入步驟2)所得的準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染的SK0V3細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)的MOI值約為15 ;混合均勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)，然后更換全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h后，取出培養(yǎng)皿，直接在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察、細(xì)胞計(jì)數(shù)并拍照，隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算有綠色熒光的細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的百分比，即為轉(zhuǎn)染效率，上述4組均為90.2±5.3% ；
[0058]備注:
[0059]上述培養(yǎng)均是在37 °C，5 % CO2條件下進(jìn)行。
[0060]為綠色熒光指細(xì)胞被慢病毒轉(zhuǎn)染了，慢病毒上均含有編碼GFP的基因，故轉(zhuǎn)染細(xì)胞在熒光顯微鏡下可激發(fā)出綠色熒光。
[0061]LV3-has-miR-126 序列(5，to3，):TCGTACCGTGAGTAATAATGCG ；
[0062]LV3-has-miR-126inhibitor 序列(5，to3，):CGCATTATTACTCACGGTACGA ；
[0063]LV3NC 序列(5，to3，): TTCTCCGAACGTGTCACGT。
[0064]4)、經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察和驗(yàn)證的miR-126轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株(SK0V3/LV3-has_miR-126組)具有以下特征:[0065]①形態(tài)學(xué)觀察:
[0066]發(fā)現(xiàn)較之SK0V3/LV3-has-miR-126 組，SK0V3/LV3-has_miR-126inhibitor 組狹長(zhǎng)的細(xì)胞居多，細(xì)胞骨架消失，片狀偽足增多，這均有利于腫瘤細(xì)胞的遷移；
[0067]g卩，miR-126轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株(SK0V3/LV3-has_miR-126組)，狹長(zhǎng)的細(xì)胞減少，細(xì)胞骨架增加，片狀偽足減少，這均有利于抑制腫瘤細(xì)胞的遷移；
[0068]而SK0V3組與SK0V3/LV3NC組的細(xì)胞形態(tài)則處于前面提到的兩組的細(xì)胞形態(tài)之間。這說(shuō)明miR-126影響卵巢癌細(xì)胞的遷移部分是因?yàn)閙iR-126對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響。
[0069]②、細(xì)胞周期分析: [0070]經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，SK0V3組、SK0V3/LV3NC組、SK0V3/LV3-has-miR-126inhibitor 組 S 期細(xì)胞平均比例分別為 63.9%、53.1 %和 34.7%。
[0071]SK0V3組和SK0V3/LV3NC組細(xì)胞S期增值指數(shù)相近；與SK0V3組和SK0V3/LV3NC組細(xì)胞任一組比較，SK0V3/LV3-has-miR-126inhibitor組的細(xì)胞S期增殖指數(shù)較高，表明miR-126抑制表達(dá)后，細(xì)胞的S期合成顯著增加；
[0072]g卩，miR-126轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株(SK0V3/LV3-has_miR-126組)S期增殖指數(shù)降低；
[0073]③、侵襲實(shí)驗(yàn):
[0074]31(0￥3細(xì)胞侵過(guò)基質(zhì)膠的穿膜細(xì)胞數(shù)在未處理組(51(0￥3組)細(xì)胞中是253±14。與未處理組細(xì)胞相比較，陰性對(duì)照組細(xì)胞侵過(guò)基質(zhì)膠的穿膜細(xì)胞數(shù)沒(méi)有明顯改變(256±15，P > 0.05),轉(zhuǎn)染LV3-has-miR-126inhibitor組細(xì)胞侵過(guò)基質(zhì)膠的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯增加(290±13，P < 0.05)。
[0075]轉(zhuǎn)染miR-126過(guò)表達(dá)組(SK0V3/LV3-has_miR-126組)為侵過(guò)基質(zhì)膠的穿膜細(xì)胞數(shù) 164±25。
[0076]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.miR-126轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株的制備方法，其特征在于轉(zhuǎn)染質(zhì)粒序列為:
①LV3-has-miR-126 序列:TCGTACCGTGAGTAATAATGCG，
