檢測y染色體微缺失的引物和試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測Y染色體微缺失的引物和試劑盒及其使用方法。本發(fā)明所公開的引物為針對6個STS位點和內(nèi)參基因的特異性引物，使用包括有該引物的試劑盒可通過多重PCR擴增結(jié)合DHPLC檢測，可以快速、準(zhǔn)確地檢測Y染色體微缺失，檢測程序簡單，檢測靈敏度高，結(jié)果重復(fù)性高，樣品通量高。
【專利說明】檢測Y染色體微缺失的引物和試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及基因檢測的引物和試劑盒，尤其涉及一種用于檢測Y染色體微缺失的引物和試劑盒及其使用方法 【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)估計全球約有10%的育齡夫婦不育，其中男性因素引起的生殖障礙約占一半，而因遺傳性因素引發(fā)男性不育的比例為30%，其中發(fā)病率最高的兩種是克氏綜合癥和Y染色體微缺失，有10~15%的無精癥或少精癥存在Y染色體的微缺失。
[0003]Y染色體是最短的近端著絲粒染色體，是男性特有的染色體，Y染色體上有多個基因參與生精過程，研究表明，Y染色體上存在一個關(guān)鍵的與生育相關(guān)的因子的區(qū)域，稱為無精子因子(azoospermiafactor, AZF),目前認(rèn)為在AZF上存在三個精子發(fā)生亞區(qū)(AZFa、AZFb、AZFc)，各亞區(qū)包含的位點在男性生殖細(xì)胞發(fā)育不同時期起著不同的作用，位點的缺失可致患者表現(xiàn)為少、弱精癥或無精癥從而引發(fā)不育，而在AZFb于AZFc之間還存在AZFd座位，中等程度的少精子和精子數(shù)目正常卻形態(tài)異常多與該區(qū)域的缺失有關(guān)。AZFa缺失的患者，主要表現(xiàn)為支持細(xì)胞綜合癥伴睪丸體積縮小，無精子生成；AZFb缺失的患者，主要表現(xiàn)為生精過程阻滯在精母細(xì)胞階段，無精子生成；AZFc缺失的患者表現(xiàn)多樣化，會出現(xiàn)無精子癥和少精子癥的不同臨床表現(xiàn)。對于Y染色體微缺失的原因，普遍認(rèn)為染色體內(nèi)的非同源重組是該突變的主要機制。Y染色體微缺失一般在染色體核型分析不易發(fā)現(xiàn)，目前主要通過AZF區(qū)域的序列標(biāo)簽位點(Sequence tagged sites, STSs)來診斷,根據(jù)歐洲男科協(xié)會建議的六個STS位點進(jìn)行Y染色體微缺失的分析，即:AZFa(SY84、SY86)，AZFb(SY127、SY134)，AZFc(SY254、SY255)，對上述位點的分析，Y染色體微缺失的檢測準(zhǔn)確率可以達(dá)到95%。
[0004]當(dāng)前，Y染色體微缺失檢測的主要方法是通過PCR特異性擴增Y染色體AZF區(qū)域的序列標(biāo)簽位點(STS)，再用電泳或Southern blot雜交等方法檢測PCR擴增產(chǎn)物，但電泳靈敏度低、準(zhǔn)確性不高，雜交操作繁瑣、耗時耗力、成本高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測Y染色體微缺失的引物，本發(fā)明還公開了包括有該引物的試劑盒及其使用方法。
[0006]本申請的發(fā)明人根據(jù)6個STS位點和內(nèi)參基因設(shè)計特異性引物，通過多重PCR擴增結(jié)合DHPLC (變性高效液相色譜分析)檢測，可以快速、準(zhǔn)確地檢測Y染色體微缺失。
[0007]根據(jù)本發(fā)明的實施例，提供了一種用于檢測Y染色體微缺失的引物，所述引物包括8對引物，可同時擴增Y染色體上6個基因位點和兩個內(nèi)參基因；
[0008]所述Y染色體上6個基因位點為:SY84、SY86、SY127、SY134、SY254和SY255位點；所述兩個內(nèi)參基因為=SRY和TP53基因；
[0009]特異性擴增SY84位點的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示，[0010] SEQ ID N0:15’-AGAGGAGTCCTGATGCAGGT-3’
[0011 ] SEQ ID NO: 25 ’ -GCCCATTACCTGGAGCCTTC-3，
[0012]特異性擴增SY86位點的引物序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示，
[0013]SEQ ID N0:35’-GTGAACCACAGACATGCTTC-3’
[0014]SEQ ID N0:45，-ACACACAAGGCGAACCCCT-3，
[0015]特異性擴增SY127位點的引物序列如SEQ ID NO:5 SEQ ID N0:6所示，
[0016]SEQ ID N0:55，-GGCTCTCACACGAATAGAAA-3’
[0017]SEQ ID NO: 65 ’ -CTGCTGGCACTAATATGGGA-3，
[0018]特異性擴增SY134位點的引物序列如SEQ ID NO:7 SEQ ID N0:8所示，
[0019]SEQ ID N0:75，-GTCTCGCTCACACTAAAACG-3’
[0020]SEQ ID N0:85’-ACCAACGCCAATACATTCAA-3’
