用于檢測(cè)egfr基因熱點(diǎn)突變的引物、試劑盒和檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于檢測(cè)EGFR基因熱點(diǎn)突變的引物、試劑盒和檢測(cè)方法，所述引物序列如SEQ?ID?NO:1～SEQ?ID?NO:9所示，所述試劑盒包括有上述引物、PCR?MIX反應(yīng)液、針對(duì)不同突變進(jìn)行酶切的限制性內(nèi)切酶、BSA溶液、酶切緩沖液、陰性對(duì)照品、陽(yáng)性對(duì)照品、去離子水、分隔并集中包裝這些試劑的瓶或管以及包裝盒。本發(fā)明可以外周血為樣品，對(duì)EGFR基因三個(gè)最常見(jiàn)的熱點(diǎn)突變進(jìn)行快速檢測(cè)，檢測(cè)敏感性高、費(fèi)時(shí)短，可在第一時(shí)間得到臨床所需資料。
【專利說(shuō)明】用于檢測(cè)EGFR基因熱點(diǎn)突變的引物、試劑盒和檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及基因突變檢測(cè)引物和試劑盒，尤其涉及一種用于檢測(cè)EGFR基因熱點(diǎn)突變的引物、試劑盒和檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermalgrowth factor receptor, EGFR)是一種跨膜受體酪氨酸激酶，屬于受體酪氨酸激酶(tyrosine kinase, TK) erbB / HER家族的一個(gè)成員，EGFR的激活即磷酸化對(duì)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)化、存活、血管生成及轉(zhuǎn)移具有重要意義，研究表明，EGFR在許多惡性腫瘤中過(guò)高表達(dá)。
[0003]近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)的發(fā)展，分子靶向治療作為惡性腫瘤治療的新手段，正日益受到臨床工作者們的重視，因此，EGFR作為惡性腫瘤治療的分子靶標(biāo)而受到普遍關(guān)注。目前已開(kāi)發(fā)出了吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)等表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinases inhibitor,EGFR-TKI )，然而在臨床中，有些患者對(duì)EGFR-TKI的治療并不敏感或?qū)υ擃愃幬锂a(chǎn)生耐藥，故對(duì)EGFR-TKI耐藥機(jī)制的探索成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。
[0004]研究表明，這些靶向藥物的敏感性及耐藥性與腫瘤細(xì)胞EGFR突變密切相關(guān)。目前，在約半數(shù)耐藥患者中發(fā)現(xiàn)了 EGFR第20外顯子T790M (T790M，threonine atposition790)突變；而EGFR第19號(hào)外顯子內(nèi)缺失突變和第21外顯子L858R突變則使突變細(xì)胞對(duì)藥物親和力增高，作用時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)EGFR-TKI的敏感性增高。因此，在一線治療的惡性腫瘤患者中檢測(cè)EGFR基因突變具有重要的臨床意義，是決定患者是否能夠應(yīng)用EGFR-TKI治療的先決條件。
[0005]目前檢測(cè)EGFR突變主要通過(guò)直接測(cè)序法，該方法需要取得腫瘤組織標(biāo)本，通過(guò)石蠟組織DNA提取，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序，最后對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。這個(gè)方法對(duì)石蠟包埋組織標(biāo)本要求高，要求標(biāo)本中腫瘤組織含量達(dá)20%以上，檢測(cè)敏感度低，檢測(cè)流程復(fù)雜繁瑣，對(duì)數(shù)據(jù)分析要求高，且目前無(wú)商用試劑盒，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的儀器配備要求也較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)EGFR基因熱點(diǎn)突變的引物，本發(fā)明還公開(kāi)了包括有該引物的試劑盒及其使用方法。
[0007]本申請(qǐng)的發(fā)明人根據(jù)EGFR基因的第19號(hào)外顯子內(nèi)缺失突變(EX0N19缺失突變)、第20外顯子T790M突變(EX0N20T790M)和第21外顯子L858R突變(EX0N21L858R)設(shè)計(jì)并合成了特異性引物，以外周血為樣本提取基因組DNA，可以快速檢測(cè)EGFR基因中這三處熱點(diǎn)突變，檢測(cè)敏感度高，可更高效地篩查出適宜EGFR-TKI治療方案的惡性腫瘤患者。
