用于檢測nqo1基因多態(tài)性的引物、試劑盒及其在病理檢測上的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了檢測NQO1基因多態(tài)性的引物、試劑盒及其在病理檢測上的應用，所述引物包括從樣本核酸中擴增醌氧化還原酶1基因第四外顯子C465T位點片段和第六外顯子C609T位點片段的特異性引物和對獲得的核酸片段進行焦磷酸測序的引物。通過本發(fā)明的引物、方法和試劑盒，采用焦磷酸測序技術，可檢測出與腫瘤易感性相關的醌氧化還原酶1基因第四外顯子C465T位點和第六外顯子C609T位點多態(tài)性，特異性好，準確度高。
【專利說明】用于檢測NQ01基因多態(tài)性的引物、試劑盒及其在病理檢測上的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬生命科學和生物【技術領域】，特別涉及用于醌氧化還原酶I基因NQ01*2(C609T)、NQ01*3(C465T)位點多態(tài)性檢測的引物、試劑盒和在病理檢測上的應用，采用焦磷酸測序技術，能對醌氧化還原酶I基因多態(tài)性進行檢測，特異性好，準確度高。
【背景技術】
[0002]醌氧化還原酶I 基因(NADPH:quinone oxidore_ductasel,NQ01)是由 Ernster 和Navazio于1958年首先報道的，最初被稱為DT-硫辛酰胺脫氫酶(DT-diaphorase)。它是絕大多數(shù)真核生物細胞中普遍存在的一種黃素蛋白酶，能夠解除許多天然和合成化合物的毒性，同時又能活化一些醌類抗腫瘤藥物，因而引起了廣泛關注。NQOl是一種可誘導的還原酶，酚類抗氧化劑、多環(huán)芳烴、偶氮染料、缺氧等外界環(huán)境因素均可以強烈地誘導NQOl表達。這種可誘導性表達使得NQOl可能在腫瘤預防和腫瘤治療上起重要作用。
[0003]20世紀90年代初，有研究發(fā)現(xiàn)NQ01cDNA609位點上存在C/T單核苷酸多態(tài)性(SNP)，可能改變酶的二級結構，使酶的活性降低，增加了氧自由基的生成。目前發(fā)現(xiàn)人的NQOl基因序列中，引起蛋白質編碼氨基酸序列改變的非同義編碼單核苷酸多態(tài)性有三個，其中包括位于第四外顯子的C465T和第六外顯子的C609T，分別引起所編碼的139位氨基酸由色氨酸(Trp)變?yōu)榫彼?Arg)，187位氨基酸由脯氨酸(Pro)變?yōu)榻z氨酸(Ser)。這些氨基酸序列改變，可能導致了個體中酶NQOl活性的降低或缺失，減弱了 NQOl對醌類化合物的解毒作用及改變腫瘤對特定原癌基因及抑癌基因功能的影響，從而使機體患腫瘤的可能性增加。
[0004]研究發(fā)現(xiàn)，酶NQOl具有2個野生型等位基因即野生純合子(C/C)的個體，NQOl酶的活力正常；而具有雜合子(C/T)的個體酶的活力降低，具有突變純合子(T/T)的個體NQOl酶的活力則完全消失。
[0005]目前對于NQ01C465T研究尚不很多。NQ01cDNA465位點上存在C/T單核苷酸多態(tài)性。不同人群NQ01465T等位基因頻率較低(0~0.05)。許多研究還發(fā)現(xiàn)，NQ01C609T基因多態(tài)性頻率在種族分布上有很大差異，基因型為(T/T)的純合子個體在中國和其他亞洲人種為18%~20%，大約為高加索人和美籍非洲人的4倍。
[0006]鑒于NQOl與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，其第六位外顯子(C609T)和第四位外顯子(C465T)具有非同義編碼單核苷酸多態(tài)性，可引起蛋白質編碼的堿基序列改變從而導致蛋白質功能的改變，進而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。對其進行檢測將有助于進一步明確其遺傳背景在腫瘤發(fā)生中的作用，并為腫瘤個體化治療提供有益的指導。
[0007]在臨床實驗室中，目前檢醌氧化還原酶I基因NQ01*2 (C609T)、NQ01*3 (C465T)多態(tài)性的常用方法為限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment lengthpolymorphism, RELP)法。該技術為第一代DNA分子標記技術,利用限制性內切酶能識別DNA分子的特異序列，并在特定序列處切開DNA分子，即產(chǎn)生特征性的限制性片段，該方法的缺陷在于檢測靈敏度低且只能檢測大概型別，不能具體到突變比例。
[0008]本發(fā)明在原有的基礎上進行焦磷酸測序檢測，不僅能檢測到多態(tài)性位點的具體突變情況，也能根據(jù)圖譜辨別出突變比例，使檢測結果更加具體化。

【發(fā)明內容】

