一種角蛋白酶及其編碼基因的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種角蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示或在SEQ?ID?NO.2基礎(chǔ)上通過缺失、突變、重組獲得的具有角蛋白酶活性的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了一種編碼角蛋白酶的基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示或根據(jù)角蛋白酶氨基酸缺失、突變、重組情況，人工設(shè)計(jì)的核苷酸序列。本發(fā)明提供的角蛋白酶能夠有效水解羽毛，羊毛等非水溶性角蛋白底物，可用于皮革紡織工業(yè)和飼料工業(yè)。
【專利說明】—種角蛋白酶及其編碼基因
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種角蛋白酶及其編碼基因，屬于酶基因工程和酶工程領(lǐng)域。
技術(shù)背景
[0002]全球家禽養(yǎng)殖業(yè)年產(chǎn)生數(shù)百萬噸羽毛，角蛋白在羽毛中占很大的比重，高達(dá)90%以上。羽毛營(yíng)養(yǎng)成分分析表明，氨基酸含量在70%以上。其中動(dòng)物的第一，第二限制性氨基酸:賴氨酸和蛋氨酸含量分別高達(dá)0.77%和0.48%。動(dòng)物的另一種必需氨基酸，甘氨酸含量占到7.59%。而在動(dòng)物日糧中，賴氨酸添加比例一般為0.1%-0.2%，蛋氨酸的添加比例為
0.02%-0.1%。目前中國(guó)飼料蛋白源嚴(yán)重不足，而中國(guó)是羽毛產(chǎn)量第一大國(guó)，年產(chǎn)量70萬噸以上。以羽毛為原料作為飼料蛋白源，具有很好的前景。此外，羽毛角蛋白還可以廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥，食品，復(fù)合材料行業(yè)。所以羽毛角蛋白的開發(fā)利用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0003]但是，由于角蛋白多肽鏈間二硫鍵，鹽鍵，氫鍵的廣泛存在，使角蛋白的結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，尤其由于二硫鍵的存在。常用的蛋白酶，如胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，胃蛋白酶，都很難降解角蛋白。熱處理對(duì)角蛋白的降解程度很有限，此外還會(huì)破壞一些具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的氨基酸，如賴氨酸，蛋氨酸和色氨酸，產(chǎn)生一些動(dòng)物不需要的氨基酸，如硫化雙丙氨酸。而化學(xué)方法，主要包括酸水解法和堿水解法，也會(huì)破壞掉一些具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)的氨基酸。此外水解后的廢水還會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染?；诖思懊阜磻?yīng)所具有的優(yōu)勢(shì)，利用角蛋白酶降解羽毛角蛋白成為一種具有很好前景的方法。角蛋白酶(Keratinase)為一種可以特異性降解角蛋白的酶類，由真菌、放線菌和細(xì)菌等多種微生物產(chǎn)生。角蛋白酶在食品、醫(yī)藥、飼料、精化和制革等工業(yè)中廣泛應(yīng)用，具有嫩化肉類、生產(chǎn)高級(jí)營(yíng)養(yǎng)品、免疫制劑和飼料添加劑以及美容、軟化皮革等作用，并可導(dǎo)致瘋 牛病和人類克雅氏癥的阮蛋白(Prion)的降解。更使其成為研究熱點(diǎn)，應(yīng)用和研究?jī)r(jià)值巨大。
[0004]目前已經(jīng)報(bào)道的角蛋白酶基因主要來自國(guó)外的一株地衣芽胞桿菌的kerA基因。本專利介紹一種由本實(shí)驗(yàn)室自主篩選獲得的具有高效降解羽毛能力的嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia BBE11-1),并將角蛋白酶基因單獨(dú)表達(dá)，并進(jìn)行基因以及酶學(xué)性質(zhì)方面的研究，為角蛋白酶的規(guī)模化生產(chǎn)及推廣具有深遠(yuǎn)的技術(shù)指導(dǎo)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種水解非水溶性角蛋白底物的角蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示或在SEQ ID N0.2基礎(chǔ)上通過缺失、突變、重組獲得的具有角蛋白酶活性的氨基酸序列。
[0006]本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種上述角蛋白酶的基因，、其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示或根據(jù)角蛋白酶氨基酸缺失、突變、重組情況，人工設(shè)計(jì)的核苷酸序列。
