甘蔗毛細(xì)管電泳dna指紋圖譜的構(gòu)建及甘蔗品種資源鑒定的方法
【專利摘要】一種甘蔗毛細(xì)管電泳DNA指紋圖譜的構(gòu)建及甘蔗品種資源鑒定的方法，包括以下步驟：1)提取甘蔗葉片總DNA；2)在SSR引物的作用下進(jìn)行PCR反應(yīng)；3)PCR擴增產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳分析；4)利用毛細(xì)管電泳產(chǎn)生的電泳峰的位置、高度和面積參數(shù)建立甘蔗樣本DNA指紋圖譜。本發(fā)明充分利用了甘蔗DNA中豐富的SSR遺傳多樣性，DNA指紋圖譜信息量大、實用性強、結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性好、靈敏度高，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】甘蔗毛細(xì)管電泳DNA指紋圖譜的構(gòu)建及甘蔗品種資源鑒定的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及甘蔗品種資源鑒定技術(shù)，具體地說是一種甘蔗毛細(xì)管電泳DNA指紋圖譜的構(gòu)建及甘蔗品種資源鑒定的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]甘蔗是我國及世界重要的糖料作物。甘蔗在分類上屬于禾本科甘蔗屬(Saccharum)0目前，甘蔗品種資源的鑒別主要是依據(jù)外觀性狀。外觀性狀鑒別過于依賴鑒別人員的經(jīng)驗和感覺，主觀性強，可信度較低。同時外觀性狀受環(huán)境影響大，也會導(dǎo)致鑒別錯誤，加之甘蔗品種的相似度越來越高，導(dǎo)致鑒別越來越困難。由于DNA遺傳物質(zhì)受環(huán)境影響小、多態(tài)性高，DNA指紋鑒定技術(shù)已成為作物品種鑒定最有效的方法，目前在甘蔗品種資源的鑒別方面也開始逐步應(yīng)用。
[0003]DNA指紋鑒定技術(shù)是利用生物體內(nèi)遺傳信息載體DNA對生物物種進(jìn)行鑒別的方法，近年來已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于植物品種資源的鑒定。目前應(yīng)用于構(gòu)建DNA指紋圖譜的分子標(biāo)記方法主要有:限制性片段長度多態(tài)性(Restriction Fragment LengthPolymorphisms, RFLP)分析技術(shù)，隨機擴增 DNA 多態(tài)性(Random Amplified PolymorphicDNA,RAPD)分析技術(shù)，擴增片段長度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphisms,AFLP)分析技術(shù),簡單重復(fù)序列(Simple sequence repeat, SSR)分析技術(shù),單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism, SNP)分析技術(shù),在 RAPD 和 RFLP 技術(shù)基礎(chǔ)上建立了序列特異性擴增區(qū)域(Sequence characterized amplified regions, SCAR)、酶切擴增多態(tài)序列(Cleaved amplified polymorphic sequence,CAPS)和DNA擴增指紋(DNA amplifiedfingerprints, DAF)等分析技術(shù)。其中Moore等于1991年結(jié)合PCR技術(shù)創(chuàng)立了 SSR標(biāo)記技術(shù)，SSR也稱微衛(wèi)星DNA，是一類由幾個(多為I~6個)堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，其中最常見的是雙核苷酸重復(fù)，每個微衛(wèi)星DNA的核心序列結(jié)構(gòu)相同，重復(fù)單位數(shù)目10~60個，其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同。不同遺傳材料重復(fù)次數(shù)不同，導(dǎo)致了 SSR長度的高度變異性，這一變異性正是SSR標(biāo)記產(chǎn)生的基礎(chǔ)。與其他分子標(biāo)記技術(shù)相比，SSR具有如下優(yōu)點:
[0004]1.SSR引物是根據(jù)微衛(wèi)星重復(fù)序列兩端的特定短序列設(shè)計的，具有很強的特異性；