[0009]針對現(xiàn)有技術的缺陷，本發(fā)明除了利用兩對特異性的引物分別對醌氧化還原酶I基因NQOl的第四外顯子C465T位點片段和第六外顯子C609T位點片段進行常規(guī)PCR擴增外，還利用一對焦磷酸測序引物對PCR擴增片段進行正向測序和反向測序，不僅能夠檢測到多態(tài)性位點的具體突變情況，也能根據(jù)測序圖譜辨別出突變比例，使檢測結果更加具體化，從而能夠更好地為腫瘤個體化治療提供有益的指導。 [0010]在進行焦磷酸測序過程中，四種dNTP (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)依序被加入測序反應體系中。在每一輪測序反應中，只加入其中一種。如被加入的dNTP與DNA模板配對，DNA聚合酶可以催化該dNTP與焦磷酸測序引物C465T-S或C609T-S的3’端形成共價鍵，dNTP的焦磷酸基團(PPi)就被釋放出來。加入的dNTP和釋放出來的PPi的摩爾數(shù)是相等的。接著,ATP 硫酸化酶(ATP sulfurylase)催化過硫酸銨(ammonium persulfate, APS)和 PPi 形成ATP，此ATP和PPi的摩爾數(shù)也是一致的。利用ATP作為能源，熒光素酶(Iuciferase)可將熒光素氧化為氧化熒光素(oxyluciferin)，進而發(fā)出與ATP量成正比的可見光信號。光信號由CCD攝像機檢測，并由程序pyrogramTM轉為波形訊號。每個波峰的高度(光信號)與反應中加入的核苷酸數(shù)目成正比。
[0011]基于這種焦磷酸測序技術，本發(fā)明提供用于檢測NQOl基因的C609T和C465T位點多態(tài)性的引物，其特征在于，所述引物包括從樣本核酸中擴增NQOl基因第四外顯子C465T位點片段和第六外顯子C609T位點片段的特異性引物，其堿基序列為:
[0012]C465T-F:5’-CTAGCTTTACTCGGACCCACTC-3’ (SEQ ID N0.1)
[0013]C465T-R:5’-GCAACAAGAGGGAAGCTCCATC-3’ (SEQ ID N0.2)
[0014]C609T-F:5’-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3’ (SEQ ID N0.3)
[0015]C609T-R:5’-CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3’ (SEQ ID N0.4)
[0016]以及對所獲得的核酸擴增產(chǎn)物進行焦磷酸測序的引物，其堿基序列為:
[0017]C465T-S:5’-GCATTCAGAACCATCCACCTAC-3’ (SEQ ID N0.5)
[0018]C609T-S:5’-TTCTGTGGCTTCCAAGTCTTAG-3’(SEQ ID N0.6)。
[0019]進一步地，引物C465T-F和C609T-R的5’端被生物素標記。
[0020]進一步地，所述擴增的反應條件為94°C 2分鐘；98°C 10秒，60°C 20秒，68°C 20秒，35個循環(huán)；68°C 5分鐘。
[0021]本發(fā)明還提供了檢測NQOl基因的C609T和C465T位點多態(tài)性的方法在病理檢測上的應用，包括:
[0022](I)提取樣本中的DNA ；
[0023](2)以步驟(1)中的DNA作為模板，使用一對引物C465T-F和C465T-R擴增NQOl基因第四外顯子C465T位點片段，獲得PCR擴增產(chǎn)物I ;使用一對引物C609T-F和C609T-R擴增NQOl基因第六外顯子C609T位點片段，獲得PCR擴增產(chǎn)物2 ；
[0024](3)取步驟⑵中的PCR擴增產(chǎn)物I和2進行瓊脂糖電泳，檢測是否擴增成功；[0025](4)若步驟(3)中擴增成功，則利用焦磷酸測序引物C465T-S對步驟⑵中的PCR擴增產(chǎn)物I進行測序，利用焦磷酸測序引物C609T-S對步驟(2)中的PCR擴增產(chǎn)物2進行測序；
[0026](5)根據(jù)步驟步驟⑷中的焦磷酸測序結果，確定NQOl基因的C465T和C609T位點的多態(tài)性，
[0027](6)根據(jù)步驟(5)中的多態(tài)性結果，確定樣本的病理狀態(tài)；
[0028]其特征在于，所述引物序列為:
[0029]C465T-F:5’-CTAGCTTTACTCGGACCCACTC-3’
[0030]C465T-R:5’-GCAACAAGAGGGAAGCTCCATC-3’
[0031 ] C609T-F:5’-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3'
[0032]C609T-R:5’-CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3’
[0033]C465T-S:5’-GCATTCAGAACCATCCACCTAC-3'
[0034]C609T-S:5’-TTCTGTGGCTTCCAAGTCTTAG-3'。
[0035]進一步地，所述擴增的反應條件為94°C 2分鐘；98°C 10秒，60°C 20秒，68°C 20秒，35個循環(huán)；68°C 5分鐘。