②LV3-has-miR-126inhibitor 序列:CGCATTATTACTCACGGTACGA， ③LV3NC 序列:TTCTCCGAACGTGTCACGT。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述miR-126轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株的制備方法，其特征在于依次包括以下步驟: ①、親代細(xì)胞培養(yǎng): 人卵巢粘液性囊腺癌細(xì)胞株SK0V3，在37°C，體積比5% CO2條件下培養(yǎng)于含10%FBS、l%Ant1-Anti的DMEM高糖培養(yǎng)液中，然后用含0.25%胰酶和0.02%EDTA的PBS消化、傳代，2~3天傳代I次； ②、miR-126準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染: 利用慢病毒技術(shù)，取步驟①所得的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SK0V3細(xì)胞，接種于6cm培養(yǎng)皿，每孔細(xì)胞數(shù)為3 X IO5個(gè)，加2ml全培養(yǎng)基培養(yǎng)，24小時(shí)后待細(xì)胞長(zhǎng)至80 %~90 %融合時(shí)，用2ml無(wú)血清培養(yǎng)基洗細(xì)胞一次，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染； 所述全培養(yǎng)基為=FBS與DMEM高糖培養(yǎng)液按照1:9的體積比混合而得； 所述無(wú)血清培養(yǎng)基為=DMEM高糖培養(yǎng)液； ③實(shí)驗(yàn)分組及處理； 轉(zhuǎn)染 miR-126 過(guò)表達(dá)組(SK0V3/LV3-has-miR-126 組):1ml DMEM高糖培養(yǎng)液+45ul LV3-has_miR-126慢病毒原液(濃度為I X IO8個(gè)/ml)+lul5ug/ul polybrene。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述miR-126轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株的制備方法，其特征在于: 所述步驟③的實(shí)驗(yàn)分組還包括以下組別: 轉(zhuǎn)染 miR-126 抑制表達(dá)組(SK0V3/LV3-has-miR-126inhibitor 組):1ml DMEM 高糖培養(yǎng)液 +45ul LV3-has_miR-126inhibitor 慢毒原液(濃度為 I X IO8 個(gè)/ml) +lul5ug/ul polybrene ； 轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組(SK0V3/LV3NC組): Iml DMEM高糖培養(yǎng)液+45ul LV3NC慢病毒原液(濃度為I X IO8個(gè)/ml) +lul5ug/ulpolybrene ； 空白對(duì)照組(NC): Iml DMEM 高糖培養(yǎng)液+45ul 培養(yǎng)基+lul5ug/ul polybrene。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述miR-126轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株的制備方法，其特征在于: 對(duì)上述 SK0V3/LV3-has-miR-126 組、SK0V3/LV3-has-miR-126inhibitor 組、SK0V3/LV3NC組、空白對(duì)照組分別進(jìn)行以下操作: 每組中加入步驟2)所得的準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染的SK0V3細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)的MOI值為15 ;混合均勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)，然后更換成全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h后，取出培養(yǎng)皿，直接在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察、細(xì)胞計(jì)數(shù)并拍照，隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算有綠色熒光的細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的百分比，即為轉(zhuǎn)染效率。
5.根據(jù)權(quán)利要求2、3或4所述miR-126轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株的制備方法，其特征在于:miR-126轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株(SK0V3/LV3-has-miR-126組)具有以下特征:①miR-126轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株，狹長(zhǎng)的細(xì)胞減少，細(xì)胞骨架增加，片狀偽足減少，這均有利于抑制腫瘤細(xì)胞的遷移； ②miR-126轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株S期增殖指數(shù)降低； ③侵過(guò)基質(zhì)膠的穿膜細(xì)胞數(shù)減少。
【文檔編號(hào)】C12N5/09GK103614338SQ201310513778
【公開(kāi)日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年10月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月25日
【發(fā)明者】周建維, 王雙燕, 費(fèi)菁, 趙家耀, 李建瓊, 王紅亞 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)