檢測(cè)基因表達(dá)量的引物、探針和試劑盒、及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)基因表達(dá)量的引物、探針和試劑盒、及其使用方法，本發(fā)明還公開了包括有該引物、探針的試劑盒及其使用方法。所述引物序列如SEQ?ID?NO:1～SEQ?ID?NO:8所示，所述探針序列如SEQ?ID?NO:11～SEQ?ID?NO:14所示，所述試劑盒包括有上述引物和探針、內(nèi)參基因的引物和探針、實(shí)時(shí)熒光定量PCR?MIX反應(yīng)液、去離子水、分隔并集中包裝這些試劑的瓶或管以及包裝盒。本發(fā)明可以對(duì)上述四個(gè)基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)面廣，檢測(cè)流程簡(jiǎn)單快捷，有助于醫(yī)生對(duì)患者的用藥策略進(jìn)行綜合分析、判斷。
【專利說明】檢測(cè)基因表達(dá)量的引物、探針和試劑盒、及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及基因檢測(cè)的引物、探針和試劑盒，尤其涉及一種檢測(cè)ERCCl、RRMl、TUBB3、TYMS基因表達(dá)量的引物、探針和試劑盒、使用方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著醫(yī)學(xué)研究和藥物研發(fā)水平不斷進(jìn)步，越來越多的治療腫瘤類藥物被開發(fā)出來，但是，一些患者在使用某些藥物進(jìn)行治療時(shí)效果并不理想，表現(xiàn)為腫瘤對(duì)藥物敏感度低，耐藥性強(qiáng)等，研究表明這一現(xiàn)象與人體內(nèi)的某些基因過表達(dá)有關(guān)。
[0003]鉬類藥物是最常用的腫瘤化療藥物之一，它主要通過引起腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA的交聯(lián)形成加合物，阻礙DNA合成與復(fù)制，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。ERCCl是核酸切除修復(fù)系統(tǒng)NER (nucleotide excision repair)的一個(gè)關(guān)鍵基因，NER可以切除加合物并修復(fù)被損傷的DNA，從而降低化療效果，因此，ERCCl在mRNA中的高表達(dá)與鉬類藥物的耐藥性有關(guān)。
[0004]吉西他濱是臨床上用來治療非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌及其他實(shí)體腫瘤的一種抗腫瘤藥物，藥物進(jìn)入細(xì)胞后，可通過一系列的磷酸激酶活化，生成三磷酸核苷類似物，與DNA合成的底物競(jìng)爭(zhēng)從而摻入DNA鏈，中斷DNA的合成。臨床研究表明，RRMl基因的表達(dá)水平與吉西他濱療效負(fù)相關(guān)，RRMlmRNA表達(dá)水平低的非小細(xì)胞肺癌患者，在接受吉西他濱和鉬類藥物聯(lián)合化療后有較好的應(yīng)答，其中位總生存期也比RRMlmRNA表達(dá)水平高的患者長(zhǎng)，此外，RRMl在胰腺癌中的高表達(dá)也會(huì)導(dǎo)致患者對(duì)吉西他濱產(chǎn)生抗性，美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)非小細(xì)胞肺癌臨床實(shí) 踐指南(2011)已經(jīng)將RRMl表達(dá)水平作為治療的預(yù)測(cè)生物標(biāo)記，因此，檢測(cè)RRMl表達(dá)水平對(duì)于預(yù)測(cè)吉西他濱的療效是非常必要的，RRMl表達(dá)水平低的患者采用吉西他濱為主的化療療效較好。
[0005]抗微管類化療藥物是作用于細(xì)胞微管，通過影響紡錘體形成，從而抑制細(xì)胞有絲分裂的一類光譜化療藥，細(xì)胞內(nèi)微管蛋白分為α、β兩個(gè)亞型，是細(xì)胞骨架的中藥組成部分，是有絲分裂時(shí)紡錘體的基本組成單位，也是抗微管藥物的主要作用靶點(diǎn)。據(jù)研究顯示，TUBB3基因編碼的β-Tubulin-111(3型β微管蛋白)與抗微管化療藥敏感性的關(guān)系最密切，低TUBB3mRNA表達(dá)水平的腫瘤患者接受抗微管類藥物化療的效果較好，中位生存期較長(zhǎng)，反之，高TUBB3mRNA表達(dá)水平的腫瘤患者的抗微管類藥物化療療效較差。
