重組人Endomucin在大腸桿菌中的高效表達方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種重組人Endomucin在大腸桿菌中的高效表達方法，將在大腸桿菌中難以實現(xiàn)表達的重組人Endomucin膜蛋白，通過GST-Endomucin融合蛋白策略的開發(fā)，對表達質(zhì)粒的改造，表達宿主菌株的優(yōu)選，和表達工藝的開發(fā)，實現(xiàn)了大量制備重組人Endomucin的目的。
【專利說明】重組人Endomucin在大腸桿菌中的高效表達方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供一種重組人Endomucin在大腸桿菌中的高效表達方法,屬于生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]本發(fā)明涉及的“重組人Endomucin”是一種表達在造血干細胞膜表面的跨膜蛋白。Endoumcin是1999年Morgan在小鼠內(nèi)皮細胞系發(fā)現(xiàn)的,其表達特定于造血祖細胞、成體造血干細胞和處于發(fā)育期的多能祖細胞的膜表面，并與粘液素類糖蛋白有相似的結(jié)構(gòu)。Endomucin的表達與造血干細胞膜表面的2個重要標志分子:c_Kit和Sca-1的表達密切相關(guān)。而且，Endomucin可以代替c-Kit和Sca-1,單獨鑒定造血干細胞。Endomucin作為最新發(fā)現(xiàn)的最重要的造血干細胞標志分子，一般用于在骨髓和外周血中鑒定和分析造血干細胞。
[0003]目前，臨床上還沒有用于促進造血干細胞自我更新和促進造血祖細胞再生修復(fù)的藥物。研究發(fā)現(xiàn)，Endomucin是造血干細胞和造血祖細胞增殖的促進因子。在化療藥物5-氟尿喃唳(5-Fu)損傷作用下,骨髓中Endomucin基因的表達量迅速提高,促進造血干細胞的增殖與分化以應(yīng)對5-Fu對細胞的殺傷。當骨髓造血進入恢復(fù)期后，Endomucin基因的表達量下降使骨髓造血保持一個平衡的狀態(tài)。如果能應(yīng)用基因工程技術(shù)，在大腸桿菌中表達重組Endomucin蛋白，并進而開發(fā)成治療腫瘤的輔助藥物，將具有巨大的臨床應(yīng)用價值。
[0004]應(yīng)用原核表達體系表達蛋白具有簡便、快捷、蛋白表達量高的優(yōu)勢。但是由于Endomucin是一種結(jié)合在細胞膜表面的疏水性很強的跨膜蛋白，因此與分泌型蛋白比較，要想在大腸桿菌中實現(xiàn)表達是非常困難的。應(yīng)用pET28a、pET22b、pQE、pBV220等多種常用的表達質(zhì)粒系統(tǒng)均未獲成功。目前，重組人Endomucin在大腸桿菌中的高效表達方面尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種重組人Endomucin在大腸桿菌中的高效表達方法，達到制備大量重組人Endomucin蛋白的目的。
[0006]本發(fā)明公開的一種重組人Endomucin在大腸桿菌中的高效表達方法，其技術(shù)解決方案如下:
1)將人Endomucin全長基因(Genebank編號:AF205940)克隆到pGEX_2T表達質(zhì)粒中，采用的限制性內(nèi)切酶分別是N末端的BamH I和C末端的RcoR I，使目的基因連接到谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)基因后面，在GST和Endomucin基因中間插入一個凝血酶酶切位點，構(gòu)建的克隆質(zhì)粒命名為pGEX-Endomucin。將pGEX_2T表達質(zhì)粒中的GST基因和人Endomucin基因連接在一起，以GST-Endomucin融合蛋白的形式進行表達。因為GST是能夠在大腸桿菌中實現(xiàn)高效表達的蛋白，采用GST-Endomucin融合蛋白的策略，可以在表達GST的時候，將連在其后面的Endomucin蛋白一起表達出來，然后用凝血酶將GST從融合蛋白上切下來，獲得Endomucin蛋白。其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白(人Endomucin)。
[0007]編碼人Endomucin全長基因的多聚核苷酸序列可以用人工合成的方法獲得，也可以用RT-PCR的方法從人肝胎cDNA文庫、或來源于任何含有相應(yīng)mRNA或cDNA的組織、細胞及文庫中獲得?？捎帽绢I(lǐng)域公知的方法將編碼人Endomucin蛋白序列的核酸克隆到各種表達載體中去，所用的標準分子克隆過程見(J.薩姆布魯克等，《分子克隆實驗指南》第二版，科學(xué)出版社，1995.)的敘述。pGEX-2T表達質(zhì)粒和對應(yīng)的宿主菌從Invitrogen Corp購得。
[0008]2)應(yīng)用大腸桿菌BL21(DE3) (plySs)菌株作為表達Endomucin蛋白的宿主菌，使得在常用的大腸桿菌BL21 (DE3)中不能表達GST-Endomucin融合蛋白的情況得到改善,在該宿主菌中能夠?qū)崿F(xiàn)高效表達。將pGEX-Endomucin質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3) (plySs)，構(gòu)建能表達GST-Endomucin融合蛋白的大腸桿菌工程菌株BL21_GEn，_70°C保存。