[0008]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，提供了一種用于檢測(cè)EGFR基因熱點(diǎn)突變的引物，所述引物序列如下:
[0009]SEQ ID NO:1 5’-ATCCCAGAAGGTGAGAAAGATAAAATTC-3’[0010]SEQ ID NO:2 5’ -CCTGAGGTTCAGAGCCATGGA-3’
[0011]SEQ ID NO:3 5，-AGAGCCATGGACCCCCACAC-3，
[0012]SEQ ID NO:4 5’ -CGAAGCCACACTGACGTGC-3’
[0013]SEQ ID NO:5 5，-CGAAGGGCATGAGCCGC-3，
[0014]SEQ ID NO:6 5’ -CCTCCAGGAAGCCTACGTGA-3’
[0015]SEQ ID NO:7 5’ -CAGCCAGGAACGTACTGGTGA-3’
[0016]SEQ ID NO:8 5’ -TCCCTGGTGTCAGGAAAATGCT-3’
[0017]SEQ ID NO:9 5’ -CGCAGCATGTCAAGATCACAGAT-3’。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，還提供了一種用于檢測(cè)EGFR基因熱點(diǎn)突變的試劑盒，其主要包括:1)引物，所述引物序列如SEQ ID NO:1~SEQ ID N0:9所示，PCR MIX反應(yīng)液，針對(duì)不同突變進(jìn)行酶切的限制性內(nèi)切酶，BSA溶液，酶切緩沖液，陰性對(duì)照品，陽(yáng)性對(duì)照品，去離子水；2)分隔并集中包裝這些試劑的瓶或管以及包裝盒。
[0019]優(yōu)選的，上述引物的濃度均為5~10 μ mol/L。
[0020]其中，PCR MIX反應(yīng)液為本領(lǐng)域常規(guī)的PCR MIX反應(yīng)液；優(yōu)選的，所述PCR MIX反應(yīng)液包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和MgC12 ;其中，所述Taq DNA聚合酶的濃度為50units/ml，所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP,它們的濃度均為400 μ Μ，所述MgC12的濃度為3mM0
[0021]其中，針對(duì)不同突變進(jìn)行酶切的限制性內(nèi)切酶包括:針對(duì)EGFR基因EX0N19缺失突變的限制性內(nèi)切酶Mse I，針對(duì)EGFR基因EX0N20T790M的限制性內(nèi)切酶BstU I和Nla III，針對(duì)EGFR基因EX0N21L858R的限制性內(nèi)切酶Msc I和Sau96 I ;優(yōu)選的，上述限制性內(nèi)切酶的濃度分別為5000單位/ml、10000單位/ml。
[0022]其中，所述BSA溶液中BSA的濃度為100mg/ml。
[0023]其中，所述酶切緩沖液為本領(lǐng)域常規(guī)的酶切緩沖液；優(yōu)選的，所述酶切緩沖液中的各組分的摩爾濃度或者質(zhì)量濃度如下:500mM NaCl、1000mMTris-HCl、IOOmM MgCl2,
.0.25%Trito-X-100 (ρΗ7.5，25°C )。
[0024]其中，所述陽(yáng)性對(duì)照品為:EGFR19缺失型DNA，EGFR20T790M突變型DNA，EGFR21L858R突變型DNA ;所述陰性對(duì)照品為:EGFR19野生型DNA，EGFR20野生型DNA，EGFR21 野生型 DNA。
[0025]本發(fā)明的引物和試劑盒的使用方法，包括以下步驟:
[0026](1)采集被測(cè)者的外周血樣本，使用常規(guī)方法提取樣本的基因組DNA ；
[0027](2)以步驟(1)提取的DNA為模板，以進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，其中，針對(duì)EX0N19缺失突變的PCR擴(kuò)增使用的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQID NO: 2所示，針對(duì)EX0N20T790M的PCR擴(kuò)增使用的引物序列如SEQ IDN0:4和SEQ ID N0:5所示，針對(duì)EX0N21L858R的PCR擴(kuò)增使用的引物序列如SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示;
[0028](3)對(duì)步驟(2)所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行第一次酶切，其中，針對(duì)EX0N19缺失突變的酶切使用的限制性內(nèi)切酶是Mse I，針對(duì)EX0N20T790M的酶切使用的限制性內(nèi)切酶是BstU I，針對(duì)EX0N21L858R的酶切使用的限制性內(nèi)切酶是Msc I ；