[0006]氟類藥物是尿嘧啶的氟代衍生物，可在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)?-氟尿嘧啶脫氧核苷酸(5F-dUMP)，從而抑制脫氧核苷酸合成酶，阻止脫氧核苷酸(dUMP)甲基化為脫氧胸苷酸(dTMP)，進(jìn)而影響DNA的合成，另外，也能摻入RNA中干擾蛋白質(zhì)的合成，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。TYMS (Thymidylate Synthetase)基因編碼的胸苷酸合成酶(TS)是嘧唳核苷酸合成的限速酶，是腫瘤生長(zhǎng)的重要因子，同時(shí)它是氟類藥物在體內(nèi)作用發(fā)揮細(xì)胞毒作用的目標(biāo)酶，氟類藥物在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為5-FU，5-FU的代謝物與TS結(jié)合，阻礙TS的正常功能，從而抑制DNA合成。眾多臨床研究結(jié)果都顯示TYMS基因的mRNA表達(dá)水平與氟類藥物療效密切相關(guān)，低TYMS mRNA表達(dá)水平的腫瘤患者接受氟類藥物化療的效果較好，反之，TYMS高表達(dá)的患者接受氟類藥物化療的效果較差。[0007]上述研究結(jié)果都表明，在一線治療的惡性腫瘤患者中檢測(cè)ERCC1、RRMU TUBB3和TYMS基因的表達(dá)量具有重要的臨床意義，是正確對(duì)患者用藥治療的先決條件。
[0008]過去對(duì)上述四個(gè)基因表達(dá)量的檢測(cè)方法主要通過Nothern blot法，該方法需要提取RNA，使用瓊脂糖凝膠電泳，將分子量大小不同的RNA分離開來，隨后將其原位轉(zhuǎn)移至固相支持物上，再用放射性(或非放射性)標(biāo)記的DNA或RNA探針，依據(jù)其同源性進(jìn)行雜交，最后進(jìn)行放射自顯影(或化學(xué)顯影)，以目標(biāo)RNA所在位置標(biāo)示其分子量的大小，以顯影強(qiáng)度提示目標(biāo)RNA在所測(cè)樣品中的相對(duì)含量。這個(gè)方法繁瑣費(fèi)時(shí)，而且對(duì)RNA要求較高，并且RNA非常容易降解，致使結(jié)果不穩(wěn)定，靈敏度不高，需要的樣本RNA量非常大才能保證檢測(cè)結(jié)果。
[0009]目前實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)蓬勃發(fā)展，它是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了 PCR的定量檢測(cè)，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)ERCCl、RRMl、TUBB3和TYMS基因表達(dá)量的引物和探針，本發(fā)明還公開了包括有該引物、探針的試劑盒及其使用方法。
[0011]本申請(qǐng)的發(fā)明人在GenBank檢索ERCCl、RRMl、TUBB3和TYMS基因的信息，根據(jù)檢索到的基因編碼序列，在基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針，其中探針的兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)(R)和熒光淬滅基團(tuán)(Q)，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增來快速檢測(cè)待測(cè)樣本中ERCC1、RRMUTUBB3和TYMS基因的表達(dá)情況，可以準(zhǔn)確、快速、靈敏地檢測(cè)出ERCCl、RRMl、TUBB3和TYMS基因的表達(dá)量。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，提供了一種用于檢測(cè)ERCCl、RRMl、TUBB3和TYMS基因表達(dá)量的引物和探針，所述引物序列如下:
[0013]SEQ ID N0:15’-ATGGCCCTCACGGAGTTTTGT-3’
[0014]SEQ ID N0:25’-CATCTGGGCACTGAAAGGGA-3’
[0015]SEQ ID N0:35’-ACTAGCTGATGCATGTGA-3’
[0016]SEQ ID N0:45’-TCCATAACAAATTCTGGATTCG-3’
[0017]SEQ ID N0:55’-GCGGGAGGGATTTGGATT-3’
[0018]SEQ ID N0:65，-GGAAGGGTGGTTCCAGGC-3，
[0019]SEQ ID N0:75’-GAGGCGGTGGAGCACATTT-3’
[0020]SEQ ID N0:85，-CGTTTGTTGTGAGCAGAGG-3，
[0021]所述探針兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)，所述探針的序列如下，其中，R表不突光報(bào)告基團(tuán)，Q表不突光淬滅基團(tuán):
[0022]SEQ ID NO: 115，-R-ACGCCCTAGCTCACTCCCCT-Q-3 ’
[0023]SEQ ID NO: 125’-R-GCCGCCAAGAAAGTCATGTTTGA-Q-3’