[0021]特異性擴增SY254位點的引物序列如SEQ ID NO:9 SEQ ID NO: 10所示，
[0022]SEQ ID NO:95’-GGGTCTATCCAGAGAGCAAA-3’
[0023]SEQ ID NO: 105’-GAACCTGATCTAGCAATGCAGC-3’
[0024]特異性擴增SY255位點的引物序列如SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12所示，
[0025]SEQ ID NO: 115 ’-GTTACGAGATTGCGCGTGAT-3 ’
[0026]SEQ ID NO: 125’-CTCGCTATGTCGAGCCAC-3’
[0027]特異性擴增SRY基因的引物序列如SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14所示，
[0028]SEQ ID NO: 135’-TCGCACCTTCCTTTGTTTTG-3’
[0029]SEQ ID NO: 145，-CGTTGTAGGGCGTGAAGT-3，
[0030]特異性擴增TP53基因的引物序列如SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16所示，
[0031]SEQ ID N0:155’-GGACTCGATTCTCTAACTGC-3’
[0032]SEQ ID NO: 165’-GCTTCTGTTCCTCGTTGCTT-3’。
[0033]根據(jù)本發(fā)明的實施例，還提供了一種用于檢測Y染色體微缺失的試劑盒，其主要包括:1)上述用于擴增Y染色體上SY84、SY86、SY127、SY134、SY254、SY255位點以及內(nèi)參SRY和TP53基因的引物，引物序列如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 16所示；2)PCR MIX反應(yīng)液、去離子水、質(zhì)控對照品；3)分隔并集中包裝這些試劑的瓶或管以及包裝盒。優(yōu)選的，上述引物的濃度均為IOpmol/μ I。
[0034]其中，PCR MIX反應(yīng)液為本領(lǐng)域常規(guī)的PCR MIX反應(yīng)液；優(yōu)選的，所述PCR MIX反應(yīng)液包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和MgC12 ;其中，所述Taq DNA聚合酶的濃度為50U/ml，所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP,它們的濃度均為400 μ Μ,所述MgC12的濃度為3mM。
[0035]其中，質(zhì)控對照品為正常男性DNA。
[0036]本發(fā)明的引物和試劑盒的使用方法，包括以下步驟:
[0037](I)使用常規(guī)方法提取待測樣本的基因組DNA ；
[0038](2)進(jìn)行多重PCR擴增，分成兩管進(jìn)行:A管擴增SY84位點、SY134位點、SY254位點、SRY和TP53基因；B管擴增SY86位點、SY127位點、SY255位點、SRY和TP53基因；
[0039](3)按照DHPLC (變性高效液相色譜分析)常規(guī)操作方法，使用前先檢查儀器狀態(tài)是否正常，運行flush+equiIibrate程序，除氣泡并wash進(jìn)樣針2-3遍。上樣前運行1-2針空白針(使用所需進(jìn)樣的檢測方法)，將PCR擴增產(chǎn)物依次進(jìn)行上機檢測，判讀結(jié)果。[0040]通過以上技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果如下:
[0041]通過多重PCR擴增結(jié)合DHPLC檢測，一次性擴增多個基因片段，無需針對每個基因位點單獨擴增檢測，簡化了檢測程序，減少了消耗品，降低了檢測成本，通過DHPLC自動化分析檢測結(jié)果，可快速得到檢測結(jié)果，檢測靈敏度高，結(jié)果重復(fù)性高，樣品通量高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]圖1為使用本發(fā)明的實施例的試劑盒檢測某患者Y染色體微缺失所得的DHPLC檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0043]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】作進(jìn)一步描述，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。
[0044]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0045]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0046]實施例
[0047]用于檢測Y染色體微缺失的試劑盒及其使用
[0048]1.該用于檢測Y染色體微缺失的試劑盒中裝有:
[0049]⑴引物
[0050]特異性擴增SY84位點的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示，
[0051]SEQ ID NO: 15’-AGAGGAGTCCTGATGCAGGT-3’