[0009]3)在GST-Endomucin融合蛋白的表達工藝上,具體工藝步驟是:
①將大腸桿菌工程菌株BL21-GEn劃線接種LB半固體培養(yǎng)基(含100ug/mL Amp), 37°C倒置培養(yǎng)過夜，至半固體培養(yǎng)基上長出工程菌株BL21-GEn的單菌落。
[0010]②無菌挑取一個單菌落接種IOOmL LB培養(yǎng)基(含100ug/mL Amp)，在37°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)260 rpm下培養(yǎng)大腸桿菌BL21_GEn過夜，收獲培養(yǎng)物。
[0011]③將收獲的培養(yǎng)物以2-8%接種LB培養(yǎng)基(含100ug/mL Amp), 37°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)260rpm下培養(yǎng)至0D600達到0.6-1.0，然后降低溫度至32°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)180_220rpm，繼續(xù)培養(yǎng)
1-2h，然后加入誘導(dǎo)劑IPTG達到0.8-1.2mM，進行目的蛋白的誘導(dǎo)表達，
④誘導(dǎo)4-6h后停止發(fā)酵,收獲發(fā)酵液。人Endomucin蛋白的表達量占菌體總蛋白的33-42%。
[0012]4)收集發(fā)酵液，應(yīng)用高壓均質(zhì)機破碎菌體。破碎后，應(yīng)用高速冷凍離心機收集上清液，操作條件是:4°C下,在14000rpm離心30min,收集離心上清液進行下一步柱層析純化。應(yīng)用針對GST的親和層析介質(zhì)Glutathione-Sepharose進行親和柱層析純化，收獲GST-Endomucin融合蛋白。采用凝血酶切下GST-Endomucin融合蛋白中的GST肽段,應(yīng)用Superdex 75凝膠過濾柱層析純化,獲得純度超過98%的重組人Endomucin蛋白。
[0013]本發(fā)明的積極效果在于:
將在大腸桿菌中難以實現(xiàn)表達的重組人Endomucin膜蛋白，通過GST-Endomucin融合蛋白策略的開發(fā)，對表達宿主菌株的優(yōu)選，和表達工藝的開發(fā)，實現(xiàn)了大量制備重組人Endomucin 的目的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1.Endomucin在大腸桿菌中的表達結(jié)果圖；
圖2.Endomucin的純化蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果圖。
[0015]圖3.Endomucin在大腸桿菌中的表達結(jié)果圖；
圖4.Endomucin的純化蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果圖。
[0016]圖5.Endomucin在大腸桿菌中的表達結(jié)果圖；
圖6.Endomucin的純化蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果圖。
【具體實施方式】[0017]實施例1
I)將人Endomucin全長基因克隆到pGEX_2T表達質(zhì)粒中，采用的限制性內(nèi)切酶分別是N末端的BamH I和C末端的RcoR I，使目的基因連接到谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)基因后面，在GST和Endomucin基因中間插入一個凝血酶酶切位點，構(gòu)建新的克隆質(zhì)粒pGEX-Endomucin,表達 GST-Endomucin 融合蛋白。
[0018]2)應(yīng)用大腸桿菌BL21(DE3) (plySs)菌株作為表達Endomucin蛋白的宿主菌，將pGEX-Endomucin質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3) (plySs),構(gòu)建能表達GST-Endomucin融合蛋白的大腸桿菌工程菌株BL21-GEn。
[0019]3)在GST-Endomucin融合蛋白的表達工藝上,具體工藝步驟是:
①將大腸桿菌工程菌株BL21-GEn劃線接種LB半固體培養(yǎng)基(含100ug/mL Amp), 37°C倒置培養(yǎng)過夜，至半固體培養(yǎng)基上長出工程菌株BL21-GEn的單菌落。
[0020]②無菌挑取一個單菌落接種IOOmL LB培養(yǎng)基(含100ug/mL Amp)，在37°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)260 rpm下培養(yǎng)大腸桿菌BL21_GEn過夜，收獲培養(yǎng)物。
[0021]③將收獲的培養(yǎng)物以2-8%接種LB培養(yǎng)基(含100ug/mL Amp), 37°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)260rpm下培養(yǎng)至0D600達到0.6，然后降低溫度至32°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)180rpm，繼續(xù)培養(yǎng)lh，然后加入誘導(dǎo)劑IPTG達到0.8mM,進行目的蛋白的誘導(dǎo)表達。