[0029](4)進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，其 中，針對(duì)EX0N19缺失突變的PCR擴(kuò)增使用的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 3所示，針對(duì)EX0N20T790M的PCR擴(kuò)增使用的引物序列如SEQ ID N0:6和SEQ ID NO: 5所示，針對(duì)EX0N21L858R的PCR擴(kuò)增使用的引物序列如SEQ IDNO:9 和 SEQ ID NO:8 所示；
[0030](5)對(duì)步驟(4)所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行第二次酶切，其中，針對(duì)EX0N19缺失突變不需進(jìn)行第二次酶切，針對(duì)EX0N20T790M的酶切使用的限制性內(nèi)切酶是NI a III，針對(duì)EX0N21L858R的酶切使用的限制性內(nèi)切酶是Sau96 I ; (6)按照DHPLC (變性高效液相色譜分析)常規(guī)操作方法，將酶切后產(chǎn)物(針對(duì)EX0N19缺失突變?yōu)閮纱蜳CR和一次酶切后產(chǎn)物，針對(duì)EX0N20T790M突變?yōu)閮纱蜳CR和兩次酶切后產(chǎn)物，針對(duì)EX0N21L858R突變?yōu)閮纱蜳CR和兩次酶切后產(chǎn)物)、非酶切產(chǎn)物(針對(duì)EX0N19缺失突變?yōu)閮纱蜳CR和一次不含酶的酶切后產(chǎn)物，針對(duì)EX0N20T790M突變?yōu)閮纱蜳CR和兩次不含酶的酶切后產(chǎn)物，針對(duì)EX0N21L858R突變?yōu)閮纱蜳CR和兩次不含酶的酶切后產(chǎn)物)、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，判讀檢測(cè)結(jié)果。
[0031]通過(guò)以上技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果如下:
[0032](I)可對(duì)EGFR基因三個(gè)最常見(jiàn)的熱點(diǎn)突變(EX0N19缺失突變、EX0N20T790M和EX0N21L858R)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)面廣，真實(shí)反映出患者體內(nèi)EGFR基因的突變情況，有助于對(duì)患者使用EGFR-TKI藥物的策略進(jìn)行判斷。
[0033](2)取外周血作為標(biāo)本材料，臨床標(biāo)本取材方便，可較早地發(fā)現(xiàn)該基因的突變，檢測(cè)流程簡(jiǎn)單快捷，價(jià)格低廉，檢測(cè)敏感性高，可直接、快速地判斷檢測(cè)結(jié)果，在第一時(shí)間得到臨床所需資料。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0034]圖1為使用本發(fā) 明的實(shí)施例的試劑盒檢測(cè)某患者EGFR基因熱點(diǎn)突變所得的DHPLC試驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0035]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步描述，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0036]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0037]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0038]實(shí)施例
[0039]用于檢測(cè)EGFR基因熱點(diǎn)突變的試劑盒及其使用
[0040]1.該用于檢測(cè)EGFR基因熱點(diǎn)突變的試劑盒中裝有:
[0041]⑴引物
[0042]兩對(duì)EGFR基因EX0N19缺失突變特異性的正、反向引物，其中，第一對(duì)EGFR基因EX0N19缺失突變特異性的正、反向引物如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，第二對(duì)EGFR基因EX0N19缺失突變特異性的正、反向引物如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示；
[0043]兩對(duì)EGFR基因EX0N20T790M特異性的正、反向引物，其中，第一對(duì)EGFR基因EX0N20T790M特異性的正、反向引物如SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5所示，第二對(duì)EGFR基因EX0N20T790M特異性的正、反向引物如SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:5所示;