[0036]本發(fā)明還提供用于檢測NQOl基因的C609T和C465T位點多態(tài)性的試劑盒，包括核酸提取試劑、PCR擴增體系、焦磷酸測序試劑，其特征在于，所述PCR擴增體系包括用于擴增基因NQOl第四外顯子C465T位點片段和第六外顯子C609T位點片段的特異性引物，其堿基序列為:
[0037]C465T-F:5’-CTAGCTTTACTCGGACCCACTC-3’ (SEQ ID N0.1)
[0038]C465T-R:5’-GCAACAAGAGGGAAGCTCCATC-3’ (SEQ ID N0.2)
[0039]C609T-F:5’-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3’ (SEQ ID N0.3)
[0040]C609T-R:5’-CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3’ (SEQ ID N0.4)
[0041]所述焦磷酸測序試劑包括對所獲得的核酸擴增片段進行焦磷酸測序的引物，其堿基序列為:
[0042]C465T-S:5’-GCATTCAGAACCATCCACCTAC-3’ (SEQ ID N0.5)
[0043]C609T-S:5’-TTCTGTGGCTTCCAAGTCTTAG-3’(SEQ ID N0.6)。
[0044]進一步地，引物C465T-F和C609T-R的5’端被生物素標記。
[0045]進一步地，所述PCR擴增體系還包括2*Buffer、dNTP、KOD酶和純水。
[0046]進一步地，所述焦磷酸測序試劑還包括75%乙醇和DMS0。
[0047]進一步地，所述核酸提取試劑包括紅細胞裂解液。
[0048]本發(fā)明將測序技術應用于醌氧化還原酶I基因多態(tài)性位點的檢測，設計出將NQ01*2 (C609T)、NQ01*3 (C465T)多態(tài)性位點包含在內的擴增引物和焦磷酸測序引物，進行PCR擴增，擴增片段長度分別為464bp和212bp，隨后進行焦磷酸測序分析。
[0049]采用焦磷酸測 序技術，通過本發(fā)明的特異性的擴增引物和焦磷酸測序引物，可檢測出與腫瘤預防和腫瘤治療相關的醌氧化還原酶I基因NQ01*2 (C609T)、NQ01*3 (C465T)位點多態(tài)性，特異性好，準確度高?？梢杂糜谂R床作為腫瘤發(fā)生的早期預防、早期診斷的輔助性指標及篩選?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0050]圖1是C465T野生型焦磷酸測序圖。
[0051]圖2是C609T野生型焦磷酸測序圖。
[0052]圖3是C609T突變雜合型焦磷酸測序圖。
[0053]圖4是C609T突變純合型焦磷酸測序圖。
【具體實施方式】
[0054]下面結合具體實施例和附圖，進一步闡述本發(fā)明。應當注意的是，實施例中未說明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領域實驗人員常規(guī)采用方法:比如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學實驗指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。
[0055]實施例1:檢測基因NQOl位點多態(tài)性的引物和試劑盒
[0056]用于醌氧化還原酶I基因NQ01*2 (C609T)、NQ01*3 (C465T)位點多態(tài)性檢測的引物，包括從樣本核酸中擴增醌氧化還原酶I基因NQ01*2 (C609T)、NQ01*3 (C465T)位點片段的特異性引物和對獲得的核酸片段進行焦磷酸測序的引物，其中，
[0057]從樣本核酸中擴增醌氧化還原酶I基因NQ01*2 (C609T) >NQOI*3 (C465T)位點片段的特異性引物序列為:
[0058]C465T-F:5’-CTA GCTTTACTCGGACCCACTC-3’ (SEQ ID N0.1)
[0059]C465T-R:5’-GCAACAAGAGGGAAGCTCCATC-3’ (SEQ ID N0.2)
[0060]C609T-F:5’-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3’ (SEQ ID N0.3)
[0061]C609T-R:5’-CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3’ (SEQ ID N0.4)
[0062]其中C465T-F和C609T-R為5’端生物素標記引物；
[0063]對獲得的核酸片段進行焦磷酸測序的引物序列為:
[0064]C465T-S:5’-GCATTCAGAACCATCCACCTAC-3’ (SEQ ID N0.5)
[0065]C609T-S:5’-TTCTGTGGCTTCCAAGTCTTAG-3’(SEQ ID N0.6)。