[0005]2.SSR序列在群體中通常具有很高的多態(tài)性，而且一般為共顯性；
[0006]3.SSR重復(fù)性和穩(wěn)定性好。
[0007]毛細(xì)管電泳(Capillary Electrophoresis,CE)具有快速、靈敏、分辨率高等優(yōu)點。CE可以滿足SSR分析對擴增產(chǎn)物高分辨率的要求，分辨率可達(dá)lbp，精確展現(xiàn)擴增結(jié)果的多態(tài)性；CE分析得到的電泳峰可以精確的定位PCR擴增產(chǎn)物遷移的位置，即PCR擴增產(chǎn)物的大??；CE分析得到的電泳峰的峰高和峰面積可以精確的反應(yīng)PCR擴增產(chǎn)物的量。
[0008]近年來，Cordeiro,G.M., Pan, Y.B., Henry, R.J.(2003).Sugarcanemicrosatellites for the assessment of genetic diversity in sugarcane germplasm.Plant Science, 165 (I)，181-189、梁俊，PAN Yong-Baoj 李楊瑞，方鋒學(xué).(2010).利用 SSR標(biāo)記與毛細(xì)管電泳對甘蔗屬進(jìn)行的遺傳分析.廣西植物，30 (I): 106-111，Qi，Y.1，Pan, Y.B.，Laoj F.Y.，Zhang, C.Μ.，F(xiàn)an, L.N.，He，H.Y.，Liuj R.，Wang, Q.N.，Liuj S.M.，Liuj F.Y., Li, Q.W., Deng,Η.H.(2012).Genetic Structure and Diversity of ParentalCultivars Involved in China Mainland Sugarcane Breeding Programs as Inferredfrom DNA Microsatellites.Journal of Integrative Agriculture，11(11)，1794-1803 ;You, Q., Xuj L., Zheng, Y., Quej Y.(2013).Genetic Diversity Analysis of SugarcaneParents in Chinese Breeding Programmes Using gSSR Markers.The Scientific WorldJournal, 2013.等利用SSR分子標(biāo)記結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)開展甘蔗種質(zhì)資源遺傳多樣性等方面的研究。同時，在甘鹿DNA指紋圖譜研究方面澳大利亞Piperidis, G.，Rattey, A.R., Taylor, G.0., Cox, M.C., (2004).DNA markers: A tool for identifying sugarcanevarieties.Austral Sugarcane, 8(suppl):1-8 ; 美國 Pan, Y.B.(2010).Databasingmolecular identities of sugarcane(Saccharum spp.) clones constructed withmicrosatellite (SSR)DNA markers.American Journal of Plant Sciences, I(2), 87-94.等研究者使用SSR分子標(biāo)記結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)建立了各自的甘蔗分子身份證數(shù)據(jù)庫。但是，不管是利用毛細(xì)管電泳開展甘蔗種質(zhì)資源遺研究或者DNA指紋圖譜方面的研究，所有的這些研究都是利用毛細(xì)管電泳峰的有無即數(shù)字化后的1、0數(shù)據(jù)進(jìn)行分析研究，都沒有涉及到毛細(xì)管電泳峰特征數(shù)據(jù)的利用，而本發(fā)明則是基于毛細(xì)管電泳峰的特征數(shù)據(jù)的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是提供一種可用于甘蔗品種資源鑒別的基于毛細(xì)管電泳技術(shù)的DNA指紋圖譜構(gòu)建方法及鑒定方法。
[0010]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案達(dá)到上述目的:一種甘蔗毛細(xì)管電泳DNA指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，包括下述步驟:
[0011]I)甘蔗DNA提取:按CT AB、SDS或者DNA提取試劑盒等方法提取甘蔗DNA ；
[0012]2)甘蔗DNA的PCR擴增:以提取的甘蔗DNA為模板進(jìn)行PCR擴增，采用的引物為SSR引物；
[0013]3) PCR擴增產(chǎn)物的分析:采用毛細(xì)管電泳分析PCR擴增產(chǎn)物，記錄毛細(xì)管電泳圖譜；
[0014]4)毛細(xì)管電泳圖譜有效特征數(shù)據(jù)采集，包括對應(yīng)PCR擴增產(chǎn)物的大小的電泳峰的位置、電泳峰的高度、電泳峰的面積；
[0015]5)毛細(xì)管電泳圖譜有效特征數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化，將電泳峰高度最高或者電泳峰面積最大的電泳峰的特征數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為1，其余電泳峰則通過其電泳峰高度與最高電泳峰的比值或者電泳峰面積與最大電泳峰的比值來標(biāo)準(zhǔn)化；
[0016]6)利用對應(yīng)PCR擴增產(chǎn)物的大小的電泳峰的位置及其對應(yīng)的電泳峰特征數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化值構(gòu)建甘蔗DNA指紋圖譜。
[0017]一種甘蔗毛細(xì)管電泳DNA指紋的鑒定方法，包括下述步驟:
[0018]I)甘蔗樣品DNA提取:按CTAB、SDS或者DNA提取試劑盒等方法提取甘蔗DNA ；[0019]2)甘蔗樣品DNA的PCR擴增:以提取的甘蔗DNA為模板進(jìn)行PCR擴增，采用的引物為SSR引物；
[0020]3) PCR擴增產(chǎn)物的分析:采用毛細(xì)管電泳分析PCR擴增產(chǎn)物，記錄毛細(xì)管電泳圖譜；
[0021]4)甘蔗樣品毛細(xì)管電泳DNA指紋圖譜的建立:以上述構(gòu)建甘蔗毛細(xì)管電泳DNA指紋圖譜的構(gòu)建方法建立甘蔗樣品的DNA指紋圖譜；
[0022]5)甘蔗樣 品鑒定:利用相關(guān)分析算法比較樣品DNA指紋圖譜與甘蔗DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫中DNA指紋圖譜的相關(guān)性，根據(jù)相關(guān)系數(shù)對甘蔗樣品DNA進(jìn)行鑒定。
[0023]所述甘蔗DNA指紋圖譜為甘蔗屬甘蔗雜交品種或者種質(zhì)資源DNA指紋圖譜。
[0024]所述的甘鹿DNA的PCR擴增采用的引物為SSR(simple sequence repeat,簡單序列重復(fù),也稱微衛(wèi)星)引物。
[0025]本發(fā)明的突出優(yōu)點在于:
[0026]利用SSR分子標(biāo)記結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)構(gòu)建甘蔗DNA指紋圖譜，克服了傳統(tǒng)瓊脂糖凝膠或者聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨率低、靈敏度低、精確度低、結(jié)果分析困難等缺點；
[0027]利用毛細(xì)管電泳峰的特征數(shù)據(jù)來構(gòu)建DNA指紋圖譜，比常規(guī)應(yīng)用電泳條帶的有無(數(shù)字化為1、0數(shù)據(jù))等數(shù)據(jù)帶有更多的信息量；應(yīng)用相關(guān)分析算法對待鑒定樣品進(jìn)行鑒定分析，充分反映DNA指紋圖譜的特征，結(jié)果客觀、準(zhǔn)確。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]附圖1為甘蔗SSR分子標(biāo)記毛細(xì)管電泳圖譜及電泳峰特征值。
[0029]圖中橫坐標(biāo)為PCR擴增產(chǎn)物的大小，縱坐標(biāo)為電泳峰高度；電泳峰頂端顯示數(shù)值，上為電泳峰高度值，下為電泳峰面積。
[0030]附圖2為續(xù)甘蔗SSR分子標(biāo)記毛細(xì)管電泳圖譜及電泳峰特征值。
[0031]圖中橫坐標(biāo)為PCR擴增產(chǎn)物的大小，縱坐標(biāo)為電泳峰高度；電泳峰頂端顯示數(shù)值，上為電泳峰高度值，下為電泳峰面積。
【具體實施方式】
[0032]以下結(jié)合實施案例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說明。
[0033]實施例1
[0034]本發(fā)明所述的甘蔗毛細(xì)管電泳DNA指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0035]1.甘蔗DNA提取