[0022]④誘導(dǎo)4h后停止發(fā)酵，收獲發(fā)酵液。人Endomucin蛋白的表達量占菌體總蛋白的35%。
[0023]圖1.Endomucin在大腸桿菌中的表達結(jié)果圖(LanelO: Protein marker ；Lane9:1nduction and expression of recombinant GST-Endomucin fusion protein)；
圖 2.Endomucin 的純化蛋白的 SDS-PAGE 電泳結(jié)果圖(Lane 9: Protein marker ；Lane6:Purified recombinant GST-Endomucin fusion protein)。
[0024]實施例2
I)將人Endomucin全長基因克隆到pGEX_2T表達質(zhì)粒中，采用的限制性內(nèi)切酶分別是N末端的BamH I和C末端的RcoR I，使目的基因連接到谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)基因后面，在GST和Endomucin基因中間插入一個凝血酶酶切位點，構(gòu)建新的克隆質(zhì)粒pGEX-Endomucin,表達 GST-Endomucin 融合蛋白。
[0025]2)應(yīng)用大腸桿菌BL21(DE3) (plySs)菌株作為表達Endomucin蛋白的宿主菌，將pGEX-Endomucin質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3) (plySs),構(gòu)建能表達GST-Endomucin融合蛋白的大腸桿菌工程菌株BL21-GEn。
[0026]3)在GST-Endomucin融合蛋白的表達工藝上,具體工藝步驟是:
①將大腸桿菌工程菌株BL21-GEn劃線接種LB半固體培養(yǎng)基(含100ug/mL Amp), 37°C倒置培養(yǎng)過夜，至半固體培養(yǎng)基上長出工程菌株BL21-GEn的單菌落。
[0027]②無菌挑取一個單菌落接種IOOmL LB培養(yǎng)基(含100ug/mL Amp)，在37°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)260 rpm下培養(yǎng)大腸桿菌BL21_GEn過夜，收獲培養(yǎng)物。
[0028]③將收獲的培養(yǎng)物以2-8%接種LB培養(yǎng)基(含100ug/mL Amp), 37°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)260rpm下培養(yǎng)至0D600達到1.0，然后降低溫度至32°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)220rpm，繼續(xù)培養(yǎng)2h，然后加入誘導(dǎo)劑IPTG達到1.2mM，進行目的蛋白的誘導(dǎo)表達。
[0029]④誘導(dǎo)6h后停止發(fā)酵，收獲發(fā)酵液。人Endomucin蛋白的表達量占菌體總蛋白的42%。
[0030]圖 3.Endomucin 在大腸桿菌中的表達結(jié)果圖(Lane9: Protein marker ；Lane8:1nduction and expression of recombinant GST-Endomucin fusion protein)；
圖4.Endomucin 的純化蛋白的SDS-PAGE 電泳結(jié)果圖(Lane 10: Protein marker ;Lane6: Purified recombinant GST-Endomucin fusion protein)。
[0031]實施例3
I)將人Endomucin全長基因克隆到pGEX_2T表達質(zhì)粒中，采用的限制性內(nèi)切酶分別是N末端的BamH I和C末端的RcoR I，使目的基因連接到谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)基因后面，在GST和Endomucin基因中間插入一個凝血酶酶切位點，構(gòu)建新的克隆質(zhì)粒pGEX-Endomucin,表達 GST-Endomucin 融合蛋白。
[0032]2)應(yīng)用大腸桿菌BL21(DE3) (plySs)菌株作為表達Endomucin蛋白的宿主菌，將pGEX-Endomucin質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3) (plySs),構(gòu)建能表達GST-Endomucin融合蛋白的大腸桿菌工程菌株BL21-GEn。
[0033]3)在GST-Endomucin融合蛋白的表達工藝上,具體工藝步驟是:
①將大腸桿菌工程菌株BL21-GEn劃線接種LB半固體培養(yǎng)基(含100ug/mL Amp), 37°C倒置培養(yǎng)過夜，至半固體培養(yǎng)基上長出工程菌株BL21-GEn的單菌落。