[0066]采用焦磷酸測序技術，通過兩對特異性的擴增引物C465T-F、C465T-R和C609T-F、C609T-R以及焦磷酸測序引物，可檢測出與腫瘤疾病相關的醌氧化還原酶I基因NQOI*2 (C609T)、NQOI*3 (C465T)位點多態(tài)性。
[0067]一種用于檢測醌氧化還原酶I基因NQ01*2的C609T、NQ01*3的C465T位點多態(tài)性的試劑盒，包括核酸提取試劑、PCR擴增體系、焦磷酸測序試劑，其中，所述PCR擴增體系包括用于擴增基因NQOl第四外顯子C465T位點片段和第六外顯子C609T位點片段的特異性引物，其堿基序列為:
[0068]C465T-F:5’-CTAGCTTTACTCGGACCCACTC-3’ (SEQ ID N0.1)
[0069]C465T-R:5’-GCAACAAGAGGGAAGCTCCATC-3’ (SEQ ID N0.2)
[0070]C609T-F:5’-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3’ (SEQ ID N0.3)
[0071]C609T-R:5’-CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3’ (SEQ ID N0.4)
[0072]所述焦磷酸測序試劑包括對所獲得的核酸擴增片段進行焦磷酸測序的引物，其堿基序列為:
[0073]C465T-S:5’-GCATTCAGAACCATCCACCTAC-3’ (SEQ ID N0.5)
[0074]C609T-S:5’-TTCTGTGGCTTCCAAGTCTTAG-3’(SEQ ID N0.6)。[0075]優(yōu)選地，引物C465T-F和C609T-R的5’端被生物素標記。
[0076]優(yōu)選地，所述PCR擴增體系還包括2*Buffer、dNTP、KOD酶和純水。
[0077]優(yōu)選地，所述焦磷酸測序試劑還包括75%乙醇和DMS0。
[0078]優(yōu)選地，所述核酸提取試劑包括紅細胞裂解液。
[0079]實施例2 =DNA提取
[0080]DNA提取試劑:紅細胞裂解液，血液基因組DNA抽提試劑盒(TIANGEN公司)。
[0081]操作步驟:取500ul全血，放入到1.5ml的離心管中，加入Iml紅細胞裂解液。上下翻轉，使完全混勻，旋轉搖動15秒后放入離心機中離心,離心速率為5000rpm, IOmin.。倒掉上層液，可見離心管底部有血色沉淀。加入500ul紅細胞裂解液，重復此裂解步驟一次。離心5000rpm, 5min,吸去上清，留下白細胞沉淀，加200uL緩沖液GA,振蕩至徹底混勻。加A 20 u I蛋白酶K溶液，混勻。加入200 ill緩沖液GB，充分顛倒混勻，70°C放置10分鐘，溶液應變清亮，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。加人200iU無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，OOOrpm(~13，400Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入500 U I緩沖液GD (使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12，OOOrpm(~13，400 Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入700 U I漂洗液PW (使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12，OOOrpm(~13，400Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500 u I漂洗液PW，12，OOOrpm(~13，400 Xg)離心30秒，倒掉廢液。將吸附柱CB3放回收集管中，12，OOOrpm(~13，400Xg)離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。將吸附柱CB3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加IOOiU洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12，OOOrpm(~13，400 Xg)離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。最終，獲得所提取的DNA。
[0082]實施例3:PCR擴增
[0083]對實施例2中所提取的DNA利用PCR擴增體系進行常規(guī)PCR擴增，獲得擴增DNA片段擴增產(chǎn)物。[0084]對醌氧化還原酶I基因NQ01*2 (C609T)位點片段進行擴增所用的PCR擴增體系為2*Bufferl0u 1，dNTP4 U 1，腳酶0.411 1，上游引物 C609T-F1 y 1，下游引物 C609T-R1 y 1，純水2.6 ii I,加I ii I模板DNA到19 ii I擴增體系中，總體積為20 u 10