[0036]將甘蔗葉片在液氮中磨成粉末后，將0.1g的甘蔗葉粉末轉(zhuǎn)移到2mL離心管中，加入500μ L65°C預(yù)熱的2XCTAB緩沖液，然后于65°C溫育30min，中間搖動4_5次，取出離心管冷卻后，加入500 μ L氯仿:異戊醇按24:1混合均勻，然后在12000rpm、室溫、離心lOmin，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中，加入2/3體積的異丙醇，混勻，_20°C靜置I小時；4°C下1000Orpm離心5min,去上清；加入500 μ L76%乙醇洗漆沉淀2次,室溫晾干,加入100 μ LTE buffer 溶解 DNA，_20°C保存。
[0037]2.PCR 擴增
[0038]以甘蔗DNA為模板進(jìn)行PCR擴增，本實施案例中使用的SSR引物為SMC1604SA，熒光標(biāo)記為FAM，引物序列為:
[0039]SMC1604SA-F (5’_3， ) =FAM-AGG GAA AAG GTA GCC TTG G
[0040]SMC1604SA-R (5’_3，):TTC CAA CAG ACT TGG GTG G
[0041]PCR 反應(yīng)體系為 20 μ L，其中 50ng DNA 模板 I μ L, I XPCR Buffer2 μ L, 3mmolMg2+0.6 μ L，2mmol/each dNTP2 μ L，10 μ mo I SMC1604SA-F 和 SMC1604SA-R 引物各 0.5 μ L,5U/ μ L Taq 酶 0.2 μ L，ddH2013.2 μ L。
[0042]PCR 反應(yīng)程序為:95°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s，59°C退火 60s，72°C延伸 60s，35個循環(huán)；72°C延伸IOmin ;4°C保存。
[0043]3.PCR產(chǎn)物毛細(xì)管電泳分析
[0044]毛細(xì)管電泳儀器為ABI公司PRISM3730測序儀，樣品上樣處理參照儀器說明要求，毛細(xì)管電泳進(jìn)樣電壓為_15kV，進(jìn)樣時間為40s，分離電壓為_15kV，溫度控制為25°C。
[0045]4.甘蔗毛細(xì)管電泳DNA指紋圖譜的建立
[0046]根據(jù)步驟3得到的毛細(xì)管電泳圖譜，挑選符合SSR引物設(shè)計目標(biāo)產(chǎn)物大小和重復(fù)單位特征的電泳峰，進(jìn)行毛細(xì)管電泳圖譜有效特征數(shù)據(jù)采集，包括對應(yīng)PCR擴增產(chǎn)物的大小的電泳峰的位置、電泳峰的高度、電泳峰的面積；然后進(jìn)行毛細(xì)管電泳圖譜有效特征數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化，將電泳峰高度最高或者電泳峰面積最大的電泳峰的特征數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為I，其余電泳峰則通過其電泳峰高度與最高電泳峰的比值或者電泳峰面積與最大電泳峰的比值來標(biāo)準(zhǔn)化；最后利用對應(yīng)PCR擴增產(chǎn)物的大小的電泳峰的位置及其對應(yīng)的電泳峰特征數(shù)據(jù)構(gòu)建甘蔗DNA指紋圖譜。如圖1，圖2，表1，表2所示。
[0047]實施例2
[0048]將本發(fā)明的甘蔗毛細(xì)管電泳DNA指紋圖譜用于某個甘蔗樣品的鑒定
[0049]甘蔗品種資源毛細(xì)管電泳DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫建立以后，要對某個樣品進(jìn)行鑒定時，首先提取其DNA，并作為DNA模板進(jìn)行PCR擴增，使用的SSR引物與建立甘蔗品種資源毛細(xì)管電泳DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫的引物一致，PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析，將毛細(xì)管電泳峰特征數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，應(yīng)用相關(guān)分析方法將待測樣品與數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，根據(jù)相關(guān)系數(shù)對待測樣品進(jìn)行鑒定。