[0034]②無菌挑取一個單菌落接種IOOmL LB培養(yǎng)基(含100ug/mL Amp)，在37°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)260 rpm下培養(yǎng)大腸桿菌BL21_GEn過夜，收獲培養(yǎng)物。
`[0035]③將收獲的培養(yǎng)物以2-8%接種LB培養(yǎng)基(含100ug/mL Amp), 37°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)260rpm下培養(yǎng)至0D600達到0.8，然后降低溫度至32°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)200rpm，繼續(xù)培養(yǎng)1.5h，然后加入誘導(dǎo)劑IPTG達到1.0mM，進行目的蛋白的誘導(dǎo)表達。
[0036]④誘導(dǎo)5h后停止發(fā)酵，收獲發(fā)酵液。人Endomucin蛋白的表達量占菌體總蛋白的38%。
[0037]圖5.Endomucin 在大腸桿菌中的表達結(jié)果圖(Lane6: Protein marker ；Lane7:1nduction and expression of recombinant GST-Endomucin fusion protein)；
圖 6.Endomucin 的純化蛋白的 SDS-PAGE 電泳結(jié)果圖(Lane 9: Protein marker ；Lane7: Purified recombinant GST-Endomucin fusion protein)。
【權(quán)利要求】
1.一種重組人Endomucin在大腸桿菌中的高效表達方法,包括以下步驟: 1)將人Endomucin全長基因(Genebank編號:AF205940)克隆到pGEX_2T表達質(zhì)粒中，采用的限制性內(nèi)切酶分別是N末端的Bam H I和C末端的EcoR I，使目的基因連接到谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)基因后面，在GST和Endomucin基因中間插入一個凝血酶酶切位點，構(gòu)建的克隆質(zhì)粒命名為pGEX-Endomucin ;將pGEX_2T表達質(zhì)粒中的GST基因和人Endomucin基因連接在一起，以GST-Endomucin融合蛋白的形式進行表達；然后用凝血酶將GST從融合蛋白上切下來，獲得Endomucin蛋白； 2)應(yīng)用大腸桿菌BL21(DE3)(plySs)菌株作為表達Endomucin蛋白的宿主菌，使得在常用的大腸桿菌BL21 (DE3)中不能表達GST-Endomucin融合蛋白的情況得到改善,在該宿主菌中能夠?qū)崿F(xiàn)高效表達；將pGEX-Endomucin質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3) (plySs)，構(gòu)建能表達GST-Endomucin融合蛋白的大腸桿菌工程菌株BL21_GEn，_70°C保存； 3)在GST-Endomucin融合蛋白的表達工藝上,具體工藝步驟是: ①將大腸桿菌工程菌株BL21-GEn劃線接種LB半固體培養(yǎng)基(含100ug/mLAmp), 37°C倒置培養(yǎng)過夜，至半固體培養(yǎng)基上長出工程菌株BL21-GEn的單菌落； ②無菌挑取一個單菌落接種IOOmLLB培養(yǎng)基(含100ug/mL Amp)，在37°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù).260 rpm下培養(yǎng)大腸桿菌BL21_GEn過夜，收獲培養(yǎng)物； ③將收獲的培養(yǎng)物以2-8%接種LB培養(yǎng)基(含100ug/mLAmp)，37 °C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)260rpm下培養(yǎng)至0D600達到0.6-1.0，然后降低溫度至32°C，搖床轉(zhuǎn)數(shù)180_220rpm，繼續(xù)培養(yǎng)1-2h，然后加入誘導(dǎo)劑IPTG達到0.8-1.2mM，進行目的蛋白的誘導(dǎo)表達； ④誘導(dǎo)4-6h后停止發(fā)酵，收獲發(fā)酵液:人Endomucin蛋白的表達量占菌體總蛋白的33-42% ； 4)收集發(fā)酵液，應(yīng)用高壓均質(zhì)機破碎菌體； 破碎后，應(yīng)用高速冷凍離心機收集上清液，操作條件是:4 °C下，在HOOOrpm離心.30min,收集離心上清液進行下一步柱層析純化； 應(yīng)用針對GST的親和層析介質(zhì)Glutathione-Sepharose進行親和柱層析純化，收獲GST-Endomucin融合蛋白；采用凝血酶切下GST-Endomucin融合蛋白中的GST肽段,應(yīng)用Superdex 75凝膠過濾柱層析純化,獲得純度超過98%的重組人Endomucin蛋白。
【文檔編號】C12N15/70GK103555752SQ201310516865
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月29日
【發(fā)明者】王群, 鞠長軍, 高俊芳 申請人:長春長生生物科技股份有限公司