檢測mgmt基因甲基化的引物和試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測MGMT基因甲基化的引物和試劑盒及其使用方法，同時還公開了所述引物和試劑盒的應(yīng)用。本發(fā)明所公開的引物是根據(jù)人類MGMT基因啟動子區(qū)域序列設(shè)計特異性引物，可使用包含有所述引物的試劑盒，通過巢式PCR擴(kuò)增結(jié)合DHPLC（變性高效液相色譜分析）檢測，快速、準(zhǔn)確、高靈敏度地檢測MGMT基因甲基化。
【專利說明】檢測MGMT基因甲基化的引物和試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及基因檢測的引物和試劑盒，尤其涉及一種用于檢測MGMT基因甲基化的引物和試劑盒及其使用方法
【背景技術(shù)】
[0002]烷化劑是一種常見的誘變和致癌物質(zhì)，烷化劑上許多活性基團(tuán)能和DNA形成許多加合物，其中特別容易和鳥嘌呤形成O6-甲基鳥嘌呤，O6-甲基鳥嘌呤如果不能被及時發(fā)現(xiàn)和糾正，那么在DNA復(fù)制過程中，可能會使復(fù)制難以繼續(xù)或者使復(fù)制發(fā)生突變，使基因組的序列發(fā)生改變，影響基因的表達(dá)。O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6Iiethylguanine-DNA methyltransferase, MGMT)是一種DNA修復(fù)酶,可以特異性修復(fù)因燒化劑導(dǎo)致的細(xì)胞損傷， 是哺乳動物細(xì)胞修復(fù)烷化劑所造成DNA損傷的一個重要環(huán)節(jié)。如果腫瘤細(xì)胞中的MGMT水平過高可能會導(dǎo)致耐藥，但對于正常細(xì)胞亦能減少其化療的毒副作用，因此如何控制MGMT 水平以達(dá)到最佳的化療效果，是當(dāng)今的一個研究熱點(diǎn)。
[0003]MGMT基因結(jié)構(gòu)功能的異常，特別是啟動子過甲基化和腫瘤發(fā)生以及生物學(xué)上的聯(lián)系，正成為關(guān)注的焦點(diǎn)。啟動子區(qū)過甲基化是引起基因沉默的主要機(jī)制之一，可能影響基因功能的正常發(fā)揮。大量研究表明，MGMT基因甲基化與替莫唑胺(TMZ)療效相關(guān)，MGMT基因啟動子甲基化患者組生存時間明顯長于非甲基化組。
[0004]目前甲基化的檢測方法有多種，如甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶-PCR/Southern 法、直接測序法、甲基化特異性PCR (methyIation-specific PCR, MSP)-電泳等。MGMT基因甲基化檢測最常用的是MSP，該方法操作方便、適用性廣，靈敏度約為10%。直接測序法的靈敏度低，要求受檢材料的突變比例大于20%,且檢測成本也較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測MGMT基因甲基化的引物，本發(fā)明還公開了包括有該引物的試劑盒及其使用方法?！?br> [0006]本申請的發(fā)明人根據(jù)人類MGMT基因啟動子區(qū)域序列設(shè)計特異性引物，通過巢式 PCR擴(kuò)增結(jié)合DHPLC (變性高效液相色譜分析)檢測，可以快速、準(zhǔn)確、高靈敏度地檢測MGMT 基因甲基化。
[0007]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，提供了一種用于檢測MGMT基因甲基化的引物，所述引物序列如 SEQ ID NO:1 ~ SEQ ID NO:6 所示。
[0008]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，還提供了一種用于檢測MGMT基因甲基化的試劑盒，其主要包括:1)上述用于檢測MGMT基因甲基化的引物，所述引物序列如SEQ ID N0:1~SEQ ID N0:6所示；2)甲基化處理試劑、PCR MIX反應(yīng)液、去離子水、空白對照；3)分隔并集中包裝這些試劑的瓶或管以及包裝盒。優(yōu)選的，上述引物的濃度均為IOpmol/ill。
[0009]其中，甲基化處理試劑可從北京天漠科技開發(fā)有限公司購買得到，其包括CT Conversion Reagent、M-Binding Buffer、M-Wash Buffer、M-Desulphonation Buffer、M-Elution Buffer> Zymo-Spin IC?Column 和 Collection Tube。
[0010]其中，PCR MIX反應(yīng)液為本領(lǐng)域常規(guī)的PCR MIX反應(yīng)液；優(yōu)選的，所述PCR MIX反應(yīng)液包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和MgC12 ;其中，所述Taq DNA聚合酶的濃度為50U/ml，所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP,它們的濃度均為400 μ Μ,所述MgC12的濃度為3mM。本發(fā)明的引物和試劑盒的使用方法，包括以下步驟:
[0011](I)使用常規(guī)方法提取待測樣本的基因組DNA ；