[0052]SEQ ID NO:25’-GCCCATTACCTGGAGCCTTC-3’
[0053]特異性擴增SY86位點的引物序列如SEQ ID NO:3 SEQ ID N0:4所示，
[0054]SEQ ID NO:35’-GTGAACCACAGACATGCTTC-3’
[0055]SEQ ID NO: 45，-ACACACAAGGCGAACCCCT-3，
[0056]特異性擴增SY127位點的引物序列如SEQ ID NO:5 SEQ ID N0:6所示，
[0057]SEQ ID NO:55，-GGCTCTCACACGAATAGAAA-3’
[0058]SEQ ID NO:65’-CTGCTGGCACTAATATGGGA-3’
[0059]特異性擴增SY134位點的引物序列如SEQ ID NO:7 SEQ ID N0:8所示，
[0060]SEQ ID N0:75，-GTCTCGCTCACACTAAAACG-3’
[0061]SEQ ID N0:85’-ACCAACGCCAATACATTCAA-3’
[0062]特異性擴增SY254位點的引物序列如SEQ ID NO:9 SEQ ID NO: 10所示，
[0063]SEQ ID NO:95’-GGGTCTATCCAGAGAGCAAA-3’
[0064]SEQ ID NO: 105’-GAACCTGATCTAGCAATGCAGC-3’
[0065]特異性擴增SY255位點的引物序列如SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12所示，
[0066]SEQ ID NO: 115，-GTTACGAGATTGCGCGTGAT-3，
[0067]SEQ ID NO: 125’-CTCGCTATGTCGAGCCAC-3’
[0068]特異性擴增SRY基因的引物序列如SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14所示，
[0069]SEQ ID NO: 135’-TCGCACCTTCCTTTGTTTTG-3’
[0070]SEQ ID N0:145，-CGTTGTAGGGCGTGAAGT-3，[0071]特異性擴增TP53基因的引物序列如SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16所示，
[0072]SEQ ID NO: 155’-GGACTCGATTCTCTAACTGC-3’
[0073]SEQ ID NO: 165，-GCTTCTGTTCCTCGTTGCTT-3，。
[0074]上述引物的濃度均為IOpmol/μ I。
[0075] (2) PCR MIX反應(yīng)液，其包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和MgCl2 ;其中，所述Taq DNA聚合酶的濃度為50U/ml，所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，它們的濃度均為400 μ Μ，所述MgC12的濃度為3mM;
[0076]⑶去離子水；
[0077](4)質(zhì)控對照品(正常男性DNA)；
[0078](5)分隔并集中包裝這些試劑的瓶或管以及包裝盒。
[0079]2.試劑盒的使用方法如下:
[0080]⑴使用商業(yè)途徑購買的DNA提取試劑盒提取樣本DNA ；
[0081](2)進(jìn)行多重PCR擴增，分成兩管進(jìn)行:A管擴增SY84位點、SY134位點、SY254位點、SRY和TP53基因；B管擴增SY86位點、SY127位點、SY255位點、SRY和TP53基因，反應(yīng)體系如下:
[0082]
TABLE[0083]上述上游引物和下游引物為每管所對應(yīng)的五個位點、基因的引物混合物，在引物混合物中每種引物的濃度均為IOpmol/μ I。
[0084]反應(yīng)程序為:
[0085]95°C, 15min, I 個循環(huán)；
[0086]95°C，50sec —從 63°C，每個循環(huán)降 0.5°C至 56°C，30sec — 72°C，60sec, 15 個循環(huán)；
[0087]95°C，50sec — 56°C , 50sec — 72°C , 50sec, 25 個循環(huán)；
[0088]72°C，lOmin，I 個循環(huán)。
[0089]⑶按照DHPLC (變性高效液相色譜分析)常規(guī)操作方法，使用前先檢查儀器狀態(tài)是否正常，運行flush+equiIibrate程序，除氣泡并wash進(jìn)樣針2-3遍。上樣前運行1-2針空白針(使用所需進(jìn)樣的檢測方法)，將PCR擴增產(chǎn)物依次進(jìn)行上機檢測，判讀結(jié)果。
[0090]判讀依據(jù)如下:如各位點都存在，則檢測位點和質(zhì)控對照一一對應(yīng)，若存在一個位點缺失，如sY134位點缺失，則和質(zhì)控對照對應(yīng)的134的位置沒有檢測峰型出現(xiàn)；如圖1所示，提供該樣本的患者各位點都存在，未出現(xiàn)Y染色體微缺失。
[0091]上面已經(jīng)舉例說明了本發(fā)明的實施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測Y染色體微缺失的引物，其特征在于，所述引物包括8對引物，可同時擴增Y染色體上6個基因位點和兩個內(nèi)參基因； 所述Y染色體上6個基因位點為:SY84、SY86、SY127、SY134、SY254和SY255位點； 所述兩個內(nèi)參基因為=SRY和TP53基因； 特異性擴增SY84位點的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示，