[0024]SEQ ID NO: 135，-R-AAAGTTGTCTGGCTCCAA-Q-3’
[0025]SEQ ID NO: 145’-R-CTGGCACCTGTCGGTGTT-Q-3’。[0026]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，還提供了一種用于檢測(cè)ERCCl、RRMl、TUBB3和TYMS基因表達(dá)量的試劑盒，其主要包括:
[0027]DERCCU RRMU TUBB3和TYMS基因檢測(cè)的引物和探針，其中，引物序列如SEQ IDNO:1 ~SEQ ID NO:8 所示，探針序列如 SEQ ID NO: 11 ~SEQ ID NO: 14 所示；
[0028]2)內(nèi)參基因的引物和探針；優(yōu)選的，內(nèi)參基因?yàn)锳TCB基因，該基因的引物序列如SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10所示，探針序列如SEQ ID NO: 15所示，所述探針兩端分別標(biāo)
記熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。
[0029]3) ATCB、ERCC1、RRM1、TUBB3和TYMS基因的標(biāo)準(zhǔn)品，所述標(biāo)準(zhǔn)品為分別含有ATCB、ERCCl、RRMl、TUBB3和TYMS基因編碼序列的重組質(zhì)粒載體；
[0030]其中，ATCB基因編碼序列的GenBank編號(hào)為ΝΜ_001101.3，ERCCl基因編碼序列的GenBank編號(hào)為ΝΜ_202001.2，RRMl基因編碼序列的GenBank編號(hào)為ΝΜ_001033.3，TUBB3基因編碼序列的GenBank編號(hào)為ΝΜ_001033.3，TYMS基因編碼序列的GenBank編號(hào)為 ΝΜ_021288.4 ；
[0031]4)實(shí)時(shí)熒光定量PCR MIX反應(yīng)液、去離子水；
[0032]5)分隔并集中包裝上述試劑的瓶或管以及包裝盒。
[0033]其中，上述引物和探針的濃度均為5~ΙΟμπιοΙ/L。
[0034]其中，步驟3)所 述的含有ATCB、ERCCl、RRMl、TUBB3和TYMS基因序列質(zhì)粒載體的空載體為PGEM-T載體。
[0035]其中，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR MIX反應(yīng)液為本領(lǐng)域常規(guī)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR MIX反應(yīng)液；優(yōu)選的，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR MIX反應(yīng)液為Takara公司的PrimeSCriptTMRTMaster Mix。
[0036]本發(fā)明的引物、探針和試劑盒的使用方法，包括以下步驟:
[0037](I)按照常規(guī)方法從待測(cè)樣品中提取樣品總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA ；
[0038](2)分別將已知拷貝數(shù)的ATCB、ERCCU RRMU TUBB3和TYMS基因標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋至 IO6、105、IO4、103、IO2 拷貝數(shù) / μ I ;
[0039](3)分別以步驟(1)所得的cDNA和以步驟(2)梯度稀釋的基因標(biāo)準(zhǔn)品為模板，加入引物、探針、實(shí)時(shí)熒光定量PCR MIX反應(yīng)液、去離子水建立反應(yīng)體系；
[0040]其中，針對(duì)ERCCl基因的檢測(cè)使用的引物序列如SEQ ID Ν0:1和SEQ ID Ν0:2所示，探針序列如所示SEQ ID NO: 11 ；
[0041]針對(duì)RRMl基因的檢測(cè)使用的引物序列如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示，探針序列如所示SEQ ID NO: 12 ；
[0042]針對(duì)TUBB3基因的檢測(cè)使用的引物序列如SEQ ID Ν0:5和SEQ ID Ν0:6所示，探針序列如所示SEQ ID NO: 13 ；
[0043]針對(duì)TYMS基因的檢測(cè)使用的引物序列如SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8所示，探針序列如所示SEQ ID NO: 14 ；
[0044]針對(duì)內(nèi)參基因ATCB使用的引物序列如SEQ ID Ν0:9和SEQ ID NO: 10所示，探針序列如所示SEQ ID NO: 15 ；