[0044]兩對(duì)EGFR基因EX0N21L858R特異性的正、反向引物，其中，第一對(duì)EGFR基因EX0N21L858R特異性的正、反向引物如SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示，第二對(duì)EGFR基因EX0N21L858R特異性的正、反向引物如SEQ ID N0:9和SEQ ID N0:8所示;
[0045]上述引物的濃度均為5 μ mol/L。
[0046]⑵PCR MIX反應(yīng)液，包括:Taq DNA聚合酶，其濃度為50U/ml ；dNTPs,包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，它們的濃度均為400 μ M ;MgC12，其濃度為3mM。
[0047](3)限制性內(nèi)切酶
[0048]限制性內(nèi)切酶為Mse I ,BstU I ,NlaIILMsc I和Sau96 I ;上述限制性內(nèi)切酶的濃度分別為 5000U/ml、10000U/ml。
[0049](4) BSA 溶液，其中，BSA 的濃度為 100mg/ml。
[0050](5)酶切緩沖液
[0051]酶切緩沖液為本領(lǐng)域常規(guī)的酶切緩沖液，其中各組分的摩爾濃度或者質(zhì)量濃度如下:500mM NaCl、1000mMTris-HCl、IOOmM MgC12、0.25%Trito-X_100 (ρΗ7.5，25。。)。
[0052](6)對(duì)照品
[0053]陽(yáng)性對(duì)照品為:EGFR19缺失型DNA，EGFR20T790M突變型DNA，EGFR21L858R突變型DNA,陰性對(duì)照品為:所述陰性對(duì)照品為:EGFR19野生型DNA，EGFR20野生型DNA，EGFR21野生型DNA。
[0054](7)去離子水。
[0055]2.試劑盒的使用方法如下:
[0056]⑴采集患者外周血，提取外周血的血漿游離DNA，建議使用QIAamp DNA Blood Kit試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取，最后收集到50μ I溶液，濃度為5ng/y 1，直接進(jìn)行檢測(cè)或保存于-20°C。
[0057]⑵進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；針對(duì)三個(gè)不同的突變檢測(cè)，使用的引物不同，針對(duì)EX0N19缺失突變的PCR擴(kuò)增使用的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2所示，針對(duì)EX0N20T790M的PCR擴(kuò)增使用的引物序列如SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5所示，針對(duì)EX0N21L858R的PCR擴(kuò)增使用的引物序列如SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示，擴(kuò)增體系如下:
[0058]
【權(quán)利要求】
1.一種引物，其特征在于，所述引物序列如下:
SEQ ID NO:15’ -ATCCCAGAAGGTGAGAAAGATAAAATTC-3’
SEQ ID NO:25’ -CCTGAGGTTCAGAGCCATGGA-3’
SEQ ID NO:35’ -AGAGCCATGGACCCCCACAC-3’
SEQ ID NO:45’ -CGAAGCCACACTGACGTGC-3’
SEQ ID NO:55’ -CGAAGGGCATGAGCCGC-3’
SEQ ID NO:65’ -CCTCCAGGAAGCCTACGTGA-3’
SEQ ID NO:75’ -CAGCCAGGAACGTACTGGTGA-3’
SEQ ID NO:85’ -TCCCTGGTGTCAGGAAAATGCT-3’
SEQ ID NO:95’ -CGCAGCATGTCAAGATCACAGAT-3’。
2.一種包括有權(quán)利要求1所述的引物的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括:1)引物，所述引物序列如SEQ ID NO:1~SEQ ID N0:9所示，PCR MIX反應(yīng)液，針對(duì)不同突變進(jìn)行酶切的限制性內(nèi)切酶，BSA溶液，酶切緩沖液，陰性對(duì)照品，陽(yáng)性對(duì)照品，去離子水；2)分隔并集中包裝這些試劑的瓶或管以及包裝盒。
3.按照權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于:所述引物的濃度均為5~10μ mol/L。