[0085]對醌氧化還原酶I基因NQ01*3 (C465T)位點片段進行擴增所用的PCR擴增體系為2*Bufferl0u 1，dNTP4 U 1，腳酶0.411 1，上游引物 C465T-F1 y 1，下游引物 C465T-R1 y 1，純水2.6 ii I,加I ii I模板DNA到19 ii I擴增體系中，總體積為20 u 10
[0086]常規(guī)PCR擴增反應條件為94°C 2分鐘；98°C 10秒，60°C 20秒，68°C 20秒，35個循環(huán)；68°C 5分鐘。
[0087]實施例4:瓊脂糖凝膠電泳
[0088]取實施例3中的DNA片段擴增產(chǎn)物3 iU進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測是否擴增成功，對清晰較亮的目的條帶進行后續(xù)焦磷酸測序反應。
[0089]實施例5:焦磷酸測序[0090]焦憐酸測序試劑:75%乙醇，DenaturationSolution,Annealing Buffer,BindingBuffer,I Xffash Buffer, Streptavidin Sepharase High Performance (bead), PyroMarkGold Q96Reagents(E\S\dNTP)，DMS0(二甲基亞砜)，焦磷酸測序引物 C465T-S 和 C609T-S，其中除焦磷酸測序引物之外，均采購自美國QIAGEN公司。
[0091]焦磷酸測序步驟:利用焦磷酸測序試劑，對經(jīng)過實施例4中的電泳方法確認擴增成功的PCR擴增產(chǎn)物進行焦磷酸測序，具體測序步驟按照PyroMark Gold Q96(美國QIAGEN公司)操作說明書進行。其中利用焦磷酸測序引物C465T-S對醌氧化還原酶I基因NQOl的第四外顯子C465T位點片段進行反向測序，利用焦磷酸測序引物C609T-S對第六外顯子C609T位點片段進行正向測序。
[0092]針對醌氧化還原酶1基因NQOl的第四外顯子C465T位點片段和第六外顯子C609T位點片段的擴增產(chǎn)物，分別利用焦磷酸測序引物C465T-S和C609T-S進行測序，根據(jù)測序圖譜分析和確定這兩個位點的多態(tài)性。
[0093]實施例6:臨床樣本病理狀態(tài)分析
[0094]取臨床送檢的4份樣本,依次編號為I號樣本、2號樣本、3號樣本和4號樣本。按照實施例2至實施例5的方法，利用引物C465T-S和C609T-S分別對I號樣本、2號樣本、3號樣本和4號樣本中的NQOl基因第四外顯子C465T位點片段的擴增產(chǎn)物和第六外顯子C609T位點片段的擴增產(chǎn)物進行測序。
[0095]NQOl基因第四外顯子C465T位點野生型的基因序列為TTC￡GG。經(jīng)測定I號樣本中的NQOl基因第四外顯子C465T位點片段擴增產(chǎn)物的焦磷酸測序結果如圖1所示，所得序列為:CC￡GAA,即圖1中的方框作標記。多態(tài)性位點為G,由于為反向測序,可知I號樣本為C465T野生型。針對NQOl基因第四外顯子C465T的突變雜合型和突變純合型的檢測結果與實際相同。
[0096]NQOl基因第六外顯子C609T位點野生型的基因序列為AA￡CTC。經(jīng)測定2號樣本中的NQOl基因第六外顯子C609T位點片段擴增產(chǎn)物的焦磷酸測序結果如圖2所示，所得序列為:AA￡CTC，即圖2中的方框作標記。多態(tài)性位點為C，該位點為正向測序，可知2號贗本為C609T野生型。
[0097]NQOl基因第六外顯子C609T位點突變雜合型的基因序列為AAI/￡CTC。經(jīng)測定，3號樣本中的NQOl基因第六外顯子C609T位點片段擴增產(chǎn)物的焦磷酸測序結果如圖3所示，所得序列為:AAI/￡CTC，即圖3中的方框作標記。多態(tài)性位點為T/C，該位點為正向測序，可知3好樣本為C609T突變雜合型。
[0098]NQOl基因第六外顯子C609T位點突變純合型的基因序列為AAJCTC。經(jīng)測定4號樣本中的片段擴增產(chǎn)物的焦磷酸測序結果如圖4所示，所得序列為:AAICTC，即圖4中的方框作標記。多態(tài)性位點為T，該位點為正向測序，可知4號樣本為C609T突變純合型。
【權利要求】
1.用于檢測NQOl基因的C609T和C465T位點多態(tài)性的引物，其特征在于，所述引物包括從樣本核酸中擴增NQOl基因第四外顯子C465T位點片段和第六外顯子C609T位點片段的特異性引物，其堿基序列為:
C465T-F: 5’-CTAGCTTTACTCGGACCCACTC-3’
C465T-R: 5’-GCAACAAGAGGGAAGCTCCATC-3’