SEQ ID NO:15’ -AGAGGAGTCCTGATGCAGGT-3’
SEQ ID NO:25’ -GCCCATTACCTGGAGCCTTC-3’ 特異性擴增SY86位點的引物序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示，
SEQ ID NO:35’ -GTGAACCACAGACATGCTTC-3’
SEQ ID NO:45’ -ACACACAAGGCGAACCCCT-3’ 特異性擴增SY127位點的引物序列如SEQ ID NO:5 SEQ ID N0:6所示，
SEQ ID NO:55’ -GGCTCTCACACGAATAGAAA-3’
SEQ ID NO:65’ -CTGCTGGCACTAATATGGGA-3’ 特異性擴增SY134位點的引物序列如SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示，
SEQ ID NO:75’ -GTCTCGCTCACACTAAAACG-3’
SEQ ID NO:85’ -ACCAACGCCAATACATTCAA-3’ 特異性擴增SY254位點的引物序列如SEQ ID NO:9 SEQ ID NO: 10所示，
SEQ ID NO:95’ -GGGTCTATCCAGAGAGCAAA-3’
SEQ ID NO:105’ -GAACCTGATCTAGCAATGCAGC-3’ 特異性擴增SY255位點的引物序列如SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12所示，
SEQ ID NO:115’ -GTTACGAGATTGCGCGTGAT-3’
SEQ ID NO:125’ -CTCGCTATGTCGAGCCAC-3’ 特異性擴增SRY基因的引物序列如SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14所示，
SEQ ID NO:135’ -TCGCACCTTCCTTTGTTTTG-3’
SEQ ID NO:145’ -CGTTGTAGGGCGTGAAGT-3’ 特異性擴增TP53基因的引物序列如SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16所示，
SEQ ID NO:155’ -GGACTCGATTCTCTAACTGC-3’
SEQ ID NO:165’ -GCTTCTGTTCCTCGTTGCTT-3’。
2.一種包括有權(quán)利要求1所述的引物的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括:1)用于擴增Y染色體上SY84、SY86、SY127、SY134、SY254、SY255位點以及內(nèi)參SRY和TP53基因的引物，引物序列如SEQ ID NO:1~SEQ IDNO: 16所示；2)PCR MIX反應(yīng)液、去離子水、質(zhì)控對照品；3)分隔并集中包裝這些試劑的瓶或管以及包裝盒。
3.按照權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于:所述引物的濃度均為lOpmol/μI。
4.按照權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于:所述PCRMIX反應(yīng)液包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和MgC1 2 ;其中，所述Taq DNA聚合酶的濃度為50U/ml，所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，它們的濃度均為400 μ Μ,所述MgC12的濃度為3mM。
5.按照權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于:所述質(zhì)控對照品為正常男性DNA。
6.權(quán)利要求1所述引物的使用方法，包括以下步驟: (I)使用常規(guī)方法提取待測樣本的基因組DNA ；(2)分成兩管進(jìn)行多重PCR擴增:A管擴增SY84位點、SY134位點、SY254位點、SRY和TP53基因；B管擴增SY86位點、SY127位點、SY255位點、SRY和TP53基因； (3)按照DHPLC(變性高效液相色譜分析)常規(guī)操作方法，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行上機檢測，判讀檢測結(jié)果。
7.按照權(quán)利要求1所述的引物在診斷Y染色體微缺失中的應(yīng)用。
8.按照權(quán)利要求2~5中任一所述試劑盒在診斷Y染色體微缺失中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103571957SQ201310537372
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月4日
【發(fā)明者】胡廣慶, 張涵, 劉曉峰, 侯然, 梁超, 王緒華, 方國偉, 黃士昂, 陳忠 申請人:北京海思特臨床檢驗所有限公司