[0007]此外，本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)的角蛋白酶的方法，具體包括如下步驟:首先采用化學(xué)全合成或PCR方法獲得SEQ ID N0.1所示核苷酸序列；克隆獲得的核苷酸序列到pET22b (+)表達(dá)載體；然后將獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E.coli BL21獲得表達(dá)的角蛋白酶的基因工程菌；最后通過優(yōu)化發(fā)酵工藝，將獲得的基因工程菌在含有ΙΟΟμ g/Ι的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37°C液體培養(yǎng)過夜，后接入含有100 μ g/1的氨芐青霉素的LB發(fā)酵液體培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)至0D600nm=0.6，降溫至20°C培養(yǎng)，加入最終濃度0.1mM的誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)，72h時(shí)離心獲得上清酶液，即為粗酶液。包含本發(fā)明角蛋白酶基因的表達(dá)載體屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0008]包含本發(fā)明提供的表達(dá)載體的細(xì)胞系或基因工程菌也為本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0009]上述角蛋白酶及其編碼基因在在處理羽毛中的應(yīng)用也為本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0010]角蛋白酶酶活測(cè)定方法，測(cè)定原理及步驟為。
[0011]原理:角蛋白酶水解角蛋白底物，釋放出酪氨酸，通過酪氨酸與福林酚顯色，在660nm下測(cè)定吸光度值。吸光值的大小直接與酶活力的高低成正比。
[0012]測(cè)定步驟:0.1mL經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶液,加入0.1mL的1% (w/v)可溶性角蛋白底物(使用前和0.lmol/L的pH9.0的Gly-NaOH緩沖液混合)，在50°C反應(yīng)20min，每個(gè)反應(yīng)樣品中加入0.2mLTCA反應(yīng)終止蛋白沉淀劑,搖勻后10，000r/min離心5min,取0.2mL上清液加入ImL的4% (w/v) Na2CO3,再加入0.2mL上海生工公司購買的福林酚試劑(預(yù)先稀釋3倍)在50°C下反應(yīng)15分鐘。使用0.5cm的石英比色杯測(cè)定清液在660nm處的吸光值?？瞻讓?duì)照是在加入底物之前已經(jīng)加入同等體積的TCA終止酶活，其他步驟相同。酶活定義為每毫升酶液每分鐘釋放出多少微克酪氨酸。
[0013]本發(fā)明提供的重組角蛋白酶的最適溫度60°C，最適pH9.0。在50°C、pH9.0下與不溶性角蛋白底物反應(yīng)，能夠部分水解。50°C下酶活性半衰期為90分鐘，60°C下半衰期62分鐘。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該重組角蛋白酶能夠很好的水解羽毛粉，羊毛，具有很好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1重組菌構(gòu)建瓊脂糖凝膠電泳圖
[0015]M:DNA marker，l:角蛋白酶全長(zhǎng)閱讀框基因片段(1923bp)，2:角蛋白酶基因PCR產(chǎn)物，3:擴(kuò)增質(zhì)粒 pMD19T+KerSMD，4:質(zhì)粒 pMD19T+KerSMD 雙酶切(Nco I /Xho I ) 5:表達(dá)質(zhì)粒 pET22b+KerSMD，6:表達(dá)質(zhì)粒 pET22b+KerSMD 雙酶切(Nco I /Xho I )
[0016]圖2重組菌發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶SDS-PAGE圖
[0017]M:protein marker, 1:誘導(dǎo)12h發(fā)酵上清,2:誘導(dǎo)24h發(fā)酵液上清,3:誘導(dǎo)48h發(fā)酵液上清，4:純化的角蛋白酶，圖中總箭頭所示為目標(biāo)蛋白。
[0018]圖3角蛋白酶KerSMD在不同pH下的酶活性。pH4_6為醋酸鈉緩沖液，pH6_7為磷酸緩沖液，PH7-9為Tris-HCl緩沖液，pH9_12為Gly-NaOH緩沖液。
[0019]圖4角蛋白酶KerSMD在不同溫度下的酶活性。使用pH7.0緩沖液。
[0020]圖5角蛋白酶KerSMD在不同溫度下的酶穩(wěn)定性。使用pH7.0緩沖液，保存角蛋白酶于不同溫度下不同時(shí)間之后測(cè)定酶活。
【具體實(shí)施方式】
[0021]實(shí)施例1角蛋白酶基因的分離克隆程序。
[0022]Stenotrophomonas maltophilia BBEll-1 (已在本課題組之前的專利申請(qǐng)中提交保藏機(jī)構(gòu)，2011年4月3日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué))，保藏編號(hào)為CCTCCN0.2011193)在液體LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，氯化鈉10g/L，酵母提取物10g/L)中培養(yǎng)12h，1000Orpm離心5min收集菌體，無菌水洗滌，使用基因組提取試劑盒(上海生工公司購買)提取總DNA。