[0012](2 )對DNA進(jìn)行亞硫酸鹽處理；
[0013](3)進(jìn)行巢式PCR:第一次PCR擴(kuò)增以亞硫酸鹽處理后的DNA為模板，使用的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示；將第一次PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物稀釋20倍作為模板，分兩管進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，A管使用的引物序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示；B管使用的引物序列如SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示;
[0014](4)按照DHPLC (變性高效液相色譜分析)常規(guī)操作方法，使用前先檢查儀器狀態(tài)是否正常，運(yùn)行flush+equilibrate程序，除氣泡并wash進(jìn)樣針2-3遍。上樣前運(yùn)行1-2針空白針(使用所需進(jìn)樣的檢測方法)，再將巢式PCR的甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物和非甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物及對應(yīng)空白對照進(jìn)行上機(jī)檢測，判讀結(jié)果。
[0015]通過以上技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果如下:
[0016]通過巢式PCR擴(kuò)增結(jié)合DHPLC檢測MGMT基因甲基化，靈敏度高，靈敏度可高達(dá)I~5%，操作流程簡單，可降低檢測人員的工作強(qiáng)度，減少誤操作的可能性，提高檢測的準(zhǔn)確性，通過DHPLC自動化分析檢測結(jié)果，檢測的準(zhǔn)確性高。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為使用本發(fā)明的實(shí)施例的試劑盒檢測某患者M(jìn)GMT基因甲基化所得的DHPLC檢測結(jié)果；
[0018]圖中，I為IOObp Marker，2為甲基化特異性引物擴(kuò)增結(jié)果，3為非甲基化特異性引物擴(kuò)增結(jié)果，4和5為陰性對照。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步描述，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。
[0020]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0021]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0022]實(shí)施例
[0023]用于檢測MGMT基因甲基化的試劑盒及其使用
[0024]1.該用于MGMT基因甲基化的試劑盒中裝有:
[0025](1)引物，所述引物序列如SEQ ID N0:1~SEQ ID NO:6所示，上述引物的濃度均為IOpmol/μ I。
[0026]⑵甲基化處理試劑(購自從北京天漠科技開發(fā)有限公司)，其包括CT ConversionReagent、M-Binding Buffer> M-ffash Buffer> M-Desulphonation Buffer> M-ElutionBuffer> Zymo-Spin IC?Column 和 Collection Tube。[0027](3) PCR MIX反應(yīng)液，其包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和MgC12 ;其中，所述Taq DNA 聚合酶的濃度為50U/ml，所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，它們的濃度均為400 u M， 所述MgC12的濃度為3mM;
[0028](4)去離子水
[0029](5)空白對照
[0030](6)分隔并集中包裝這些試劑的瓶或管以及包裝盒。
[0031]2.試劑盒的使用方法如下:
[0032]⑴提取待測樣本的基因組DNA:將石蠟包埋的組織切成5~10 y m的薄片后置于 1.5ml離心管中。二甲苯脫蠟。加入無水乙醇處理，室溫晾干直至殘留的乙醇已揮發(fā)完全。 用真空干燥儀45度15分鐘干燥,干燥組織經(jīng)蛋白酶K消化及加入酚和氯仿提取DNA，收集 DNA，提取的DNA濃度為IOOng/ill左右，可直接用于檢測或保存于_20度或-80度。
[0033](2)對DNA進(jìn)行亞硫酸鹽處理，具體步驟如下:
[0034]A:在 PCR 管中添加 130ul 的 CT Conversion Reagent 到每 20ulDNA 樣品中，將樣品管放到循環(huán)變溫器并按以下步驟操作:
[0035]98 0C，IOmin — 64°C，2.5h — 4°C，20h ；
[0036]B:添加 600 U I 的 M-Binding Buffer 到 Zymo-Spin ICtmCoIumn 中，并將柱放入試劑盒所提供的Collection Tube中；
