將四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯應(yīng)用于精子分離的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及精子的分離【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及將四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯應(yīng)用于精子分離，包括：向待分離的精液中加入熒光染料和染色用工作液，再孵育，得到混合液，其中，熒光染料為四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯，并且待分離的精液中每含4億個(gè)精子時(shí)，至少加入7μg熒光染料；采用流式細(xì)胞儀對混合液進(jìn)行分離，得到分離的X精子和Y精子。本發(fā)明上提供的將四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯應(yīng)用于精子分離，當(dāng)待分離的精液密度較高需采用高濃度的熒光染料時(shí)，也不會(huì)發(fā)生熒光猝滅的現(xiàn)象，從而避免了對分離效果的不利影響。
【專利說明】將四溴化1, 1, 2, 2-四-[4- (2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙
烯應(yīng)用于精子分離
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及精子的分離【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及將四溴化1，I, 2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯應(yīng)用于精子分離。
【背景技術(shù)】
[0002]流式細(xì)胞儀分離動(dòng)物X精子和Y精子，是動(dòng)物性別控制的一條新途徑，其工作原理是:利用動(dòng)物含有X染色體和含有Y染色體的精液中DNA含量存在差異，借助熒光染料染色，然后根據(jù)發(fā)出的熒光強(qiáng)度，通過計(jì)算機(jī)判別精子類別，再通過給精液液滴附加電荷，根據(jù)靜電原理，將含有X染色體的精液和Y染色體的精液分離。
[0003]在相關(guān)技術(shù)中，上述方法常用的熒光染料易發(fā)生聚集熒光猝滅現(xiàn)象:當(dāng)染料的濃度較高時(shí)，染料分子會(huì)聚集進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)射的熒光強(qiáng)度驟降。當(dāng)待分離的精液密度較高時(shí)，此時(shí)需要較高濃度的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，但是高濃度的染料分子會(huì)發(fā)生聚集，進(jìn)而發(fā)生聚集熒光猝滅，導(dǎo)致精子的分離效果不理想。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供將四溴化1，I, 2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯應(yīng)用于精子分離，以解決上述的問題。
[0005]在本發(fā)明的實(shí)施例中提供了將四溴化1，1，2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯應(yīng)用于精子分離，包括下列步驟:
[0006]向待分離的精液中加入熒光染料和染色用工作液，再孵育，得到混合液；其中，所述熒光染料為四溴化1，1,2, 2-四-[`4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯，并且所述待分離的精液中每含4億個(gè)精子時(shí)，至少加入7 μ g所述熒光染料；
[0007]采用流式細(xì)胞儀對所述混合液進(jìn)行分離，得到分離的X精子和Y精子。
[0008]本發(fā)明上述實(shí)施例的將四溴化1，1，2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯應(yīng)用于精子分離，所用的熒光染料一四溴化1，1,2, 2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯(即TTAPE)是一種具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光現(xiàn)象的分子，即當(dāng)熒光染料濃度較大或者聚集時(shí)，熒光染料分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)被凍結(jié)或者形成聚集體使其熒光發(fā)射顯著增大，其靈敏度高、背景噪音低。因而當(dāng)待分離的精液密度較高需采用高濃度的熒光染料時(shí)，也不會(huì)發(fā)生熒光猝滅的現(xiàn)象，從而避免了對分離效果的不利影響。其中，TTAPE在本發(fā)明的應(yīng)用中發(fā)射熒光的原理是=TTAPE與DNA的靜電相互作用而結(jié)合，由于與DNA的結(jié)合，限制了分子間轉(zhuǎn)動(dòng)，致使其發(fā)熒光。
【具體實(shí)施方式】
[0009]下面通過具體的實(shí)施例子對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0010]實(shí)施例一[0011]該實(shí)施例提供了將四溴化1，1，2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯應(yīng)用于精子分離，包括下列步驟:
[0012]第一步:向待分離的精液中加入熒光染料和染色用工作液(staining talp)，再孵育，得到混合液。
[0013]第二步:采用流式細(xì)胞儀對混合液進(jìn)行分離，得到分離的X精子和Y精子。
[0014]其中，熒光染料為四溴化1，1，2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯，并且待分離的精液中每含4億個(gè)精子時(shí)，至少加入7 μ g熒光染料。