[0045](4)使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，按照常規(guī)操作方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增；
[0046](5)分析檢測(cè)結(jié)果:由于模板的循環(huán)閾值與該模板的初始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，將各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的初始拷貝數(shù)取對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，將其所對(duì)應(yīng)的循環(huán)閾值為縱坐標(biāo)，做出相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測(cè)cDNA的循環(huán)閾值對(duì)其含有的目標(biāo)基因的初始拷貝數(shù)進(jìn)行分析，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取其含有的目標(biāo)基因的初始拷貝數(shù)。
[0047]通過以上技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果如下:
[0048](I)可對(duì)ERCC1、RRM1、TUBB3和TYMS這四個(gè)基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)面廣，真實(shí)反映出患者體內(nèi)這幾個(gè)基因的表達(dá)情況，有助于醫(yī)生對(duì)患者的用藥策略進(jìn)行綜合分析、判斷。
[0049](2)檢測(cè)流程簡(jiǎn)單快捷，價(jià)格低廉，檢測(cè)敏感性高，可直接、快速地判斷檢測(cè)結(jié)果，在第一時(shí)間得到臨床所需資料。【具體實(shí)施方式】
[0050]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步描述，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。[0051 ] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0052]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0053]實(shí)施例用于檢測(cè)ERCCl、RRMl、TUBB3和TYMS基因表達(dá)量的試劑盒及其使用
[0054]1.該用于檢測(cè)ERCCl、RRMl、TUBB3和TYMS基因表達(dá)量的試劑盒中裝有:
[0055]⑴用于檢測(cè)ERCCl、RRMl、TUBB3和TYMS基因的引物和探針，引物序列如SEQ IDNO:1~SEQ ID N0:8所示，探針的序列如SEQ ID NO: 11~SEQ ID NO: 14，所述探針兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)；上述引物和探針的濃度均為5μπι01/1。
[0056](2)內(nèi)參基因ATCB的引物和探針，引物序列如SEQ ID Ν0:9和SEQ ID NO: 10所示，探針序列如SEQ ID NO: 15，所述探針兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)；上述引物和探針的濃度均為5ymol/L。
[0057](3) ATCB、ERCCl、RRMl、TUBB3和TYMS基因的標(biāo)準(zhǔn)品，所述標(biāo)準(zhǔn)品為分別含有ATCB、ERCCURRMUTUBB3和TYMS基因編碼序列的重組質(zhì)粒載體；所述載體的空載體為pGEM_T載體。
[0058]其中，ATCB基因編碼序列的GenBank編號(hào)為NM_001101.3，ERCCl基因編碼序列的GenBank編號(hào)為ΝΜ_202001.2，RRMl基因編碼序列的GenBank編號(hào)為ΝΜ_001033.3，TUBB3基因編碼序列的GenBank編號(hào)為ΝΜ_001033.3，TYMS基因編碼序列的GenBank編號(hào)為 ΝΜ_021288.4 ；
[0059](4)實(shí)時(shí)熒光定量PCR MIX反應(yīng)液、去離子水；所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR Mix反應(yīng)液為 Takara 公司的 PrimeScript?RT Master Mix。
[0060]2.試劑盒的使用方法如下:
[0061 ] ⑴從石蠟切片組織樣品中提取總RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA
[0062]將石蠟包埋的組織切成5 - 10 μ m的薄片后置于1.5ml離心管中，使用二甲苯脫蠟，再加入無水乙醇處理，室溫晾干直至殘留的乙醇已揮發(fā)完全，再用真空干燥儀45度15分鐘干燥，干燥組織經(jīng)蛋白酶K消化及加入Trizol，氯仿抽提得到RNA，收集純凈RNA可直接用來反轉(zhuǎn)錄，也可保存于_20°C或者_(dá)80°C ；
[0063]以提取到的總RNA作為模板，使用隨機(jī)六聚體引物和逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。所有操作均在冰上進(jìn)行；在0.2ml Eppendorf管內(nèi)加入以下反應(yīng)體系--總RNA5 μ g，隨機(jī)六聚體引物I μ 1，RNase free水至總體積12 μ 1，離心混勻后，70°C反應(yīng)5分鐘，立即置于冰上冰浴5分鐘；依次加入以下各成分，5XReaction Buffer4 μ I, IOmM dNTP Mix2 μ I, RNA酶抑制劑(20ιι/μ 1)1μ 1，稍離心混勻各成分，37°C反應(yīng)5分鐘；加逆轉(zhuǎn)錄酶(200u/μ I) I μ 1，42V反應(yīng)60分鐘；72°C 10分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。迅速置于冰浴中5分鐘，即得cDNA，-20°C保存。
[0064](2)分別將已知拷貝數(shù)的ATCB、ERCCU RRMU TUBB3和TYMS基因標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋至 IO6、105、IO4、103、IO2 拷貝數(shù) / μ I ;
[0065](3)分別以步驟(1)所得的cDNA和以步驟(2)梯度稀釋的基因標(biāo)準(zhǔn)品為模板，加入引物、探針、實(shí)時(shí)熒光定量PCR MIX反應(yīng)液、去離子水建立反應(yīng)體系；
[0066]其中，針對(duì)ERCCl基因的檢測(cè)使用的引物序列如SEQ ID Ν0:1和SEQ ID Ν0:2所示，探針序列如所示SEQ ID NO: 11 ；
[0067]針對(duì)RRMl基因的檢測(cè)使用的引物序列如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示，探針序列如所示SEQ ID NO: 12 ；
[0068]針對(duì)TUBB3基因的檢測(cè)使用的引物序列如SEQ ID Ν0:5和SEQ ID Ν0:6所示，探針序列如所示SEQ ID NO: 13 ；
[0069]針對(duì)TYMS基因的檢測(cè)使用的引物序列如SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8所示，探針序列如所示SEQ ID NO: 14 ；
[0070]針對(duì)內(nèi)參基因ATCB使用的引物序列如SEQ ID Ν0:9和SEQ ID NO: 10所示，探針序列如所示SEQ ID NO: 15 ；
[0071]反應(yīng)體系如下:
[0072]
【權(quán)利要求】
1.一種引物和探針，其特征在于，所述引物的序列如下:
SEQ ID NO:15’ -ATGGCCCTCACGGAGTTTTGT-3’
SEQ ID NO:25’ -CATCTGGGCACTGAAAGGGA-3’
SEQ ID NO:35’ -ACTAGCTGATGCATGTGA-3’
SEQ ID NO:45’ -TCCATAACAAATTCTGGATTCG-3’
SEQ ID NO:55’ -GCGGGAGGGATTTGGATT-3’
SEQ ID NO:65’ -GGAAGGGTGGTTCCAGGC-3’
SEQ ID NO:75’ -GAGGCGGTGGAGCACATTT-3’
SEQ ID NO:85’ -CGTTTGTTGTGAGCAGAGG-3’ 所述探針兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)，所述探針的序列如下，其中，R表不突光報(bào)告基團(tuán)，Q表不突光淬滅基團(tuán):
SEQ ID NO: 115’ -R-ACGCCCTAGCTCACTCCCCT-Q-3’
SEQ ID NO:125’ -R-GCCGCCAAGAAAGTCATGTTTGA-Q-3’
SEQ ID NO:135’ -R-AAAGTTGTCTGGCTCCAA-Q-3’
SEQ ID NO:145’ -R-CTGGCACCTGTCGGTGTT-Q-3’。