[0037]C:加入樣品(從步驟B)到含有M-Binding Buffer的柱子中，蓋上蓋將柱顛倒數(shù)次來混合樣品；
[0038]D:全速(>10，OOOXg)離心30秒，去除流出液；
[0039]E:添加200 U I的M-ffash Buffer到柱中，全速離心30秒；
[0040]F:添加 2OOii I 的 M-Desulphonation Buffer 到柱中并且在室溫(20°C~3CTC ) 下放置培養(yǎng)15~20分鐘，在培養(yǎng)后，全速離心30秒；
[0041]G:添加200ii I的M-Wash Buffer到柱中，全速離心30秒，再添加200 y I的M-Wash Buffer并且離心30秒；
[0042]H:直接添加10 ii I的M-Elution Buffer到柱基質(zhì)中，將柱放置在1.5ml的管中， 全速離心來洗脫DNA。
[0043](3)進(jìn)行巢式PCR ;第一次PCR擴(kuò)增以亞硫酸鹽處理后的DNA為模板，使用的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示；將第一次PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物稀釋20倍作為模板， 分兩管進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，A管使用的引物序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示；B 管使用的引物序列如SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示；反應(yīng)體系如下:
[0044]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測MGMT基因甲基化的引物，其特征在于:所述引物的序列如SEQ IDNO:1 ~SEQ ID NO:6 所示，
2.一種用于檢測MGMT基因甲基化的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括:1)如權(quán)利要求I所述的引物；2)甲基化處理試劑、PCR MIX反應(yīng)液、去離子水、空白對照；3)分隔并集中包裝這些試劑的瓶或管以及包裝盒。
3.按照權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于:所述引物的濃度均為5~IOpmol/μI。
4.按照權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于:甲基化處理試劑可從北京天漠科技開發(fā)有限公司購買得到，其包括:CT Conversion Reagent、M-Binding Buffer> M-ffashBuffer、M-Desulphonation Buffer、M-Elution Buffer、Zymo-Spin ICtmCoIumn 和Collection Tube。
5.按照權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于:所述PCRMIX反應(yīng)液包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和MgC12 ;其中，所述Taq DNA聚合酶的濃度為50U/ml，所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，它們的濃度均為400 μ Μ,所述MgC12的濃度為3mM。
6.權(quán)利要求1所述引物的使用方法，包括以下步驟: (O使用常規(guī)方法提取待測樣本的基因組DNA ； (2)對DNA進(jìn)行亞硫酸鹽處理； (3)進(jìn)行巢式PCR:第一次PCR擴(kuò)增模板為經(jīng)亞硫酸鹽處理的DNA，使用的引物序列如SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2所示；以第一次PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，分兩管進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，A管使用的引物序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4所示；B管使用的引物序列如 SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 所示； (4)按照DHPLC(變性高效液相色譜分析)常規(guī)操作方法，將巢式PCR產(chǎn)物進(jìn)行上機(jī)檢測，判讀檢測結(jié)果。
7.按照權(quán)利要求1所述的引物在診斷MGMT基因甲基化中的應(yīng)用。
8.按照權(quán)利要求2~5中任一所述的試劑盒在診斷MGMT基因甲基化中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK103571958SQ201310537612
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月4日
【發(fā)明者】劉曉峰, 程宇, 侯然, 朱立文, 梁超, 王緒華, 方國偉, 黃士昂, 陳忠 申請人:北京海思特臨床檢驗(yàn)所有限公司