4.按照權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于:所述PCRMIX反應(yīng)液包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和MgC12 ;其中，所述Taq DNA聚合酶的濃度為50U/ml，所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，它們的濃度均為400 μ Μ,所述MgC12的濃度為3mM。
5.按照權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于:所述限制性內(nèi)切酶分別為MseI ,BstU1、Nla II1、Msc I和Sau96 I，上述限制性內(nèi)切酶的濃度均為5000U/ml。
6.按照權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于:所述酶切緩沖液中的各組分的摩爾濃度或者質(zhì)量濃度如下:500mM NaCl、1000mMTris-HCl、100mMMgC12、0.25%Trito-X_100。
7.按照權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于:所述陽(yáng)性對(duì)照品為:EGFR19缺失型DNA, EGFR20T790M突變型DNA，EGFR21L858R突變型DNA ;所述陰性對(duì)照品為:EGFR19野生型DNA, EGFR20 野生型 DNA，EGFR21 野生型 DNA。
8.一種使用如權(quán)利要求1所述的引物的檢測(cè)方法，包括以下步驟: (1)采集被測(cè)者的外周血樣本，使用常規(guī)方法提取樣本的基因組DNA； (2)以步驟(1)提取的DNA為模板，以進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，其中，針對(duì)EX0N19缺失突變的PCR擴(kuò)增使用的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQID NO: 2所示，針對(duì)EX0N20T790M的PCR擴(kuò)增使用的引物序列如SEQ IDN0:4和SEQ ID NO: 5所示，針對(duì)EX0N21L858R的PCR擴(kuò)增使用的引物序列如SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示; (3)對(duì)步驟(2)所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行第一次酶切，其中，針對(duì)EX0N19缺失突變的酶切使用的限制性內(nèi)切酶是Mse I，針對(duì)EX0N20T790M的酶切使用的限制性內(nèi)切酶是BstU I，針對(duì)EX0N21L858R的酶切使用的限制性內(nèi)切酶是Msc I ； (4)以步驟(3)所得的酶切后產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，其中，針對(duì)EX0N19缺失突變的PCR擴(kuò)增使用的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 3所示，針對(duì)EX0N20T790M的PCR擴(kuò)增使用的引物序列如SEQ ID N0:6和SEQ ID NO: 5所示，針對(duì)EX0N21L858R的PCR擴(kuò)增使用的引物序列如SEQ ID N0:9和SEQ ID N0:8所示; (5)對(duì)步驟(4)所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行第二次酶切，其中，針對(duì)EX0N19缺失突變不需進(jìn)行第二次酶切，針對(duì)EX0N20T790M的酶切使用的限制性內(nèi)切酶是Nla III，針對(duì)EX0N21L858R的酶切使用的限制性內(nèi)切酶是Sau96 I ； (6)按照DHPLC常規(guī)操作方法，將酶切后產(chǎn)物、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，判讀檢測(cè)結(jié)果。
9.按照權(quán)利要求1所述的引物在診斷EGFR基因的EX0N19缺失突變、EX0N20T790M突變和EX0N21L858R突變中的應(yīng)用。
10.按照權(quán)利要求2~7中任一所述的試劑盒在診斷EGFR基因的EXON19缺失突變、EX0N20T790M突變和EXON21L858R突變 中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103602734SQ201310537369
【公開(kāi)日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月4日
【發(fā)明者】梁超, 熊凱, 程宇, 邢軍英, 劉曉峰, 侯然, 朱立文, 王緒華, 方國(guó)偉, 黃士昂, 陳忠 申請(qǐng)人:北京海思特臨床檢驗(yàn)所有限公司