[0050]鑒定結(jié)果:若待測樣品與中數(shù)據(jù)庫中某個甘蔗品種資源的的相關(guān)系數(shù)3 99%，則可以確定該待測樣品身份；若待測樣品與數(shù)據(jù)庫中所有甘蔗品種資源的的相關(guān)系數(shù)都小于95%，則可以確定該待測樣品為一個新材料，可以追加到數(shù)據(jù)庫中；若待測樣品與數(shù)據(jù)庫中所有甘蔗品種資源的的相關(guān)系數(shù)在95-99%之間，則需要通過人工輔助判定。
[0051]在實施案例I中甘蔗材料桂糖97-40和P0J2931之間如果通過電泳峰的有無，即
1、0數(shù)據(jù)來比較則結(jié)果為兩者100%—致，但是如果應(yīng)用本發(fā)明的鑒定方法通過兩種電泳峰標(biāo)準(zhǔn)化特征值的相關(guān)系數(shù)來判斷則發(fā)現(xiàn)兩者之間的相關(guān)系數(shù)為r=0.8767，根據(jù)鑒定標(biāo)準(zhǔn)則可以將兩者區(qū)分開來。
[0052]表1為甘蔗毛細(xì)管電泳DNA指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰特征原始數(shù)據(jù)。
[0053]表2為甘蔗毛細(xì)管電泳DNA指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰特征標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。
[0054]
【權(quán)利要求】
1.一種甘蔗毛細(xì)管電泳DNA指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，包括下述步驟: O甘蔗DNA提取:按CTAB、SDS或者DNA提取試劑盒的方法提取甘蔗DNA ； 2 )甘蔗DNA的PCR擴增:以提取的甘蔗DNA為模板進(jìn)行PCR擴增，采用的引物為SSR引物； 3)PCR擴增產(chǎn)物的分析:采用毛細(xì)管電泳分析PCR擴增產(chǎn)物，記錄毛細(xì)管電泳圖譜； 4)毛細(xì)管電泳圖譜有效特征數(shù)據(jù)采集，包括對應(yīng)PCR擴增產(chǎn)物的大小的電泳峰的位置、電泳峰的高度、電泳峰的面積； 5)毛細(xì)管電泳圖譜有效特征數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化，將電泳峰高度最高或者電泳峰面積最大的電泳峰的特征數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為1，其余電泳峰則通過其電泳峰高度與最高電泳峰的比值或者電泳峰面積與最大電泳峰的比值來標(biāo)準(zhǔn)化； 6)利用對應(yīng)PCR擴增產(chǎn)物的大小的電泳峰的位置及其對應(yīng)的電泳峰特征數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化值構(gòu)建甘蔗DNA指紋圖譜。
2.一種甘蔗毛細(xì)管電泳DNA指紋的鑒定方法，其特征在于，包括下述步驟: O甘蔗樣品DNA提取:按CTAB、SDS或者DNA提取試劑盒的方法提取甘蔗DNA ； 2)甘蔗樣品DNA的PCR擴增:以提取的甘蔗DNA為模板進(jìn)行PCR擴增，采用的引物為SSR引物； 3)PCR擴增產(chǎn)物的分析:采用毛細(xì)管電泳分析PCR擴增產(chǎn)物，記錄毛細(xì)管電泳圖譜； 4)甘蔗樣品毛細(xì)管電泳DNA指紋圖譜的建立:以所述構(gòu)建甘蔗毛細(xì)管電泳DNA指紋圖譜的構(gòu)建方法建立甘蔗樣品的DNA指紋圖譜； 5)甘蔗樣品鑒定:利用相關(guān)分析算法比較樣品DNA指紋圖譜與甘蔗DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫中DNA指紋圖譜的相關(guān)性，根據(jù)相關(guān)系數(shù)對甘蔗樣品DNA進(jìn)行鑒定。
3.如權(quán)利要求1所述的甘蔗毛細(xì)管電泳DNA指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，所述甘蔗DNA指紋圖譜為甘蔗屬甘蔗雜交品種或者種質(zhì)資源DNA指紋圖譜。
【文檔編號】C12Q1/68GK103540678SQ201310540631
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月5日
【發(fā)明者】周會, 潘永保, 李楊瑞, 楊榮仲 申請人:廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所