2.一種包括有權(quán)利要求1所述的引物和探針的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括: DERCCU RRMU TUBB3和TYMS基因檢測(cè)的引物和探針，其中，引物序列如SEQ IDNO:1 ~SEQ ID NO:8 所示，探針序列如 SEQ ID NO: 11 ~SEQ ID NO: 14 所示； 2)內(nèi)參基因的引物和探針； 3)內(nèi)參基因、ERCC1、RRMUTUBB3和TYMS基因的標(biāo)準(zhǔn)品，所述標(biāo)準(zhǔn)品為分別含有內(nèi)參基因、ERCCl、RRMl、TUBB3和TYMS基因編碼序列的重組質(zhì)粒載體； 4)實(shí)時(shí)熒光定量PCRMIX反應(yīng)液、去離子水； 5)分隔并集中包裝上述試劑的瓶或管以及包裝盒。
3.按照權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于:所述內(nèi)參基因?yàn)锳TCB基因，所述ATCB基因的引物序列如SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10所示，探針序列如SEQ ID NO: 15所示，所述探針兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。
4.按照權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于:引物和探針的濃度均為5~10μ mol/L0
5.按照權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于:步驟3)所述的含有內(nèi)參基因、ERCCURRMUTUBB3和TYMS基因序列質(zhì)粒載體的空載體為pGEM_T載體。
6.按照權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于:所述實(shí)時(shí)熒光定量PCRMIX反應(yīng)液為Takara 公司的 PrimeScript?RT Master Mix。
7.權(quán)利要求1所述引物和探針的使用方法，包括以下步驟: (O按照常規(guī)方法從待測(cè)樣品提取樣品總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA ； (2)分別將已知拷貝數(shù)的ATCB、ERCC1、RRM1、TUBB3和TYMS基因標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋至106、IO5UO4UO3UO2 拷貝數(shù)/μ I ； (3)分別以步驟(1)所得的cDNA和以步驟(2)梯度稀釋的基因標(biāo)準(zhǔn)品為模板，加入引物、探針、實(shí)時(shí)熒光定量PCR MIX反應(yīng)液和去離子水建立反應(yīng)體系； 其中，針對(duì)ERCCl基因的檢測(cè)使用的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2所示，探針序列如SEQ ID NO: 11所示； 針對(duì)RRMl基因的檢測(cè)使用的引物序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示，探針序列如 SEQ ID NO: 12 所示； 針對(duì)TUBB3基因的檢測(cè)使用的引物序列如SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示，探針序列如SEQ ID NO: 13所示； 針對(duì)TYMS基因的檢測(cè)使用的引物序列如SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8所示，探針序列如 SEQ ID NO: 14 所示； 針對(duì)ATCB使用的引物序列如SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10所示，探針序列如SEQ IDNO: 15所示； (5)使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，按照常規(guī)操作方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增； (6)分析檢測(cè)結(jié)果。
8.按照權(quán)利要求1所述的引物和探針在檢測(cè)ERCC1、RRMUTUBB3、TYMS基因表達(dá)量中的應(yīng)用。
9.按照權(quán)利要 求2~6中任一所述試劑盒在檢測(cè)ERCCl、RRMl、TUBB3、TYMS基因表達(dá)量中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103602672SQ201310537253
【公開日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月4日
【發(fā)明者】李艷春, 侯然, 程宇, 劉曉峰, 朱立文, 梁超, 王緒華, 方國(guó)偉, 黃士昂, 陳忠 申請(qǐng)人:北京海思特臨床檢驗(yàn)所有限公司