[0015]以上應(yīng)用所用的熒光染料為四溴化1，1，2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯(即TTAPE)，其是一種具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光現(xiàn)象的分子，即當(dāng)熒光染料濃度較大或者聚集時(shí)，熒光染料分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)被凍結(jié)或者形成聚集體使其熒光發(fā)射顯著增大，其靈敏度高、背景噪音低。因而當(dāng)待分離的精液密度較高需采用高濃度的熒光染料時(shí)，也不會(huì)發(fā)生熒光猝滅的現(xiàn)象，從而避免了對分離效果的不利影響。由此可見，TTAPE可替代現(xiàn)有技術(shù)中用于分離精子的其它染色體，采用一種新型的發(fā)光原理一聚集誘導(dǎo)發(fā)光進(jìn)行檢測。
[0016]另外，上述應(yīng)用還具有另外的一個(gè)優(yōu)點(diǎn):由于TTAPE在光源的照射下不會(huì)發(fā)生猝滅現(xiàn)象，因此上述應(yīng)用中的所有步驟不需要在避光條件下操作。由此可見，本發(fā)明的應(yīng)用降低了對操作條件的要求，更易推廣。
[0017]其中，TTAPE在本發(fā)明的應(yīng)用中發(fā)射熒光的原理是=TTAPE與DNA的靜電相互作用而結(jié)合，由于與DNA的結(jié)合，限制了分子間轉(zhuǎn)動(dòng)，致使其發(fā)熒光。
[0018]上述應(yīng)用中所用的熒光染料TTAPE通常采用如下的制備方法:
[0019]第一步:DHBP(4，4’二羥基二苯酮)3克和碳酸鉀5克，50mL丙酮加入到4mLl，2-二溴乙烷中，將混合物以回流方式`攪拌、加熱24小時(shí)，過濾，蒸干溶劑。粗產(chǎn)物用硅膠柱(氯仿)得到4，4’ - 二羥基苯丙酮(BBEBP)白色粉末。產(chǎn)物經(jīng)過紅外和核磁測試的驗(yàn)證。
[0020]第二步:1克BBEBP在50mL四氫呋喃(THF)懸浮液中，加入四氯化鈦0.26mL和鋅粉0.31克，沸騰20小時(shí)，反應(yīng)混合物冷卻到室溫，過濾。真空干燥，溶劑揮發(fā)，粗產(chǎn)物過硅膠柱(氯仿/環(huán)己烷1:4)。產(chǎn)物經(jīng)過紅外和核磁共振光譜測試。
[0021]第三步:在250mL燒瓶中，磁力攪拌，溶解100mgl，l，2，2-四-(溴乙氧基)四苯乙烯(TBEPE)在IOOmLTHF中，然后加入過量的三乙基胺(5mL)，保持回流3天。在此過程中，間斷加入IOmL水，減壓蒸餾，水溶液用氯仿洗三次，溶劑揮發(fā)之后真空50°C干燥得到TTAPE。
[0022]上述制備方法的化學(xué)反應(yīng)式如下，“reflux”是指回流，“Et3N”是指三乙胺:
[0023]
【權(quán)利要求】
1.將四溴化1，1，2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯應(yīng)用于精子分離，其特征在于，包括下列步驟: 向待分離的精液中加入熒光染料和染色用工作液，再孵育，得到混合液，其中，所述熒光染料為四溴化1，1,2, 2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯，并且所述待分離的精液中每含4億個(gè)精子時(shí)，至少加入7 μ g所述熒光染料； 采用流式細(xì)胞儀對所述混合液進(jìn)行分離，得到分離的X精子和Y精子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的將四溴化1，1，2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯應(yīng)用于精子分離，其特征在于 ，所述孵育的時(shí)間為:
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3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的將四溴化1，1，2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯應(yīng)用于精子分離，其特征在于，所述待分離的精液為:活力>0.6，密度> 10億/mL的精液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的將四溴化1，1，2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯應(yīng)用于精子分離，其特征在于，所述孵育的步驟之后和所述分離的步驟之前還包括: 向所述混合液中加入蛋黃工作液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的將四溴化1，1，2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯應(yīng)用于精子分離，其特征在于，所述向待分離的精液中加入熒光染料和染色用工作液的步驟之前還包括: 向所述待分離的精液中加入抗生素。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的將四溴化1，1，2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯應(yīng)用于精子分離，其特征在于，所述向待分離的精液中加入熒光染料和染色用工作液的步驟之前還包括: 在30-35 °C下將所述熒光染料和所述染色用工作液預(yù)熱。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的將四溴化1，I,2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯應(yīng)用于精子分離，其特征在于，所述向所述混合液中加入蛋黃工作液的步驟之前還包括: 在30-35°C下將所述蛋黃工作液預(yù)熱。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的將四溴化1，1，2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯應(yīng)用于精子分離，其特征在于，所述向待分離的精液中加入熒光染料和染色用工作液的步驟之前還包括: 用孔徑為45-55 μ m的過濾器過濾所述待分離的精液。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的將四溴化1，I,2，2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯應(yīng)用于精子分離，其特征在于，所述向所述混合液中加入蛋黃工作液的步驟之后和所述分離的步驟之前還包括: 用孔徑為45-55 μ m的過濾器過濾混合液。
【文檔編號】C12N5/076GK103555662SQ201310530972
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月31日
【發(fā)明者】于建香, 帥志強(qiáng), 蘇冠宇, 武光明, 姚天宇 申請人:大連金弘基種畜有限公司, 北京石油化工學(xué)院