C609T-F: 5’-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3’
C609T-R: 5’- CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3’ 以及對所獲得的核酸擴增產(chǎn)物進行焦磷酸測序的引物，其堿基序列為:
C465T-S: 5’- GCATTCAGAACCATCCACCTAC -3’
C609T-S: 5’- TTCTGTGGCTTCCAAGTCTTAG -3，。
2.如權利要求1所述的引物，其特征在于，引物C465T-F和C609T-R的5’端被生物素標記。
3.如權利要求1所述的引物，其特征在于，所述擴增的反應條件為94°C2分鐘；98°C10 秒，60°C 20 秒，68°C 20 秒，35 個循環(huán)；68°C 5 分鐘。
4.一種檢測NQOl基因的C609T和C465T位點多態(tài)性的方法在病理檢測上的應用，包 括: (1)提取樣本中的DNA; (2)以步驟(1)中的DNA作為模板，使用一對引物C465T-F和C465T-R擴增NQOl基因第四外顯子C465T位點片段，獲得PCR擴增產(chǎn)物I ;使用一對引物C609T-F和C609T-R擴增NQOl基因第六外顯子C609T位點片段，獲得PCR擴增產(chǎn)物2 ； (3)取步驟⑵中的PCR擴增產(chǎn)物I和2進行瓊脂糖電泳，檢測是否擴增成功； (4)若步驟(3)中擴增成功，則利用焦磷酸測序引物C465T-S對步驟(2)中的PCR擴增產(chǎn)物I進行測序，利用焦磷酸測序引物C609T-S對步驟(2)中的PCR擴增產(chǎn)物2進行測序; (5)根據(jù)步驟步驟⑷中的焦磷酸測序結果，確定NQOl基因的C465T和C609T位點的多態(tài)性； (6)根據(jù)步驟(5)中的多態(tài)性結果，確定樣本的病理狀態(tài)； 其特征在于，所述引物序列為:
C465T-F: 5’-CTAGCTTTACTCGGACCCACTC-3’
C465T-R: 5’-GCAACAAGAGGGAAGCTCCATC-3’
C609T-F: 5’-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3’
C609T-R: 5’- CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3’
C465T-S: 5’- GCATTCAGAACCATCCACCTAC -3’
C609T-S: 5’- TTCTGTGGCTTCCAAGTCTTAG -3，。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述擴增的反應條件為94°C2分鐘；98°C10秒，60°C 20 秒，68°C 20 秒，35 個循環(huán)；68°C 5 分鐘。
6.用于檢測NQOl基因的C609T和C465T位點多態(tài)性的試劑盒，包括核酸提取試劑、PCR擴增體系、焦磷酸測序試劑，其特征在于，所述PCR擴增體系包括用于擴增基因NQOl第四外顯子C465T位點片段和第六外顯子C609T位點片段的特異性引物，其堿基序列為:C465T-F: 5’-CTAGCTTTACTCGGACCCACTC-3’
C465T-R: 5’-GCAACAAGAGGGAAGCTCCATC-3’
C609T-F: 5’-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3’
C609T-R: 5’- CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3’ 所述焦磷酸測序試劑包括對所獲得的核酸擴增片段進行焦磷酸測序的引物，其堿基序列為:
C465T-S: 5’- GCATTCAGAACCATCCACCTAC -3’
C609T-S: 5’- TTCTGTGGCTTCCAAGTCTTAG -3，。
7.如權利要求6所述的試劑盒，引物C465T-F和C609T-R的5’端被生物素標記。
8.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR擴增體系還包括2*Buffer、dNTP、KOD酶和純水。
9.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述焦磷酸測序試劑還包括75%乙醇和DMSO。
10.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述核酸提取試劑包括紅細胞裂解液。
【文檔編號】C12Q1/68GK103667447SQ201310539817
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月4日 優(yōu)先權日:2013年11月4日
【發(fā)明者】鐘丹, 薛群, 陳奕磊 申請人:武漢艾迪康醫(yī)學檢驗所有限公司