[0023]利用引物Ndel-kerD (GGAATTCCATATGATGGCCGCAGTGTTG)和 Xho1-kerD(CCGCTCGAGCTGCGTGGCGAGGATG),以 Stenotrophomonas maltophilia BBEll-1 基因組為模版，PCR擴(kuò)增角蛋白酶基因。反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min后進(jìn)入一下循環(huán):95°C變性50s，60°C退火30s，72°C延伸110s，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。擴(kuò)增得到1923bp的PCR片段，切膠回收?；厥掌瑪嗯cPMD19-T simple載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌J1109，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB平板。37°C培養(yǎng)過夜，挑取單菌落，接入LB液體培養(yǎng)基，8h后提取質(zhì)粒。將此質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果表明此基因開放閱讀框全長(zhǎng)1902個(gè)核苷酸，編碼634個(gè)氛基酸，和Stenotrophomonas maltophilia YHYJ-1的kerD基因有7個(gè)氛基酸的差異。
[0024]實(shí)施例2角蛋白酶基因在大腸桿菌表達(dá)載體上的構(gòu)建程序。
[0025]用于構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體的質(zhì)粒是pET22b(+)。利用引物Noc1-p-kerD(CATGCCATGGCCGGGTTGCCGAC)和 Xho1-kerD (CCGCTCGAGCTGCGTGGCGAGGATG)進(jìn)行擴(kuò)增角蛋白酶KerSMD的基因。將pET22b (+)質(zhì)粒和角蛋白酶基因進(jìn)行Nco I和Xho I雙酶切，酶切產(chǎn)物切膠回收后，再用T4連接酶16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)37°C培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化子100mg/L氨芐青霉素LB進(jìn)行液體培養(yǎng)，然后抽提質(zhì)粒，得到富集的KerSMD-pET22b(+)質(zhì)粒，構(gòu)建過程電泳圖見圖1。
[0026]實(shí)施例3大腸桿菌宿主轉(zhuǎn)化和篩選重組菌的程序。
[0027]將質(zhì)粒KerSMD-pET22b (+)在 42 °C 熱擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 E.coli BL21 (DE3)宿主菌，在氨芐青霉素(100mg/L)-LB平板上經(jīng)37 °C培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化子(重組菌KerSMD-pET22b (+) /E.coli BL21(DE3))在 LB 培養(yǎng)基(蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L，NaC110g/L)中37°C液體培養(yǎng)過夜，`后接入LB發(fā)酵液體培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)至OD6tltl=0.6后降溫至20°C培養(yǎng)，加入IPTG (異丙基硫代β D半乳糖苷，終濃度為0.1mM)誘導(dǎo)，72h時(shí)離心收集上清，上清酶活為最高可達(dá)720U/ml。電泳圖見圖2，表觀分子量46kDa。
【權(quán)利要求】
1.一種角蛋白酶，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示或在SEQ ID N0.2基礎(chǔ)上通過缺失、突變、重組獲得的具有角蛋白酶活性的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述角蛋白酶的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQID N0.1所示或根據(jù)角蛋白酶氨基酸缺失、突變、重組情況，人工設(shè)計(jì)的核苷酸序列。
3.表達(dá)權(quán)利要求1所述角蛋白酶的基因工程菌或細(xì)胞系。
4.含有權(quán)利要求2所述角蛋白酶基因的表達(dá)載體或克隆載體。
5.生產(chǎn)權(quán)利要求1所述角蛋白酶的方法，其特征在于包括如下步驟: 1)采用化學(xué)全合成或PCR方法獲得SEQID N0.1所示核苷酸序列； 2)克隆SEQID N0.1所示核苷酸序列到pET22b (+)表達(dá)載體； 3)將步驟2)獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)獲得表達(dá)角蛋白酶的基因工程菌； 4)將步驟3)獲得的基因工程菌在含有ΙΟΟμg/Ι的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37°C液體培養(yǎng)過夜，后接入含有l(wèi)OOyg/l的氨芐青霉素的LB發(fā)酵液體培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)至OD600nm=0.6，降溫至20°C培養(yǎng)，加入最終濃度0.1mM的誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)，72h時(shí)離心獲得上清酶液，即為粗酶液。
6.權(quán)利要求1所述角蛋白酶在處理羽毛中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求2所述蛋白酶基因在角蛋白處理中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N9/52GK103589705SQ201310522569
【公開日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月29日
【發(fā)明者】陳堅(jiān), 方真, 張娟, 堵國(guó)成, 劉柏宏 申請(qǐng)人:江南大學(xué)